Vrednotenje antimelanogene aktivnosti in mehanizma galangina in Silico in in vivo

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

Ki Wung Chung, a Hyeong Oh Jeong, a Eun Kyeong Lee, a Su Jeong Kim, a Pusoon Chun, bHae Young Chung, *, a in Hyung Ryong Moon*, a

Nenormalna pigmentacija zaradi čezmerne sinteze melanina lahko povzroči resne težave, kot so pege, starostne pege in melanom. Zaviralci tirozinaze so bili zanimiva tarča za zdravljenje hiperpigmentacije, ker je tirozinaza encim, ki omejuje hitrost pri sintezi melanina. Preverjanje močnih zaviralcev tirozinaze je vodilo do odkritja flavonoidagalanin, ki je pokazal opazne zaviralne učinke na gobjo tirozinazo. Vrednost IC50 galanina (3,55±0,39 µM) je bila nižja od vrednosti kojične kisline (48,55±1,79 µM), ki je bila uporabljena kot pozitivna kontrola. Simulacija priklopa in mehanične študije in silico so pokazale, da je galanin medsebojno deloval s katalitičnimi mesti tirozinaze in tekmoval s tirozinom. V celicah melanoma B16F10, stimuliranih s hormonom, ki stimulira melanocite, je galanin zaviral aktivnost tirozinaze in proizvodnjo melanina. Čeprav visoki odmerkigalanincitotoksični, pri nizkih odmerkih niso opazili citotoksičnih učinkov. Poleg tega je bila in vivo učinkovitost galanina ovrednotena pri miših brez dlak z melaninom HRM2. Kot je bilo izmerjeno z indeksom beljenja kože in obarvanjem z melaninom, je ponavljajoča se izpostavljenost UVB povečala sintezo melanina v koži. Uporaba galangina je bistveno zmanjšala melanogenezo, povzročeno z izpostavljenostjo UVB. Skupaj naši podatki to kažejogalaninkaže močno inhibicijsko aktivnost tirozinaze, kar nakazuje, da je lahko učinkovito sredstvo za beljenje kože.

Ključne besedegalanin; melanogeneza; pigmentacija; tirozinaza

izvleček cistanche

Galangin, flavonoidna spojina, najdemo v visokih koncentracijah v Alpinia officinarum in Helichrysum. Prejšnje študije so pokazale, da ima galangin različne farmakološke aktivnosti, ščiti rastline pred UV-sevanjem, patogeni in rastlinojedci ter deluje protibakterijsko in protivirusno.2– 4) Ima pa tudi antioksidativne lastnosti, ki jih je mogoče pripisati njegovim blagodejnim učinkom. 5) Galangin deluje tudi proti raku z zaviranjem rasti rakavih celic. 6, 7)

Melanin je biološki pigment, ki ga najdemo v večini organizmov. V biologiji kože melanin nastane z oksidacijo aminokisline tirozin. V normalni fiziologiji melanin preprečuje poškodbe kože z absorpcijo škodljivega UV-sevanja.8) Sintetizirani melanin v kožnih melanocitih se porazdeli v keratinocite, kjer sodeluje predvsem pri zaščiti pred škodljivim UV-sevanjem.8) Kljub nekaterim prednostim pa čezmerni melanin lahko povzroči tudi estetske težave in kožne bolezni.9) Nenormalne pigmentacije, kot so pege, starostne pege, melazma in senilni lentigin, povzročajo resne težave normalni fiziologiji kože.10,11) Zato je modulacija melanogeneze pomembna strategija za zdravljenje prekomerne pigmentacije kože. V procesih melanogeneze sodeluje vrsta encimov. Med temi različnimi encimi je tirozinaza, ki katalizira oksidacijske procese L-tirozina v 3,4-dihidroksifenilalanin (L-DOPA) in L-DOPA v dopakinon, najpomembnejša.12) Ti procesi, ki jih posreduje tirozinaza, so procesi omejevanja hitrosti. V nenormalnih pogojih so zaznali hiperaktivacijo tirozinaze s povečano skupno proizvodnjo melanina.13) Tirozinaza je zaradi svoje ključne vloge pri melanogenezi privlačna tarča za sredstvo za depigmentacijo.14) Tako so različni zaviralci tirozinaze iz naravnih in sintetičnih viri so bili razviti. Številni zaviralci tirozinaze, vključno s hidroksikinonom, kojično kislino in arbutinom, so bili prej uporabljeni v medicinski in kozmetični industriji. Čeprav je bilo komercialno razvitih več inhibitorjev tirozinaze, so postali očitni citotoksični stranski učinki.12) Zato so potrebna učinkovita in varna sredstva za beljenje kože.

