Ekspresijski vzorec -tubulina, inversina in njegove tarče razmršenih-1 ter morfologija primarnih cilij pri normalnem razvoju in boleznih človeških ledvic

edmund.chen@wecistanche.com

Povzetek:Prostorsko-časovno izražanje -tubulina, inverzije in razmršenih-1 (DVL-1) proteinov, povezanih s signalno potjo Wnt, in morfologijo primarnih cilij smo analizirali pri razvojuledvice(14.–38. razvojni tedni), zdrav poporodni (1.5- in 7-let) in patološko spremenjen človekledvice,vključno z multicistično displastikoledvice(MCDK), žariščno segmentno glomerulosklerozo (FSGS) in nefrotski sindrom finskega tipa (CNF). Analiza je bila izvedena z dvojno imunofluorescenco, elektronsko mikroskopijo, semikvantitativno in statistično metodo. Citoplazmatsko ko-ekspresijo -tubulina, inverzijo in DVL-1 so opazili v proksimalnih zavitih tubulih (pct), distalnih zavitih tubulih (dct) in glomerulih (g) analiziranih tkiv. Medledvicarazvojem se je splošna ekspresija -tubulina, inverzija in DVL-1zmanjšala, medtem ko se je v postnatalnem obdobju nekoliko povečala. Najvišji izrazi -tubulina in inverzije so značilni za dct in g, medtem ko je za visok DVL-1 značilen pct. -tubulin, inverzija in vzorci izražanja DVL-1 v MCDK, FSGS in CNFledvicebistveno razlikovala od zdrave kontrole. V primerjavi z zdravimledvice, patološko spremenjenaledviceimel dismorfne primarne migetalke. Različna dinamika izražanja -tubulina, inverzije in DVL-1 medledvicarazvoj bi lahko pokazal, da je preklop med kanoničnim in nekanoničnim Wnt-signaliziranjem bistven za normalnoledvicamorfogeneza. V nasprotju s tem je njihovo moteno izražanje pri patološkihledvicelahko povezana z nenormalnimi primarnimi migetalkami, kar vodi v kroničnobolezni ledvic.

Ključne besede:razvoj človeških ledvic; -tubulin; inverzin; DVL-1; MCDK; FSGS; CNF; ledvični, ledvični

CISTANCHE BO IZBOLJŠAL LEVIČNE/LEDVIČNE BOLEZNI

Uvod 

Razvoj dokončnega ali metanefričnegaledvicese začne med petim gestacijskim tednom (GW), ki se nato nenehno diferencira in tvori stalne ledvice [1,2]. Signalne interakcije med metanefričnim mezenhimom in popkom sečnice zagotavljajo pravilnoledvicarazvoj med nefrogenezo. Na kratko, popek sečevodov inducira prehod iz mezenhima v epitel (MET) v metanefričnem mezenhimu, ki se kondenzira in tvoriledvičnamehurčki, ki jim sledijo telesca v obliki vejice in S, in končno vodi do tvorbe glomerulov [3]. V zameno mezenhim inducira nadaljnje razvejanje sečničnega popka. Metanefrične ledvice postanejo funkcionalne izločevalne enote v 11. tednu človekovega razvoja. Vendar pa je nefrogeneza končana v 34. do 36. tednu fetalnega razvoja, ko je več razvejanih dogodkov končano, vendar se nadaljnji proces diferenciacije ledvic nadaljuje v poporodnem obdobju [4, 5]. Motnje teh zapletenih interakcij povzročijo različne prirojene nepravilnosti ledvic in sečil (CAKUT), vključno z displazijo, policistično boleznijo ledvic, multicistično displastičnobolezni ledvic(MCDK), kar posledično vodi v kroničnobolezni ledvic(CKD) [6].

V tej študiji smo se osredotočili na primarni videz migetalk in Wnt-signalno pot, ki ima pomembno vlogo med normalno nefrogenezo inledvicaproces popravila po akutnem ali kroničnembolezni ledvic[7]. Obstoj primarnih migetalk med nefrogenezo in veliko število razvojnihledvicaokvare, ki se pojavijo pri bolnikih s ciliarno boleznijo, kažejo, da je pristna primarna funkcija cilij potrebna za normalnoledvicaorganogeneza [8,9]. Primarni cilij je organel na osnovi mikrotubulov, ki je pomemben za tkivno homeostazo, kjer je -tubulin osnovna komponenta [10]. Izguba acetilacije -tubulina v ovekovečenih celicah sproži prehod iz epitelija v mezenhim (EMT), kar pomeni, da je acetilirani -tubulin pomemben pri stabilizaciji mikrotubulov [11]. Med človeškim razvojem primarna pot Wnt, posredovana s cilijami, omogoča celično proliferacijo, diferenciacijo in morfogenezo tkiva [12]. Znatno število otrok z okvarjenim delovanjem primarnih cilij in moteno signalno potjo Wnt razvije kronično ledvično bolezen, kjer je prirojenaledvičnamotnje so odgovorne za skoraj polovico primerov [13]. Najpogostejša prirojena cistična bolezen pri otrocih je multicistična displastikabolezni ledvic(MCDK) [14]. Več cist, ki ne komunicirajo [15] in niso normalneledvičnaparenhima so značilni mikroskopski izvidi za MCDK. Fokalna segmentna glomeruloskleroza (FSGS) je ena najpogostejših glomerularnih bolezni, ki vodijo v končnobolezni ledvic[16]. Na začetku je značilno, da je FSGS žariščna, ki vključuje le manjši del glomerulov, in segmentna, ki vključuje spremembe le v segmentu glomerularnega kroga [17]. Kongenitalni nefrotski sindrom finskega tipa (CNF) je občasno avtosomno recesivno podedovanobolezni ledvicki ga predstavlja prenatalni izbruh obsežne izgube beljakovin [18], povezan s cistogenezo proksimalnih tubulov [19]. Mnoge oblike primarnih glomerulnih bolezni razvijejo proteinurijo kot posledico poškodovane glomerulne filtracijske pregrade [20]. Veliko študij nakazuje, da imata poškodba in disfunkcija podocitov intrinzično vlogo pri patogenezi proteinurije kronične ledvične bolezni [21]. Študija Vukojevića in sod. kaže povečano število ciliiranih in slabo diferenciranih podocitov v CNF [22]. Prejšnje študije so pokazale, da ima signalna pot Wnt/-katenin temeljno vlogo pri zmanjševanju disfunkcije podocitov s proteinurijo [23]. Obstajata dve glavni Wnt-signalni poti, ena je znana kot kanonična -katenin-odvisna in druga nekanonična -katenin-odvisna. Med miškoledvicarazvoja je kanonična Wnt-signalizacija aktivna na konicah popkov sečevodov in v telescih v obliki črke S [24]. Poleg tega je Wnt prek kanoničnega signaliziranja pomemben pri vzdrževanju MET med nefrogenezo [25]. Za aktivacijo poti Wnt je namreč obvezna vezava proteinskega kompleksa, ki vsebuje Dvl, na membranski receptor, onemogočanje ključnih komponent te poti pa povzroči zgodnjo perinatalno smrtnost zaradi odsotnosti nefrogene cone vledvica[25]. 

