Vrednotenje izpostavljenosti dušiku iz amoniaka v imunski obrambi, prisotni na vranici in glavi ledvice Wuchang Bream (Megalobrama Amblycephala)
Nov 13, 2023
Povzetek:Amoniak je eden najpomembnejših okoljskih dejavnikov v vodnih ekosistemih. Vendar pa obstajajo omejene študije o učinkih kroničnega ali dolgotrajnega stresa z amoniakom in njegovem potencialnem molekularnem mehanizmu pri ribah. Ta študija je bila namenjena raziskovanju imunskega odziva in molekularnih mehanizmov v vranici in glavi in ledvicah rib po kronični izpostavljenosti amoniaku.Megalobrama amblycephala(9.98 ± {{0}}.48 g) je bilo 30 dni izpostavljeno različnim koncentracijam celotnega amonijevega dušika (0–30 mg/L). Izpostavljenost amoniaku je povzročila znatno zvišanje ravni kortizola in zmanjšanje koncentracije lizocima in komplementa 3/4 v serumu, kar kaže na zaviralne učinke stresa z amoniakom na prirojene imunske odzive. Izpostavljenost amoniaku je povzročila tudi od koncentracije odvisna povečanja koncentracij amoniaka v tkivu, patološke poškodbe in indekse vranice in glave-ledvice. Dodatno vsebnost imunoglobulina M (IgM), interlevkina 1 (IL-1 ) in faktor tumorske nekroze (TNF- ) kot tudi nivoji mRNA toll-like receptorjev (TLR)/mieloidnega diferenciacijskega faktorja 88 (MyD88) neodvisnih signalnih molekul v vranici in glavici ledvic so bile po izpostavljenosti amoniaku znatno znižane. Naše ugotovitve so pokazale, da je kronična izpostavljenost amoniaku povzročila zatiranje prirojenih in adaptivnih imunskih odzivov z znižano regulacijo TLR/MyD88-neodvisnega signaliziranja. Škodljivi vplivi kroničnega stresa z amoniakom so bili hujši v vranici kot v glavi ledvic.
Ključne besede: amoniak; stres; toll-like receptorji; vranica; glava-ledvica; imunost
KLIKNITE TUKAJ ZA DOBITEV ZELIŠČNE CISTANCHE ZA LEVGICE
1. Uvod
Ammonia is one of the most important environmental factors in aquatic ecosystems that affect the growth and health of aquatic animals [1]. Ammonia nitrogen generally comes in one of two ionized forms—NH4 + and the un-ionized form, NH3, in the aquatic environment. NH3 is extremely toxic to fish by reason of its ability to diffuse across cell membranes easily [2–4]. Over the past decades, high levels of ammonia frequently occur in aquatic environments due to disorderly discharges of sewage effluent, agricultural run-off, and high-density aquaculture [5–7]. Although the recommended level of ammonia nitrogen in drinking water is up to 3 mg/L (NH4/L) [8], the real ammonia level can reach much higher (>20 mg/L) včasih zaradi neučinkovitega ali neobstoječega čiščenja odplak ali drugih razlogov [9,10].
Dokazano je, da imunosupresivni učinki amoniaka pri ribah prispevajo k izbruhom bolezni [11,12]. V nekaterih študijah o Takifugu rubripes, Scophthalmus maximus in Pelteobagrus fulvidraco bi lahko akutna izpostavljenost amoniaku povečala ravni genske ekspresije faktorja aktivacije celic B, proteina toplotnega šoka 70/90, tnf- in interlevkina- 1/1 /6/ 8/12 [13–15]. Wang et al. tudi poročali, da so se aktivnosti serumskega lizocima znatno zmanjšale pri Acanthopagrus schlegelii po 24 urah izpostavljenosti amoniaku [16]. Podobno so opazili znižane ravni mRNA komplementa C3 in IgM v vranici Pelteobagrus vachellii in Rhynchocypris lagowski pri akutni izpostavljenosti amoniaku [17,18]. Čeprav je bilo veliko pozornosti namenjene učinkom akutne izpostavljenosti amoniaku na imunost rib, obstajajo le omejene študije o učinkih kroničnega ali dolgotrajnega stresa z amoniakom in njegovem potencialnem molekularnem mehanizmu. Poleg tega so nekateri preiskovalci poročali o škodljivih učinkih amonijevega dušika na izražanje mRNA TLR s transkripcijsko analizo [16, 19–22]. Posledično domnevamo, da bi lahko vztrajna izpostavljenost amoniaku vplivala tudi na imunost rib, pri čemer bi lahko imela signalna pot TLR pomembno vlogo.