Namen te študije je bil z uporabo različnih eksperimentalnih metod opredeliti galangin kot močan zaviralec tirozinaze. Med iskanjem zaviralcev tirozinaze iz naravnih virov smo ugotovili, da galangin znatno zmanjša aktivnost tirozinaze z visoko močjo. Ker so o zaviralnih učinkih galanina na tirozinazo že poročali, smo se osredotočili na zaviralne mehanizme in moč v poskusih na celicah in živalih.1) Z uporabo različnih poskusov in silico, in vitro in in vivo so naši podatki pokazali, da je galangin lahko močno sredstvo za beljenje kože za zdravljenje pigmentacije kože.

koristi za zdravje cistanche tubolosa:beljenje kože

MATERIALI IN METODE

Materiali

Galangin, kojična kislina, gobja tirozinaza, L-tirozin, -melanocite stimulirajoči hormon (-MSH) in drugi kemični reagenti so bili kupljeni pri Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, ZDA).

Merjenje inhibitornega učinka tirozinaze in inhibitornega mehanizma v brezceličnem sistemu

Za ovrednotenje inhibitorne učinkovitosti in mehanizmov galangina na tirozinazo je bila uporabljena gobja tirozinaza, kot je opisano prej. Na kratko, 1000 enot gobje tirozinaze smo raztopili v 20 µL fiziološke raztopine s fosfatnim pufrom (PBS) in dodali k 170 µL testne mešanice, ki je vsebovala 1 mM L-tirozina, 50 mM fosfatnega pufra (pH 6,5) in 10 µL testni material. Zmes smo inkubirali pri sobni temperaturi (25 stopinj) 30 minut. Količino proizvedenega dopakroma smo izmerili spektrofotometrično pri 492 nm (OD492) v bralniku mikroplošč. IC50 je bil izračunan iz ponovitev poskusa pri različnih odmerkih galangina. Za določitev inhibitornega mehanizma galanina smo izvedli kinetični test tirozinaze. Za test inhibicije so bile uporabljene različne koncentracije L-tirozina (1, 2, 4 in 8 mM). Po pregledu je bila vsaka vrednost pretvorjena v svojo recipročno vrednost glede na ploskve Lineweaver–Burk. Rezultati so pokazali graf 1/V v primerjavi z 1/[S]. Za določitev inhibitornega mehanizma je bilo uporabljeno presečišče vsake ploskve.

Simulacija priklopa

Za simulacijo priklopa protein-ligand in silico smo uporabili AutoDock4.2. Dosežena je bila uspešna vezava med proteinom in ligandom. Tridimenzionalna (3D) struktura tirozinaze, uporabljena v kristalni strukturi, je bila iz Agaricus bisporus (PDB ID: 2Y9X) in vnaprej določeno mesto vezave tirozina je bilo uporabljeno kot priklopni žep.15) Simulacije priklopa so bile izvedene med tirozinazo in galanginom /kojična kislina. Spojine so bile pripravljene za simulacijo priklopa po naslednjih korakih: (1) 2D strukture so bile pretvorjene v 3D strukture; (2) izračunali smo naboje in (3) vodikove atome dodali s programom ChemOffice. Napoved možnih ostankov vodikove vezi med spojinami in tirozinazo ter generiranje farmakoforjev je izračunal LigandScout 3.0.