Ugotovljeno je bilo, da je protein, ki je ključen kot molekularni preklop med kanoničnimi in nekanoničnimi signalnimi potmi Wnt, inverzija [26]. Čeprav so bile zaznane interakcije različnih proteinov z inverzijo, njena natančna funkcija še ni povsem pojasnjena. Vledvičnaepitelijskih celicah se inverzija nahaja v primarnih migetalkah, ki delujejo kot ciliarni protein [27]. Poleg tega inverzija tvori stabilen kompleks s tubulinom v kulturahledvičnacelice in se kolokalizirajo in vivo [27,28]. Zdi se, da igra inverzija bistveno vlogo pri zgodnji morfogenezi pronefričnega sistema in določanju levo-desne simetrije med razvojem [29,30]. Pomemben dogodek za kanonične in nekanonične Wnt-signalne poti pri rekrutiranju citoplazemskega Dvl na celično membrano. Ker so prejšnje ugotovitve pokazale, da se inverzija in Dvl kolokalizirata v ledvičnih epitelijskih celicah, je mogoče špekulirati, da bi lahko imela inverzija tudi vlogo pri nekanoničnem signaliziranju. Disregulacija Wnt-signalizacije, posredovana z inverzijo, sproži nenormalno proliferacijo v tubulih [31]. Genetski testi so razkrili mutacijo DVL-1 pri bolnikih z avtosomno prevladujočim Robinowovim sindromom, kar predstavlja heterogene motnje pri nekaterih bolnikih, povezane z urogenitalnimi inledvičnaanomalije [32].

CISTANCHE BO IZBOLJŠAL DIALIZO LEDVIC/LEDVIC

Razvojni vzorec izražanja -tubulina, inverzije in DVL-1 je bil raziskan na različnih živalskih modelih. Tako je bilo njihovo izražanje v pronephrosu Xenopus laevis potrjeno z intravitalno mikroskopijo [31], medtem ko so jih našli v celičnih linijah, pridobljenih iz mišjih proksimalnih tubularnih celic z uporabo konfokalne mikroskopije in masne spektrometrije [33]. Poleg tega sta svetlobna mikroskopija in dvojna imunofluorescenca razkrili njihovo prisotnost v odsekih mišiledvice[34]. Študije na inverznih izločenih miših so poročale o povečanih, razpršenih cistah vledvičnamedule in skorje, povezanih s situsno visceralno inverzijo [35]. Pri ljudeh je bila mutacija inverzije predstavljena z infantilno nefronoftizo, ki je povzročila prekinitev nosečnosti [36]. Kljub številnim študijam oledvična-tubulina, inverzije in DVL-1 ekspresijskega vzorca in funkcije, kolikor nam je znano, ekspresijski vzorec teh proteinov v človeškem fetalnem in postnatalnem človeškem tkivu še ni bil raziskan in priveden do korelacije. Poleg tega ni bilo prijavljenih dokazov o izražanju inverzije in DVL-1 v zgodnjem človeškem razvoju. Zato je bila ta študija namenjena analizi prostorskega in časovnega vzorca izražanja -tubulina, inverzije in DVL-1 med fetalnim in postnatalnim obdobjem zdravega človekaledvice, kot tudi vledvicatkiva MCDK, FSGS in CNFledviceda bi ugotovili morebitno manjkajočo povezavo med temi entitetami. Namreč, predlagamo, da bi lahko bili moteni vzorci izražanja -tubulina, inverzije in DVL-1 proteinov osnovni proces cistogeneze in nenormalno delovanje primarnih migetalk, ki vodijo do kroničnegabolezni ledvic. 

Rezultati

Analiza razvojnega in poporodnegaledvicatkiv je bila izvedena na izrazito diferenciranih strukturahledvica:proksimalne zavite tubule (pct), distalne zavite tubule (dct) in glomerule (g). Med analiziranimi razvojnimi obdobji in v postnatalnem obdobjuledvicatkiva, -tubulin, inverzija in DVL-1 so pokazali pozitivne vzorce izražanja, vendar z razlikami v intenzivnosti, porazdelitvi in ​​količini. Analiza patološkegaledvičnega tkivaMCDK, FSGS in CNF je bila izvedena na celotnem slikovnem številu pozitivnih celic v primerjavi s kontrolo zdravega ledvičnega tkiva.

2.1. Svetlobna mikroskopija, elektronska mikroskopija in imunohistokemija (-Tubulin) zdravega in patološko spremenjenega poporodnega tkiva človeške ledvice

2.1.1. Zdrava poporodna svetloba ledvic

mikroskopija po poroduledvicatkivo kaže dobro definiranoledvicastrukture, z izrazito razliko med medulo in skorjo ter tvorbo pct, dct in g v kortikalni regiji. Imunohistokemično obarvanje -tubulina razkrije prisotnost ene primarne migetalke v središču apikalne celične površine vsake tubularne celice in v 0.018 % ± 0,00014 % SD na površini glomerularnih celic. Elektronska mikroskopija kaže prisotnost samo ene primarne migetalke, ki izhaja iz bazalnega telesa na površini apikalne celice tubula (slika 1a).