Vranica in glava ledvice sta glavna imunska organa pri kostnicah, ki sta odgovorna za lovljenje in čiščenje tujih delcev ter vzdrževanje stabilnega notranjega okolja [23, 24]. So tudi glavna mesta, kjer se proizvajajo imunska protitelesa [25–27]. Poleg tega je pri ribah prirojeni imunski sistem sestavljen iz fiksnih in mobilnih celic ter širokega nabora obrambnih molekul (kot so lizocim, komplement in citokini) [28, 29]. Orada Wuchang (Megalobrama amblycephala) je ciprinidna riba, ki izvira iz porečja Jangce na Kitajskem, ki je bila leta 2014 uvrščena na 11. mesto v skupni letni proizvodnji te ribe [30]. Kot glavna ribogojna vrsta je M. amblycephala razmeroma občutljiva vrsta na amonijakov dušik in pogosto trpi zaradi stresa, ki ga povzroča amonijakov dušik [31–33]. V luči zgoraj navedenega je bil izveden poskus kronične izpostavljenosti pri oradi Wuchang, da bi razjasnili značilnosti imunskih odzivov po kronični izpostavljenosti amoniaku in mehanizem za temi učinki z odkrivanjem sprememb v serumskih imunskih parametrih, histologiji in molekulah, povezanih s potjo TLR v vranici in glavi-ledvica. Naši rezultati prav tako prispevajo k spremljanju zdravstvenega stanja in dobrega počutja M. amblycephala v intenzivnih ribogojnih sistemih.
2. Rezultati
2.1. Vsebnost amoniaka v vranici in glavi ledvic
Slika 1 prikazuje vsebnost amoniaka v vranici in glavi ledvice M. amblycephala po 30 dneh izpostavljenosti različnim količinam amoniaka. V vranici rib, ki so bile izpostavljene 30 mg/L skupnega dušika v amoniaku, so opazili znatno povečanje ravni amoniaka v primerjavi s kontrolno skupino (p < 0,05). Med vsemi skupinami, zdravljenimi z amoniakom, in kontrolno skupino ni bilo statistične razlike v ravni amoniaka v glavni ledvici (p > 0,05).
Slika 1. Učinki kronične izpostavljenosti amoniaku na kopičenje amoniaka v vranici in glavi ledvice M. amblycephala. Vsak stolpec predstavlja povprečje ± SE šestih dvojnikov. Vrednosti p < 0.05 so predstavljene kot "*" nad stolpcem, kar kaže na pomembne razlike v primerjavi s kontrolo.
2.2. Serumske ravni kortizola, lizocima, C3 in C4
Kot je prikazano na sliki 2, so se ravni serumskega kortizola znatno povečale v vseh skupinah, zdravljenih z amoniakom, v primerjavi s kontrolno skupino (p < 0.05). Nasprotno pa so bile aktivnosti serumskega lizocima znatno zmanjšane pri ribah, ki so bile izpostavljene višjim koncentracijam amoniaka (20 in 30 mg/L skupnega dušika v amoniaku) (p <0,05). Ravni komplementa C3 in C4 v serumu so bile značilno znižane v skupinah, ki so bile zdravljene z 10 do 30 mg/L celotnega dušika v amoniaku (p < 0,01).
Slika 2. Učinki kronične izpostavljenosti amoniaku na ravni serumskega kortizola, lizocima, C3 in C4(AD) pri M. amblycephala. Vsak stolpec predstavlja povprečje + SE šestih dvojnikov. Vrednosti p < 0.05 in 0.0l sta predstavljeni kot "" in "" nad stolpcem, kar kaže na pomembne razlike v primerjavi s kontrolo.