Sistem celične kulture

Celice mišjega melanoma B16F10, pridobljene iz ameriške zbirke tipskih kultur (Rockville, MD, ZDA), so bile najprej uporabljene za oceno učinkov galanina na inhibicijo tirozinaze. Celice smo gojili v Dulbeccovem modificiranem Eagleovem mediju (DMEM; WELGENE Inc., Koreja, LM001-05), dopolnjenem z 10-odstotnim fetalnim govejim serumom (FBS; WELGENE Inc., S101-01) in penicilinom/streptomicinom (100 ie/50 µg/ml; WELGENE Inc., LS202-02) pri 37 stopinjah v vlažnem ozračju, ki vsebuje 5 odstotkov CO2 v zraku. Za ovrednotenje učinkov galangina na viabilnost celic je bil opravljen test viabilnosti celic z uporabo komercialno dostopnega kompleta (EZ-1000, Dogen Bio, Koreja). Na kratko, celice smo gojili v 96-ploščah z vdolbinicami in obdelali z različnimi koncentracijami galangina. Po navedenem času smo absorbanco odčitali pri 450 nm z uporabo bralnika mikroplošč. Vsi celični poskusi so bili izvedeni vsaj trikrat, da se zagotovi ponovljivost.

Aktivnost tirozinaze

Aktivnost tirozinaze v celicah B16F10 smo preučevali z merjenjem hitrosti oksidacije L-DOPA. Celice smo nasadili v posode s 60 π vdolbinicami, inkubirali v prisotnosti ali odsotnosti 1 µM -MSH in nato 24 ur obdelali s 5 in 10 µM galanginom. Zdravljenje s kojično kislino je bilo uporabljeno kot pozitivna kontrola. Celice smo lizirali v 500 µL 50 mM natrijevega fosfatnega pufra (pH 6,8), ki je vseboval 25 µL 1-odstotnega Tritona X-100 in 25 µL 0,1 mM fenilmetilsulfonil fluorida in nato zamrznili pri –80 stopinjah 30 minut. Po odtajanju in mešanju smo celične lizate zbistrili s centrifugiranjem pri 12000 × g 30 minut pri 4 stopinjah. Supernatante (80 µL) smo dali v 96-ploščo z jamicami, dodali 20 µL L-DOPA (2 mg/mL) in odčitavali absorbanco pri 492 nm vsakih 10 minut 1 uro pri 37 stopinjah z uporabo čitalec plošč.

Izvleček Cistanche: zavira izražanje tirozinaze

Vsebnost melanina

V trenutni študiji je bila vsebnost melanina uporabljena kot indeks melanogeneze. Na kratko, celice B16 smo nasadili v 60π-posodo in inkubirali v prisotnosti ali odsotnosti 1 µM -MSH. Celice smo nato inkubirali 24 ur z ali brez galangina pri 5 in 10 µM. Zdravljenje s kojično kislino je bilo uporabljeno kot pozitivna kontrola. Po dveh izpiranjih s PBS so bili vzorci raztopljeni v 500 µL 1 NNaOH, inkubirani pri 60 stopinjah 1 uro in premešani, da se raztopi melanin. Absorbanco pri 405 nm smo izmerili z uporabo bralnika mikroplošč.

Poskusi In Vivo

Učinkovitost depigmentacije galangina in vivo so ocenili v poskusih na živalih. Študije na živalih je oblikovala Aging Tissue Bank, odobril jih je Odbor za institucionalno oskrbo živali Nacionalne univerze Pusan ​​in so bile izvedene v skladu s smernicami za poskuse na živalih, ki jih je izdala Nacionalna univerza Pusan. Šest tednov stare samce brezdlakih miši HRM2 z melaninom so pridobili iz laboratorija Hoshino Laboratory Animals (Yoshino, Saitama, Japonska) in jih nastanili v nadzorovanih pogojih (23±1 stopinja, 55 odstotkov ±5 odstotkov vlažnosti, 12-h svetloba /temni cikel) s prostim dostopom do vode in standardno laboratorijsko prehrano. Po 1 tednu aklimatizacije so miši naključno razdelili v štiri skupine po šest živali. Galangin (10 µM) in kojično kislino (50 µM) smo pripravili v raztopini, sestavljeni iz propilenglikola in etanola (3:7). Raztopljeno raztopino (200 µL) ali nosilec smo lokalno nanesli na hrbtno kožo živali enkrat na dan. Živali so bile obsevane z UVB iz naprave CROSSLINKER (BEX-800, Ultra-Lum Inc., CA, ZDA) pri 50 mJ/cm2 v skladu z urnikom poskusov na živalih. Barve kožnih mest so bile izmerjene s spektrofotometrom CR-10 (Konica Minolta Sensing, Inc., Sakai, Osaka, Japonska), v katerem so bile barve opisane z vrednostmi L*, a* in b* v skladu z barvnim sistemom Komisije International de L'Eclairage. Ko so bile živali žrtvovane, so bile kože zbrane, fiksirane v 4-odstotnem paraformaldehidu čez noč pri sobni temperaturi in obarvane na melanin z uporabo Fontana–Massonovega kompleta za barvanje American Master*Tech Scientific, Inc. (Lodi, CA, ZDA) v v skladu z navodili proizvajalca. Na kratko, narezane kože smo obarvali z raztopino amonijevega srebra 60 minut pri 60 stopinjah, inkubirali v 0,1-odstotnem zlatem kloridu in nato v 5-odstotnem natrijevem tiosulfatu.