2.1.2. CNF

Večina analiziranih g je manjših in lobuliranih (80 odstotkov), medtem ko je manjšina normalne velikosti ali hipertrofičnih (20 odstotkov, n=100). Najdemo segmentno ali globalno sklerozo g, medtem ko sta pct in dct delno razširjena in prekrita z atrofičnim epitelijem. Ultrastrukturno opazimo izgubo mikrovilov in zmanjšanje višine celic z multifragmentacijo jeder. V podocitih so stopalni procesi difuzno izgubljeni. Tubularne primarne migetalke so neorganizirane, zlasti v cistah proksimalnih tubulov, kažejo spremembe v dolžini in citoplazmatskem položaju (slika 1b).

2.1.3. MCDK

V ledvičnem tkivu je mogoče najti občasne nezrele in zrele g.Ledvicatkivo je napolnjeno s številnimi ovalnimi cistami. Stebraste epitelijske celice pokrivajo ciste in so obdane z ohlapnim vezivnim tkivom. Imunohistokemično barvanje na -tubulin kaže več dolgih in neorganiziranih primarnih migetalk na površini epitelijskih celic (slika 1c).

2.1.4. FSGS

V 90 odstotkih g najdemo obsežno segmentno sklerozo (n=100), povezano z intersticijsko fibrozo in znaki tubularne poškodbe. Pod elektronskim mikroskopom ugotovimo zmanjšanje višine epitelijskih celic z izgubo mikrovil, medtem ko imajo endotelne celice in mezangialne regije pravilno ultrastrukturo. V elektronskem mikroskopu je na površini distalne tubularne celice opazen izredno dolg in dislociran (decentraliziran) cilium (slika 1e). Podociti kažejo difuzno izgubo nožnih procesov z obsežnim tkivom mikrovilusov. Imunohistokemično barvanje na a-tubulin kaže več dolgih in neorganiziranih primarnih migetalk na površini epitelijskih celic (slika 1c).

2.2. Imunohistokemično barvanje na 心tubulin, inverzijo in DVL-1- ter statistična analiza razvijajočih se in zdravih poporodnih človeških ledvic

V 14., 15. in 16. gestacijskem tednu seledvicatkivo je predstavljeno z različnimi razvojnimi stopnjami nastajanja nefrona: od metanefričnih skodelic,ledvičnastopnjah mehurčkov, da poveljujejo nefronom v obliki črke S in tako tvorijo nefrogeno cono v zunanji skorji (slika 2). Razlikovanje pct, dct in g je mogoče opaziti v kortikalnih regijah bližjeledvicamedula. Med 22. GW so se deli medule in korteksa jasno razlikovali, medtem ko so v 38. GW,ledvicastrukture so videti kot zelo diferencirane, vsebujejo zrele oblike pct, dct in g

2.2.1. a-Tubulin

Med razvojem je a-tubulin močno izražen v vseh razvijajočih seledvicastrukture, predvsem vizualizacijo oblike primarnih cilij na površinah parietalnih epitelijskih celic Bowmanove kapsule, g, pct in dct. Znotrajledvicatkivu 82–97 odstotkov celic pct izraža a-tubulin, medtem ko pri dct izražanje pade z 99 odstotkov na 72 odstotkov v 38. GW (glej sliko 3, tabelo 1). Med različnimi razvojnimi stopnjami je najmočnejša ekspresija a-tubulina v g 16. GWledvice, ki vsebuje 93 odstotkov pozitivnih celic. gibke 14., 15. in 22. GW (glej sliko 3a,b, tabela 1), okoli 70 odstotkov celic g izraža a-tubulin, medtem ko je najmanjša ekspresija opažena v 38. GW (p < 0,01)="" s="" 34="" odstotki="" pozitivnih="" celic="" (slika="" 3c).="" v="">ledvicatkivo (15-let in 7-letledvice), je najmočnejša imunoreaktivnost na a-tubulin opažena na apikalni celični površini pct in dct (slika 3d-f). Ekspresija a-tubulina je prisotna tudi v perinuklearni citoplazmi dct in parietalnih epitelijskih celicah Bowmanove kapsule. a-tubulin obarva vseledvičnastrukture s povprečjem 50 odstotkov pozitivnih celic v pct, 94 odstotkov v dct in 85 odstotkov v g (slika 3f). Dct madeži se pomembno razlikujejo od pct (p < 0,0001).="" vse="" raziskane="" strukture="" so="" pozitivne="" na="" a-tubulin,="" s="" 77="" odstotki="" pozitivnih="" celic="" v="" pct,="" 72="" odstotkov="" v="" dct="" in="" 58="" odstotkov="" v="" g="">

Slika 3. Imunofluorescenčno barvanje -tubulina in DAPI v tkivih ledvic v razvoju in po porodu (a–e). Ledvice 14., 15./16., 38. GW (a–c);ledvice15- in 7-letnih otrok (d,e). Pozitivno obarvanje -tubulina (puščice) je prikazano v vsaki strukturi v skorji skozi razvojne in postnatalne faze (a–e), proksimalne zavite tubule (pct), distalne zavite tubule (dct) in glomerule (g). Podrobnosti primarnih cilij v pct (d) in dct (a–c,e) so prikazane kot vstavki z večjo povečavo (belo polje). Povečava ×40, lestvica 100 µm. Porazdelitev -Tubulin pozitivnih celic na strukturo v različnih stopnjah razvoja in v postnatalnem obdobju je prikazana v grafu (f). Graf (g) (skupno število beljakovinsko pozitivnih celic v opazovanih strukturah) prikazuje izražanje beljakovin v povezavi z razvojnim časom (linearna regresija) in medsebojno povezavo -Tubulina z DVL-1 skozi razvoj in zorenje (dvosmerna ANOVA, ki ji sledi SIDAK-ov posthoc test). Podatki so prikazani kot povprečje ± SD.