2.3. Indeksi organov imunosti
Indeks vranica in glava-ledvica sta se povečala s povečanjem skupne koncentracije dušika v amoniaku po izpostavljenosti (slika 3). V primerjavi s kontrolno skupino je bil vranični indeks pomembno povišan pri ribah, zdravljenih z višjo vsebnostjo skupnega dušika v amoniaku (20 in 30 mg/L) (p < 0,05). Med vsemi skupinami, zdravljenimi z amoniakom, in kontrolno skupino niso zaznali pomembne razlike v indeksu glava-ledvica (p > 0,05).
Slika 3. Učinki kronične izpostavljenosti amoniaku na indekse vranice (A) in glave in ledvic (B) pri Mamblycephala. Vrednosti so izražene kot najmanjše do največje (n=18). Vrednosti p < 0.05 in 0,01 sta predstavljeni kot "" in "u" nad stolpcem, kar kaže na pomembne razlike v primerjavi s kontrolo.
2.4. Patološka ocena
Vranica orade Wuchang v kontrolni skupini je bila normalnega videza z obilnimi eritrociti in levkociti (slika 4A). Po 30-dnevni izpostavljenosti amoniaku so opazili rahlo povečanje števila eritrocitov skupaj s pojavom melano-makrofagnih centrov v vranici rib, ki so bile izpostavljene 5 mg/L skupnega dušika v amoniaku (slika 4B, tabela 1). Podobne, a resnejše spremembe so opazili pri ribah, zdravljenih z 10 do 30 mg/L skupnega amonijevega dušika, kot so povečanje števila in velikosti melanomsko-makrofagnih centrov ter izrazito povečano število eritrocitov (slika 4C,D). Poleg tega so vakuolizacijo citoplazme odkrili tudi v vranici rib, ki so bile izpostavljene 30 mg/L skupnega dušika v amoniaku (slika 4E, tabela 1).
Slika 5A prikazuje normalno strukturo tkiva glave in ledvic pri kontrolnih ribah po izpostavitvi. V glavi in ledvicah rib, ki so bile izpostavljene nižji skupni dušik v amonijaku (5 mg/l), niso opazili očitnih patoloških znakov (slika 5B, tabela 1). Pri ribah, ki so bile izpostavljene 10 in 20 mg/l skupnega amonijevega dušika, so opazili rahlo povečanje števila centrov melanoma in makrofagov (slika 5C, D, tabela 1). Velikost in število centrov melanoma-makrofagov sta se povečala v skupini s 30 mg/L skupnega dušika v amoniaku (slika 5E, tabela 1).
2.5. Analiza parametrov tkivne imunosti
Ravni prirojenih imunskih parametrov (TNF-, IL-1) in pridobljenih imunskih parametrov (IgM) v vranici in glavi ledvic so se zmanjšale skupaj s povečanjem ravni izpostavljenosti amoniaku (slika 6, dodatna tabela S1). V vranici so se vsebnosti in ravni mRNA TNF- in IgM znatno zmanjšale v vseh skupinah, zdravljenih z amoniakom, v primerjavi s kontrolami (p < 0.{{10}}5). Medtem so bile vsebnost vraničnega IL-1 in ravni ekspresije mRNA znatno znižane pri ribah, ki so bile izpostavljene več kot 20 mg/L skupnega dušika v amoniaku (p < 0,05). Nasprotno pa sta bili le vsebnost in raven mRNA IL-1 kot tudi raven izražanja tnf- v glavni ledvici izrazito zmanjšani v skupinah, zdravljenih z amoniakom, glede na kontrole (p < 0,05). Med skupinami, ki so prejemale amoniak, in kontrolno skupino ni bilo pomembnih razlik v ravneh proteina IgM in ekspresije genov ter koncentracije TNF- v glavni ledvici (p > 0,05).
Slika 6. Relativne ravni mRNA genov signalne poti TLR ter vsebnosti TNF-, IL- 1 in IgM v vranici in glavi-ledvici M. amblycephala. Vrednosti, izražene kot srednje vrednosti ± SE šestih dvojnikov. igm: imunoglobulin M, il-1: interlevkin 1, tnf-: faktor tumorske nekroze, jnk1: c-Jun N terminalna kinaza1, erk1: zunajcelično regulirana protein kinaza 1, p38: mitogen aktivirana protein kinaza p38, nf-κb1 /2: vezava jedrnega faktorja-κ-gena 1/2, pi3 k: fosfatidilinozitol 3-kinaza, akt: protein kinaza B, myd88: faktor mieloidne diferenciacije 88, traf6: faktor 6, povezan z receptorjem faktorja tumorske nekroze, tlr1 /2/3/4/5: toll-like receptor 1/2/3/4/5. Vrednosti p < 0.05 in 0,01 sta predstavljeni kot "*" in "**" nad stolpcem, kar kaže na pomembne razlike v primerjavi s kontrolo.