Statistične analize

Za analizo razlik med dvema skupinama je bil uporabljen Studentov t-test, za analizo medskupinskih razlik pa ANOVA. Vrednosti p<0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" the="" analysis="" was="" performed="" using="" graphpad="" prism="" 5="" (graphpad="" software,="" la="" jolla,="" ca,="">

cistanche tubolosa

REZULTATI

In Silico Docking Simulacija galangina na tirozinazo

Galangin je naravno prisotna fitokemikalija in v svoji strukturi vsebuje flavonoidni del (slika 1). Sprva je bila izvedena simulacija priklopa med gobjo tirozinazo (terciarna struktura) in spojinami (galangin, kojična kislina in tirozin). Priključno mesto, na katerega sta bila vezana galangin in kojična kislina, je bilo predhodno določeno kot aktivno mesto tirozinaze.15) Ta simulacija je bila uspešna in dosežen je bil pomemben rezultat. Energija vezave med galanginom in tirozinazo je bila -7,67 kcal/mol, kot je bilo ugotovljeno z analizo z uporabo Autodock4.2. Energija vezave med tirozinazo in kojično kislino (pozitivna kontrola) je bila -4,09 kcal/mol in -5,13 kcal/mol med tirozinazo in prvotnim substratom, tirozinom (tabela 1). Ti rezultati so pokazali, da je galangin vezal tirozinazo z večjo afiniteto kot druge interakcije. Na podlagi rezultatov simulacije priklopa smo s programom LigandScout iskali interakcije med tirozinazo in spojinami. Ugotovili smo, da je galangin medsebojno deloval z ASN-260, VAL-283, ALA-286 in PHE-292, medtem ko je kojična kislina delovala le z ASN-260 in MET280 ( Slika 2, tabela 1). Te interakcije so torej lahko ključne determinante inhibitorne aktivnosti in pomembno vplivajo na rezultat priklopa.

Določanje antimelanogenih učinkov in mehanizmov v gobji tirozinazi

Na podlagi rezultatov in silicores in drugih predhodno objavljenih rezultatov smo ovrednotili antimelanogene učinke in mehanizme z uporabo gobje tirozinaze. Pri testiranju z gobjo tirozinazo v brezceličnem sistemu je bila zaviralna učinkovitost galangina močnejša od učinkovitosti kojične kisline (slika 3A). Poleg tega je galangin odvisno od odmerka zmanjšal aktivnost tirozinaze (slika 3B). Vrednosti IC50 galangina in kojične kisline so bile izračunane in so predstavljene v preglednici 2. Nizka vrednost IC50 galangina (3,55±0,39 µM) je pokazala, da je bila učinkovitost bistveno višja kot pri kojicu. kislina (48,55±1,79 µM). Zaviralni mehanizem galangina je bil nadalje ovrednoten z uporabo dvojnih recipročnih ploskev Lineweaver–Burk. Za test inhibicije so bile uporabljene različne koncentracije L-tirozina (1, 2, 4 in 8 mM) in galangina (0, 7,5 in 15 µM). Izmerjene so bile časovno odvisne spremembe absorbance in narisani so bili dvojno recipročni rezultati (slika 3C). Rezultati so pokazali, da je graf 1/V proti 1/[S] proizvedel tri različne črte z različnimi nakloni, ki so se sekale na isti navpični osi. Z večanjem koncentracije spojine se je povečala vrednost Km, vrednosti Vmax pa so ostale enake, kar je nakazovalo, da je galangin kompetitivni zaviralec vezave na tirozinazo. Ti podatki so se strinjali z rezultati in silico, da se galangin veže na aktivno mesto tirozinaze in ga zavira.