Porazdelitev -tubulin-pozitivnih celic na strukturo v različnih stopnjah razvoja in v postnatalnem obdobju je prikazana v grafu (f). Graf (g) (skupno število celic, pozitivnih na beljakovine v opazovanih strukturah) prikazuje izražanje beljakovin, povezano z razvojnim časom (linearna regresija) in medsebojno povezavo -tubulina z DVL-1 skozi razvoj in zorenje (dvosmerna ANOVA, ki ji sledi Sidakov post hoc test). Podatki so prikazani kot srednje vrednosti ± SD.

2.2.2. Dvojno imunofluorescenčno obarvanje na inverzijo ter DVL-1 in DAPI jedrsko barvanje pri razvijajočih se in zdravih poporodnih ledvicah. Inverzijska ekspresija v razvijajočem se in poporodnem ledvičnem tkivu

V 14., 15. in 16. GW inverzija kaže močno zrnato izražanje v g in blago zrnato izražanje v citoplazmi pct in dct (slika 4a,b), medtem ko v 22. in 38. GW (glej sliko 4c) močno pozitiven izraz opazimo v g (tabela 1). Med 14. in 22. GW približno 50 odstotkov celic izraža različico. V 16. GW celice pct izražajo inverzijo v 73 odstotkih celic, medtem ko se v 38. GW zmanjšajo na 29 odstotkov celic (p <0,05) (glej="" sliko="" 4f).="" pozitivno="" izražanje="" inverzije="" najdemo="" v="" približno="" 80–90="" odstotkih="" dct="" in="" g="" celic="" v="">ledvicatkivih 14. in 16. GW, z najnižjo ekspresijo v dct 38. GW (p < 0.05,="" p="">< 0,0001),="" kjer="" je="" bilo="" 66="" odstotkov="" celic="" pozitivnih.="" v="">ledvice, pct se močno obarva na apikalni celični membrani, medtem ko se dct obarva večinoma na bazalni celični membrani in v perinuklearni citoplazmi (slika 4d, e). V tej fazi smo pri vseh preiskovanih ugotovili izraženost inverzijeledvičnastruktur, vključno s pct, dct in g, s povprečno izraženostjo pozitivnih celic 92 odstotkov za pct, 88 odstotkov za dct in 90 odstotkov za g (slika 4f). Med strukturami nismo opazili pomembne razlike v jakosti signala izražanja inverzije. Najvišjo izraženost inverzije najdemo v g, s povprečjem 94 odstotkov pozitivnih celic (slika 4f). Pomembna razlika je ugotovljena pri primerjavi obarvanja g (kjer se 94 odstotkov celic obarva pozitivno) s pct, kjer se 58 odstotkov celic obarva pozitivno (p < 0.01)="" in="" z="" dct,="" kjer="" je="" 49="" odstotkov="" celic="" pozitiven="" (p="">< 0,0001,="" slika="">

Izražanje DVL-1 v razvijajočem se in postnatalnem ledvičnem tkivu

Blago do močno izražanje DVL{{0}} opazimo v citoplazmi pct, dct in g v fetalnem obdobju (glejte sliko 4a–c, tabela 1). V pct 76–86 odstotkov celic izraža DVL-1 v 14.–22. GW, medtem ko je v 38. GW 57 odstotkov pozitivnih celic (slika 4g). V dct 14. in 15. GW 68–70 odstotkov celic izraža DVL-1, v 16. in 22. GW število pozitivnih celic pade na 42–5{{41} } odstotkov , medtem ko je pri 38. GW izražanju (p < 0,001)="" opažen="" pri="" 19="" odstotkih="" dct="" celic.="" izražanje="" dvl-1="" se="" poveča="" v="" g="" v="" vseh="" fetalnih="" fazah:="" v="" 14.="" gw="" je="" 6="" odstotkov,="" medtem="" ko="" se="" v="" 15.,="" 16.="" in="" 22.="" gw="" poveča="" na="" 10="" odstotkov="" (p="">< 0,01).="" v="" 38="" gw="" 14="" odstotkov="" celic="" g="" izraža="" dvl-1="" (slika="" 4="" g).="" v="" postnatalnem="" obdobju="" je="" imunoreaktivnost="" dvl-1="" razpršena="" v="" citoplazmi="" (tabela="" 1)="" tako="" pct="" kot="" dct="" (slika="" 4d,e).="" signal="" najdemo="" v="" vseh="" raziskanih="" strukturah,="" večinoma="" pa="" v="" perinuklearni="" citoplazmi.="" intenzivnost="" izražanja="" dvl-1="" je="" značilno="" večja="" pri="" pct="" v="" primerjavi="" z="" dct="" in="" g="" (p="">< 0,01).="" 39–45="" odstotkov="" celic="" v="" pct="" in="" dct="" izraža="" dvl-1,="" medtem="" ko="" je="" v="" g="" 21="" odstotkov="" celic="" pozitivnih="" (slika="" 4="" g).="" bistvene="" razlike="" med="" odstotkom="" imunoreaktivnih="" celic="" pri="" različnih="" nismo="">ledvičnastrukture. Odstotek imunoreaktivnih celic DVL-1 je 34 odstotkov v pct, 36 odstotkov v dct oziroma 27 odstotkov v g (slika 4g).