Za pojasnitev molekularnega mehanizma kronične toksičnosti amoniaka na imunski sistem so bile določene transkripcijske spremembe ključnih genov, ki sodelujejo pri signalni poti TLR, skupaj z ravnmi TNF-, IL-1 in IgM. V vranici so bile ravni mRNA genov za receptorje, podobne tollu (tlr2, tlr4), gen traf6, povezan z neodvisno potjo MyD88-, gen nf-κb2, povezan s signalno potjo NF-κB, in gen erk1, povezan s signalno potjo MAPK, znatno znižane -reguliran v skupinah, zdravljenih z amoniakom, v primerjavi s kontrolo (p < 0.05), medtem ko ni bilo opaznih sprememb v izražanju tlr1, tlr3, tlr5, pi3 k, akt, myd88 , nf-κb1, jnk1 in p38 a (p > 0.05). Podobno so bile ravni transkripcije tlr1, tlr2, tlr5, akt, traf6, nf-κb1, erk1 in jnk1 značilno rdeče brez bistvenih razlik v izražanju tlr3, tlr4, myd88, pi3 k, nf-κb2 in p38 v glavni ledvici med skupinami, zdravljenimi z amoniakom, in kontrolno skupino (p > 0,05).
2.6. Korelacijska analiza
Kot je prikazano na sliki 7 in v dodatni tabeli S2, je bila koncentracija amoniaka v značilni negativni korelaciji z vsebnostmi TNF-, IL-1 in IgM ter transkripcijskimi ravnmi tnf-, il-1, igm, tlr2, traf6, nf-кb2 in jnk1 v vranici. Medtem so vsebnost in ravni transkripcije vraničnega TNF-, IL-1 in IgM med seboj pokazale pomembne pozitivne korelacije (p < 0.05). Koncentracija IgM v vranici je pokazala pomembno pozitivno korelacijo s tlr2 in nf-кb2, TNF- in IL-1 pa sta pokazala pomembne pozitivne korelacije s tlr2, traf6 in nf-кb2 (p < 0.{{ 53}}5). Vendar so bile v glavni ledvici ravni izpostavljenosti amoniaku le izjemno negativno povezane z vsebnostjo IL-1 in izražanjem genov tnf-, il-1, tlr1/2/4/5, traf6, akt, nf-кb1, jnk1 in erk1 (p < 0,05). Glava-ledvica IL-1 je bila v pozitivni korelaciji z IgM, igm, il-1, tlr4, myd88, traf6, akt, nf-кb1, erk1 in jnk1, medtem ko sta IgM in TNF- kazala pozitivno korelacijo z p38 a oziroma tlr2 (p < 0,05).
Slika 7. Spearmanovi korelacijski koeficienti ® med koncentracijo izpostavljenosti amoniaku in imunskimi parametri, povezanimi s signalno potjo TLR v vranici in glavici ledvic M. amblycephala po kronični izpostavljenosti amoniaku. Vrednosti p < 0.05 in 0,01 sta predstavljeni kot "*" in "**" nad stolpcem, kar kaže na pomembne razlike v primerjavi s kontrolo, oz.
2.7. Indeksi IBR
Vrednosti IBR so bile izračunane iz standardiziranih podatkov 22 biomarkerjev v vranici in glavi in ledvicah orade Wuchang pri različnih ravneh amoniaka v okolju po 30-dnevni izpostavljenosti (tabela 2, slika 8). Ko so se koncentracije izpostavljenosti amoniaku povečevale, so se vrednosti IBR povečevale tako v vranici kot v glavi ledvice. Vrednosti IBR so bile višje v vranici
Podporna storitev Wecistanche-največjega izvoznika cistanche na Kitajskem:
E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/telefon:+86 15292862950
Trgovina za več podrobnosti o specifikacijah:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