Slika 1. Strukture galangina, kojične kisline in tirozina

Vrednotenje depigmentacijske aktivnosti galangina v celicah mišjega melanoma B16F10

Nato smo ovrednotili depigmentacijsko aktivnost galangina z uporabo B16F10 mišjih melanomskih celic. Najprej so testirali citotoksične učinke galangina na celice mišjega melanoma B16F10. Kot je prikazano na sliki 4A, je galangin znatno zmanjšal viabilnost celic pri odmerkih nad 25 µM. Da bi se izognili citotoksičnosti, smo zato v poskusih za oceno antimelanogenih učinkov uporabili 5 µM in 10 µM galangina. Celice B16F10 smo obdelali z galanginom v prisotnosti 1 µM -MSH. Celotna sinteza melanina, ki jo je povzročilo zdravljenje z -MSH, je bila vidna s prostim očesom in je pokazala, da galangin močno zavira sintezo melanina, ki jo sproži -MSH (slika 4B). Zdravljenje z MSH ​​je znatno povečalo aktivnost tirozinaze in vsebnost melanina v celicah B16F10 (sliki 4C, D). Zdravljenje z galanginom je zaviralo celično melanogenezo, ki je bila povečana z -MSH na način, odvisen od odmerka (sliki 4C, D). Ti rezultati skupaj kažejo, da bi lahko bil galangin močno sredstvo za zatiranje melanogeneze z zaviranjem tirozinaze.

Tabela 1. Rezultati priklopa in glavni interaktivni ostanki spojin

Učinki galangina na pigmentacijo kože in vivo

Inhibitorni učinki galangina so bili nato raziskani pri miših brez dlake, ki so imele melanin in so bile zdravljene, kot je opisano v razporedu na sliki 5A. Barve kožnih mest so bile natančno izmerjene s spektrofotometrom. Izpostavljenost miši UVB je povzročila zmanjšanje vrednosti L*, ki je bila reprezentativna za pigmentacijo (slika 5B). UVB-inducirano zmanjšanje vrednosti L* je bilo znatno blokirano pri živalih, zdravljenih z galaninom, v primerjavi s tistimi pri kontrolnih živalih, zdravljenih z vehiklom, kar je pokazalo močno depigmentacijsko učinkovitost galanina (slika 5B). Vrednost ΔL* je tudi pokazala moč galangina v poskusnih obdobjih (slika 5C). Poleg tega so barve kože, zaznane s prostim očesom 14. dan, prav tako pokazale antimelanogeno moč galangina (slika 5D). Fontana–Massonovo barvanje, ki poudarja melanin, je potrdilo učinke galangina. Vzorci kože živali, obsevanih z UVB, so pokazali povečane melaninske lise (slika 5E). V skladu z numeričnimi podatki iz spektrofotometrije so živali, zdravljene z galaninom, pokazale zmanjšanje obarvanih melaninskih madežev v primerjavi s kontrolnimi živalmi, obsevanimi z UVB (slika 5E). Ti podatki skupaj kažejo, dagalaninje bil učinkovito časovno angiogeno sredstvo v modelu melanogeneze in vivo, ki ga povzroča UVB.

Slika 2. Rezultati simulacije priklopa in Silico med tirozinazo in kandidatnimi spojinami

DISKUSIJA

Prej so poročali, da ima galangin različne biološke učinke, vključno s citoprotekcijo. Čeprav je bila aktivnost galangina proti tirozinazi predhodno raziskana, mehanizmi in natančna učinkovitost v sistemih celične kulture niso bili popolnoma opisani.1,16) Zato smo želeli raziskati moč in zaviralne mehanizme galangina. Zaviralna učinkovitost galangina je bila prvotno ovrednotena z uporabo simulacije priklopa in silico. Simulacije priklopa so pokazale, da je bila vezava galangina na aktivno mesto tirozinaze stabilnejša od vezave prvotnega substrata (tirozina) ali kojične kisline (pozitivna kontrola). Zaviralno učinkovitost in mehanizme so potrdili tudi z gobjo tirozinazo. Končno je bila ovrednotena inhibitorna učinkovitost galangina proti melanogenezi v celicah mišjega melanoma B16F10, stimuliranih z -MSH. Če povzamemo, ta študija je opredelila galanin kot močno sredstvo.