Slika 4. Dvojno imunofluorescenčno obarvanje inverzije (zeleno), DVL-1 (rdeče) in DAPI (modro) v tkivih ledvic v razvoju in po porodu (14.–38. GW, 1.5- in {{6 }}letna ledvična tkiva). Pozitivno obarvanje (puščice) je prikazano v vsaki strukturi v vseh fazah razvoja (a – c) in poporodnem obdobju (d, e). Združeni mikrofoni skupaj s strukturami, ki nas zanimajo v korteksu: proksimalni zaviti tubuli (pct), distalni zaviti tubuli (dct) in glomeruli (g). Kolokalizacija inverzije/DVL-1 (puščica) je prikazana na združenih mikrofotografijah. Negativna kontrolna barvanja so prikazana kot vstavki na inverziji in DVL-1 (a). Eritrocite lahko vidimo kot močno obarvane celice v bližini dct. Podrobnosti so prikazane kot vstavki z večjo povečavo. Povečava ×40, lestvica 100 µm. Dinamična pozitivna celična porazdelitev inverzije in DVL-1 v strukturah ledvic (pct, dct, g) skozi razvojno in postnatalno fazo je prikazana v grafih (f,g). Graf (h) prikazuje izražanje beljakovin (skupno število pozitivnih celic v strukturah), povezano z razvojnim časom (linearna regresija) in medsebojno povezavo med inverzijo in DVL-1 skozi razvoj in zorenje (dvosmerna ANOVA, ki ji sledi Sidakov post hoc test ). Podatki so prikazani kot srednje vrednosti ± SD.

Sočasno izražanje inverzije in DVL-1 opazimo v citoplazmi ledvic g, dct in pct med razvojem (glejte sliko 4a–c, združitev). V postnatalnem obdobju sočasna ekspresija inverzije in DVL-1 označuje različne celične predele tubularnih celic v pct in dct, medtem ko je sočasna ekspresija v g značilna močna razširjenost inverzijske ekspresije (glej sliko 4d, združitev ). V 7-letnih poporodnih ledvicah je sočasno izražanje inverzije in DVL-1 vidno v tubularnih celicah dct in pct ter v g, kjer izražanje inverzije rahlo prevladuje v primerjavi z DVL-1 (Slika 4e, spajanje).

2.2.3. Razlike v izražanju -tubulina, inverzije in DVL-1 med različnimi razvojnimi stopnjami ledvic in poporodnimi ledvicami

Število -tubulin-pozitivnih celic v pct fetalnega ledvičnega tkiva je bilo statistično značilno večje v primerjavi s 7-letnim ledvičnim tkivom otrok (13. (p < 0).0{="" {11}}1),="" 15.="" (p="">< 0.0001)="" in="" 16.="" (p="">< 0.00001)="" gw).="" dct="" zgodnjih="" fetalnih="" faz="" (13.,="" 15.,="" 16.="" in="" 22.="" gw)="" je="" imel="" več="" pozitivnih="" celic="" v="" primerjavi="" z="" ledvičnim="" tkivom="" 38.="" gw="" in="" 15-letnega="" otrokovega="" ledvičnega="" tkiva="" (p="">< 0,0001,="" slika="" 3f).="" ko="" smo="" primerjali="" različne="" razvojne="" stopnje,="" smo="" ugotovili="" nižje="" stopnje="" izražanja="" inverzije="" v="" pct="" 13.="" (p="">< 0,0001),="" 15.="" (p="">< 0,00001),="" 22.="" (p="">< 0,001)="" in="" 38.="" (p="">< 0,0001)="" gw="" v="" primerjavi="" z="">ledvičnatkivo 15-letnega otroka. Pri dct je bila ugotovljena statistično značilna manjša izraženost inverzije pri primerjavi ledvičnega tkiva 16. GW in 38. GW (p < 0.0001).="" poleg="" tega="" so="" v="" tkivu="" ledvic="" 7-letnega="" otroka="" opazili="" manjšo="" izraženost="" inverzije="" v="" dct;="" primerjava="" 13.,="" 15.="" (p="">< 0,001,="" oba),="" 16.="" in="" 1.5-letnega="" ledvičnega="" tkiva="" z="" dct="" 7-letnega="" ledvičnega="" tkiva="" (p="">< 0,00001,="" slika="" 4f).="" opazovani="" signal="" izražanja="" dvl-1="" skozi="" različne="" stopnje="" je="" pokazal,="" da="" je="" pct="" 13.="" (p="">< 0,01),="" 15.,="" 16.="">< 0.001,="" respectively)="" and="" 22nd="" (p="" <="" 0.0001)="" gw="" had="" higher="" expression="" of="" immunoreactive="" cells="" compared="" to="" the="" pct="" of="" 7-year-old="" children="" kidney="" tissue.="" dvl-1="" immune-expression="" in="" dct="" of="" the="" kidney="" from="" 13th="" and="" 15th="" gw="" was="" significantly="" higher="" than="" in="" the="" 38th="" gw="" tissue="" (p="" <="" 0.0001,="" respectively,="" figure="">

2.2.4. Razmerje med izražanjem -tubulina in inverzijo na DVL-1 v razvijajočem se in postnatalnem ledvičnem tkivu

- Ekspresije tubulina in inverzije so primerjali z ekspresijo DVL-1 v vseh razvojnih fazah in v postnatalnem ledvičnem tkivu. -tubulin je imel statistično večjo ekspresijo v vseh opazovanih stopnjah v primerjavi z ekspresijo DVL-1 (p < 0.001,="" slika="" 3g).="" skozi="" vse="" opazovane="" stopnje="" je="" bila="" inverzija="" bolj="" izražena="" v="" primerjavi="" z="" dvl-1="" (p="">< 0,0001,="" slika="" 4="">

2.2.5. Primerjava imunohistokemičnega obarvanja z -tubulinom, različica in DVL-1- ter statistična analiza patološko spremenjenega ledvičnega tkiva (MCDK, CNF, FSGS) -Tubulin Razlika v obarvanju -tubulina pri MCDK, FSGS in CNF je bila v primerjavi s tem statistično pomembna na zdravo poporodno ledvično tkivo kot kontrolno skupino (p < 0.0001).="" displastična="" ledvična="" tkiva="" so="" imela="" znatno="" večjo="" ekspresijo="" v="" primerjavi="" s="" kontrolno="" skupino,="" medtem="" ko="" sta="" fsgs="" in="" cnf="" pokazala="" bistveno="" manjšo="" ekspresijo="" -tubulina="" v="" primerjavi="" z="" zdravo="" kontrolo="" (slika="">

Inverzija

Inverzija je izražena v citoplazmi neorganiziranih epitelijskih celic in tubulih MCDK (slika 5a). Pri CNF je izražanje inverzije značilno za g in dct, medtem ko se kaže manj intenzivno pri pct cistah (slika 5b). Pri FSGS je inverzija močno izražena pri g in dct, manj intenzivno pa pri pct cistah (slika 5c). Prostorsko izražanje inverzije je pokazalo statistično značilno večjo stopnjo obarvanja v zdravih ledvičnih tkivih (slika 5g) v primerjavi z MCDK, FSGS in CNF (p <>

Slika 5. Dvojno imunofluorescenčno obarvanje inverzije (zeleno), DVL-1 (rdeče) in DAPI (modro) v patoloških ledvičnih tkivih pri MCDK (a), CNF (b) in FSGS (c): tubuli (t) , glomeruli (g), pct cista (c), višina pct epitelijskih celic (*). Struktura in ko-lokalizacija celic inverzije in DVL-1 (puščice) sta prikazani v združenih odsekih s podrobnostmi v vstavkih z večjo povečavo. Negativna kontrolna barvanja so prikazana kot vstavki na inverziji in DVL-1 (a). Povečava ×40, lestvica 10{{20}} µm. Povezava -tubulina (d) in inverzije (e) z izražanjem DVL-1 v MCDK, FSGS in CNF (dvosmerna ANOVA, ki ji sledi post hoc test SIDAK). Razlika v višini epitelijskih celic (f) FSGS, CNF in MCDK pct v primerjavi z zdravo kontrolo (enosmerna ANOVA, ki ji sledi Tukeyjev post hoc test, n=50). Razlika v celotnem odstotku pozitivnih celic za -tubulin, inverzijo in DVL-1 v MCDK, CNF in FSGS v primerjavi z zdravo kontrolo (g–i), enosmerna ANOVA, ki ji sledi Tukeyjev post hoc test). Podatki so prikazani kot srednje vrednosti ± SD. Pomembne razlike so prikazane z vrednostjo p (* p < 0,05,="" **="" p="">< 0,01,="" ****="" p="">< 0,0001).="" dvl-1="" dvl-1="" je="" zelo="" blago="" izražen="" le="" v="" neorganiziranih="" tubulih="" mcdk,="" medtem="" ko="" je="" v="" cnf="" njegov="" izraz="" značilen="" za="" dct="" in="" g="" (slika="" 5a,b).="" pri="" fsgs="" se="" dvl-1="" opazi="" kot="" blaga="" reaktivnost="" v="" g,="" dct="" in="" pct="" (slika="" 5c).="" zdrava="" ledvična="" tkiva,="" obarvana="" na="" dvl-1,="" so="" pokazala="" znatno="" višjo="" stopnjo="" obarvanja="" (slika="" 5="" h)="" v="" nasprotju="" z="" mcdk="" in="" fsgs="" (p="">< 0,0001,="" oboje),="" medtem="" ko="" za="" cnf="" niso="" ugotovili="" pomembne="">

2.2.6. Razmerje med izražanjem -tubulina in inverzijo na DVL-1 v patološko spremenjenem ledvičnem tkivu (MCDK, CNF, FSGS)Pri MCDK, FSGS in CNF je -tubulin obarvan znatno višje kot DVL-1 (p < 0.0001,="" slika="" 5d).="" inverzija="" je="" bila="" obarvana="" značilno="" višje="" v="" primerjavi="" z="" dvl-1="" pri="" mdck="" (p=""><0,0001) in="" pri="" fsgs="" (p=""><0,01, slika="">

2.2.7. Razlike v višini epitelijskih celic proksimalnih zavitih tubulov med zdravo kontrolo in patološko spremenjenim ledvičnim tkivom (MCDK, CNF, FSGS)Višino pct epitelijskih celic (n {{0}} na skupino) smo primerjali med celicami tubulov v zdravih tkivih ledvic in patološko spremenjenih tkivih ledvic (slika 5b,c,f). Povprečna višina epitelijskih celic pri HC je bila 12,91 µm ± 1,847 µm in je bila znatno višja v primerjavi s CNF in FSGS (p < 0.0001).="" povprečna="" višina="" celic="" v="" cnf="" pct="" je="" bila="" 9,011="" µm="" ±="" 1,453="" µm,="" medtem="" ko="" je="" bila="" v="" fsgs="" 8,114="" µm="" ±="" 0,9248="" µm.="" epitelne="" celice="" pct="" mcdk="" niso="" pokazale="" pomembnih="" sprememb="" v="" višini="" (12,17="" µm="" ±="" 1,476="" µm)="" v="" primerjavi="" s="">

2.2.8. Razlike v primarni dolžini cilij med zdravo kontrolo in patološko spremenjenim ledvičnim tkivom (MCDK, CNF, FSGS)

Primarno dolžino migetalk (n= 50 na skupino) so primerjali med HC in patološko spremenjenimi ledvičnimi tkivi (slika 6c). Zdrava ledvična tkiva in MCDK smo obarvali z -tubulinom, da bi ponovno zagotovili specifičnost obarvanja -tubulina ciliuma (slika 6a,b). V zdravem ledvičnem tkivu je bil primarni cilium dolg 5,065 µm ± 1,229 µm, medtem ko sta bila pri MCDK CNF in FSGS bistveno daljša (p<0.0005, respectively).="" primary="" cilium="" length="" in="" mcdk="" was="" 9.908="" µm="" ±="" 2.434="" µm,="" in="" cnf="" 13.65="" µm="" ±="" 3.218="" µm,="" while="" in="" fsgs="" was="" significantly="" longer,="" 18.29="" µm="" ±="" 4.717="" µm,="" when="" compared="" to="" hc=""><0.0001) and="" other="" pathological="" kidney="" tissues="" of="" mcdk=""><0.0001) and="" cnf=""><>