Računalniška simulacija priklopa je bila uveljavljena kot močno orodje za pregledovanje in vrednotenje novih farmakoloških učinkovin.17) Rezultati simulacije priklopa zagotavljajo ne le vezavna mesta, ampak tudi vezavno afiniteto med spojino in encimom, ki zagotavlja začetne informacije brez potrebe po fizičnem poskusi.18) Čeprav napovedi niso vedno točne in zahtevajo nadaljnje poskuse, simulacija priklopa zmanjša potrebne materiale in vire ter lahko podpira tudi biološke eksperimentalne podatke. Naša računalniška simulacija priklopa je pokazala, da se lahko galangin močneje veže na tirozinazo kot tirozin ali kojična kislina. Poleg tega je bilo število interakcijskih ostankov med galanginom in tirozinazo večje v primerjavi s tirozinom ali kojično kislino. Začetne podatke o priklopu smo dodatno preverili z uporabo encimskega testa tirozinaze, ki je pokazal, da je IC50 galangina nižji od kojične kisline; tako so bili zaviralni učinki galangina na tirozinazo močnejši kot kojična kislina.

Zaviralni mehanizem galangina na tirozinazo je bil nadalje raziskan z uporabo gobje tirozinaze. Ker so podatki simulacije priklopa pokazali, da se galangin veže na isto aktivno mesto, na katerega se veže tirozinaza, je bilo pričakovano, da je lahko galangin konkurenčni zaviralec tirozinaze. Eksperimentalni rezultati so pokazali, da je galangin kompetitivno zaviral tirozinazo pri vezavi njenega prvotnega substrata, tirozina, kar je potrdilo rezultate simulacije priklopa. Skupaj so rezultati pokazali zanesljivost računalniške simulacije priklopa in njen potencial za presejalne inhibitorje.

Učinkovitost galangina so ovrednotili tudi na celicah mišjega melanoma B16F10. Galangin je pokazal pomembne citotoksične učinke v celicah B16F10, če so ga dajali v velikih odmerkih. To je bilo skladno s prejšnjimi poročili o delovanju galangina proti raku v več rakavih celičnih linijah.19,20) Zaradi citotoksičnih učinkov so poskusi za preverjanje antimelanogenih učinkov celic zahtevali skrbno izbiro pogojev. Vendar pa je bila vrednost IC50 galangina zelo nizka pri testiranju v brezceličnem sistemu, ki ni pokazal citotoksičnih učinkov. Dejansko je bila učinkovitost galangina za inhibicijo melanogeneze sprejemljiva pri nizkih odmerkih, ki niso imeli citotoksičnosti. Nizki odmerki galangina so učinkovito zmanjšali vsebnost melanina in aktivnost tirozinaze v sistemu celične kulture. Skupaj s sistemom brez celic,galanindokazano je, da ima močan zaviralni učinek na tirozinazo v sistemu celične kulture.

Končno je bil antimelanogeni učinek galangina ovrednoten z uporabo brezdlake miške HRM2. Model brezdlake miši HRM2 je zagotovil uporabno osnovo za poskuse melanogeneze in vivo, saj lahko miška proizvaja melanin, zlasti pod okoljskimi obremenitvami. 21, 22) V tem mišjem modelu je galangin pokazal pomemben antimelanogeni učinek na sintezo melanina, ki jo povzroča UVB. Kolikor vemo, je to prva študija, ki je pokazala antimelanogeno učinkovitost galangina z uporabo modela melanogeneze in vivo. Pomembno je ugotoviti učinkovitost in vivo, ker številni drugi zaviralci melanogeneze niso delovali in vivo zaradi nezmožnosti prehajanja skozi stratum corneum kože. V povzetku,galaninje bil in vivo identificiran kot močno živalsko angiogeno sredstvo. Ugotovili smo, da je zaviralec tirozinaze galangin nov kandidat za zdravilo za zdravljenje hiperpigmentacijskih motenj.

cistanche kapsule