Diskusija

Namen naše študije je bil raziskati imunohistokemično izražanje a-tubulina, inverzijo in DVL-1 pri ploduledvičnatkivo in postnatalno ledvično tkivo. Poleg tega smo želeli raziskati, ali sta izražanje in vzorec obarvanja a-tubulina, inverzije in DVL-1 motena pri različnih boleznih ledvic v primerjavi z zdravo kontrolo. Namreč, kljub velikemu zanimanju drugih raziskovalcev za vlogo a-tubulina, inverzije in DVL-1 med razvojem ledvic, je večina dosedanjih študij uporabljala živali ali in vitro eksperimentalne modele. Kolikor vemo, je to prva študija, ki je pokazala ekspresijo in lokalizacijo a-tubulina skupaj z inverzijo in DVL-1 v fetalnih in postnatalnih človeških ledvicah in ki je raziskovala ekspresijo omenjenih proteinov v ledvicah bolezni, kot so MCDK, FSGS in CNF. Analizirali smo tudi spremembe v dolžini in videzu cilij s svetlobno in elektronsko mikroskopijo, saj je naša prejšnja študija že pokazala, da so lahko motnje ciliarja povezane s cistogenezo pri FSGF in CNF [19].

V kanonični Wnt-signalni poti vezava Wnt ligandov na receptorje rekrutira Dvl [37]. Procesi MET in poti polarnosti ravninskih celic v zgodnjih fazah morfogeneze ledvic so pod nadzorom signalizacije Wnt. S posredovanjem poti Wnt primarne migetalke nadzorujejo celično proliferacijo, diferenciacijo in morfogenezo tkiva [12] z organiziranjem celičnega citoskeleta in celične orientacije ter raztezkom tubularne strukture [2,38]. V naši študiji so bili -tubulin, inverzija in DVL-1 vsi prisotni v ledvičnih strukturah in vsi kolokalizirani ne samo med fetalnim razvojem ledvic, temveč tudi v ledvičnem tkivu od 1.5- in {{9 }}letni otroci. Te ugotovitve se ujemajo z aktivacijo Wnt-signalne poti, ki se je dokazano pojavila že med tubulogenezo [39]. Poleg tega so naši rezultati razkrili, da sta izražanje -tubulina in inverzija vzajemno povezana z DVL-1 in da kažeta statistično značilno razliko med njunima vzorcema izražanja. To je v korelaciji z eksperimentalnimi modeli, saj mutacija celotne družine proteinov Dvl pri miših povzroči pomanjkanje procesa gastrulacije, medtem ko mutacije, ki ne vključujejo celotne družine proteinov, kažejo napake v postavitvi nodalnih migetalk skupaj z okvarami organov [40] . Prejšnje ugotovitve so pokazale, da ima inverzija vlogo pri migraciji celic pri Xenopus pronephros. Ker ta segment ustreza Henlejevi zanki sesalcev in distalnim tubulom, bi to lahko kazalo na pomembnost inverzije med razvojem ledvic tudi pri ljudeh [41]. V skladu s to predpostavko so prejšnje študije razkrile, da lahko mutacija inverzijskega gena povzroči nefronoftizo tipa 2, ki je posredovana z nenormalno ekspresijo DVL-1 [42]. Kljub temu, da je vloga primarnega ciliuma sporna pri regulaciji Wnt-signalne poti, smo ugotovili, da je -tubulin kolokaliziran z inverzijo in DVL-1 v analiziranih vzorcih ledvic. Poleg tega so prejšnje študije pokazale, da primarni cilium skupaj z inverzijo uravnava razgradnjo Dvl z vplivanjem na Wnt-signalno pot [43]. Pri boleznih ledvic pri človeku, povezanih z razvojem cist, so opazili nenormalno lokalizacijo in delovanje primarnih cilij [19]. Podobno je ta študija potrdila tudi morfološke spremembe tvorbe primarnih cilij v patoloških stanjih, kot so CNF, FSGS in MCDK. Prejšnje ugotovitve so potrdile, da čezmerna aktivacija kanonične poti Wnt po poškodbi ledvic povzroči nepopravljive strukturne spremembe ledvičnega tkiva [44]. Nasprotno, primarni cilium je dobil vlogo preklopa s kanonične na nekanonično pot Wnt pri pomočiledvičnapopravilo. Poleg tega je bilo ugotovljeno, da ima čezmerna aktivacija kanonične poti Wnt v tkivu presajene ledvice pozitivno napovedno vrednost za fibrozo ledvic [45]. Če kanonična pot Wnt prevlada na račun nekanonične, to podpira teorijo ledvične fibroze kot izida. Naše ugotovitve o zmanjšanem izražanju -tubulina in inverzije v CNF in FSGS kažejo na neaktivnost nekanonične poti Wnt, zlasti ker oba pogoja ponavadi vodita v končno fazoledvična bolezen.Menijo namreč, da bi bila normalna lokalizacija in funkcija primarnega ciliuma lahko dejavnik pri ohranjanju pravilne poti Wnt in s tem predpogoj za normalen razvoj. V nasprotju s tem, če je pot Wnt okrepljena, lahko to povzroči neregulirano celično proliferacijo in diferenciacijo, ki vodi v karcinogenezo [46]. Kot je bilo že opisano, je kanonična pot Wnt obvezna za začetek MET in tvorbo nefrona, medtem ko lahko njena motnja povzročiledvičnahipoplazija [47]. Naši rezultati podpirajo to zamisel z razkrivanjem najnižje izraženosti DVL-1 z najvišjo izraženostjo -tubulina v MCDK v primerjavi z zdravo kontrolo. Ti rezultati lahko pomenijo najnižjo aktivacijo kanonične poti Wnt, kar bi lahko bil osnovni vzrok za odsotnost tvorbe nefrona. V nasprotju s tem lahko najvišja ekspresija -tubulina z najnižjo ekspresijo DVL-1 pojasni ugotovitve več cist, saj ni organiziranega raztezka in celične polarizacije, ki bi jo vodila nekanonična pot Wnt. Prejšnje študije so tudi pokazale, da inverzija zavira kanonično signalno pot Wnt z usmerjanjem Dvl za razgradnjo [26]. Ugotovljeno je bilo, da je ta korak v njuni interakciji potreben za zaviranje kanoničnega Wnt-signaliziranja pri vzdrževanju normalnega tubularnega raztezanja in pozicioniranja. Posledica inverzijske mutacije je regulacija kanoničnega signaliziranja Wnt, ki je nato povzročila nenormalno proliferacijo v tubularnih celicah. Ta korak se je izkazal za ključnega pomena pri cistogenezi [42], medtem ko izločitev inverzije pri miših vodi do policistične bolezni ledvic [48]. Po teoriji oledvičnacistogeneze se inverzija šteje za "mikoprotein", ker je lokalizirana na primarnih migetalkah vledvičnatubularne celice. V naši študiji so bile primarne migetalke prisotne na apikalni celični površini tubularnih celic v vseh analiziranih fazah, medtem ko je bila med fetalnimi fazami izražanje -tubulina močnejše kot v postnatalnem obdobju.

CISTANCHE BO IZBOLJŠAL LEDVIČNE/LEDVIČNE BOLEČINE

Prejšnje študije so pokazale, da lahko na delovanje primarnih cilij vpliva disregulacija -tubulina med razvojem, kar lahko privede do cistogeneze, nenormalnega razvoja ledvic in možne kronične bolezni ledvic v otroštvu [31,49]. To je v skladu z našimi ugotovitvami o skrajšanih in dismorfnih primarnih migetalkah, opaženih pri MCDK, ali z več in izjemno podolgovatimi ali dislociranimi migetalkami, najdenimi v razširjenih tubulih CNF in FSGS, v primerjavi z zdravo kontrolo. V podporo dejstvu, da se kanonične in nekanonične Wnt-signalne poti, ki jih urejajo primarne migetalke, štejejo za obvezne za normalen razvoj ledvic, smo ugotovili bistveno manjše obarvanje inverzije in DVL-1 pri MCDK v primerjavi z zdravo kontrolo [31,49]. Različna dinamika vzorca izražanja -tubulina, inverzije in DVL-1 v različnih fazah razvoja ledvic lahko kaže na preklapljanje med kanonično in nekanonično Wnt-signalno potjo med normalno morfogenezo ledvic. Predlagamo, da njihova izmenjava določa transkripcijo v kanonični poti ali vrstnem redu celične migracije in polarizacije med razvojem ledvic v nekanonični signalni poti. Njihovo ravnovesje in izraženost v vseh raziskanih strukturah ledvic nakazujeta njihovo pomembno vlogo pri normalnem razvoju ledvic. Med normalnim razvojem ledvic (od 13. GW do 38. GW) se skupna ekspresija -tubulina, inverzije in DVL-1 zmanjšuje, ko ledvično tkivo pridobiva zrelo morfologijo. V 15- in 7-letnem ledvičnem tkivu sta -tubulin in inverzija pokazala rahlo povečanje izražanja, kar podpira dejstvo, da nekanonična pot Wnt ostane aktivna po rojstvu. Nasprotno, DVL-1 vztraja z zmanjšanim vzorcem izražanja, kar bi lahko prispevalo k sklepu, da je kanonična pot Wnt v zdravem ledvičnem tkivu utišana. Zaradi patoloških ledvičnih stanj lahko epitelne celice ledvic reagirajo s ponovnim pojavom EMT in fibroze [50], povezane z reaktivacijo kanonične poti Wnt [44]. Zato so lahko motnje -tubulina, inverzije in DVL-1, ki jih najdemo v obolelih ledvicah, osnovni patološki mehanizem in posledica preklopa z nekanonične na kanonično pot Wnt v razvijajoči se ledvici, kar namiguje na preklop med reverzibilno in ireverzibilno ledvico poškodbe. Nadalje, spremembe v njihovem prenatalnem in poporodnem obdobjuledvičnavzorec izražanja je lahko povezan z okvaro delovanja ledvic v odrasli dobi, kar vodi v prirojene bolezni in kronično odpoved ledvic.

4. Materiali in metode

4.1. Človeški vzorci

Vzorci fetalnega ledvičnega tkiva so bili odvzeti po izgubi nosečnosti v 14., 15., 16., 22. in 38. GW na Klinici za ginekologijo in porodništvo KBC Split. Ves pridobljeni fetalni material je pregledal patolog, za raziskavo pa so bila uporabljena le tkiva brez znakov nepravilnosti, maceracije ali intrauterine smrti in z normalnim kariogramom. Pred odvzemom vzorcev so pregledali zdravstveno kartoteko mater in v primeru zdravstvenih težav, ki bi lahko vplivale na izid nosečnosti, so iz raziskave izključili ledvična tkiva. Zrelost je bila določena z obsegom glave, obsegom trebuha in dolžino stegnenice [51] v korelaciji z menstrualnimi koledarji bolnic. Vzorci 15- in 7-letnega ledvičnega tkiva so bili zbrani po naključnih smrtih. Vzorci so bili pridobljeni na Oddelku za patologijo KBC Split. Vzorci multicistično displastičnih ledvičnih tkiv (MCDK) so bili pridobljeni po izgubi nosečnosti, fokalna segmentna glomeruloskleroza (FSGS) in nefrotski sindrom finskega tipa (CNF) so bili pridobljeni zaradi nefrektomije. Ves pridobljeni material je pregledal in ovrednotil patolog, ki je razvrstil diagnoze. Protokol študije je odobril Etični odbor Medicinske fakultete Univerze v Splitu (20. maja 2016) v skladu s Helsinško deklaracijo in njenimi posodobitvami (klasifikacijska št.: 003-08/16-03/0001, registrska št.: 2181-198-03-04-16-0024, 20. maj 2016) [52].

4.2. Imunohistokemija

Fiksacija zbranega vzorca tkiva je bila obdelana s 4 odstotki paraformaldehida v fiziološki raztopini s fosfatnim pufrom (PBS) 24 ur pri 22 ◦C. Po dehidraciji v 100-odstotnem etanolu so vzorce vdelali v parafin, kot je opisano prej [53]. Vzorci so bili z mikrotomom narezani na dele debeline 5 µm in nato nameščeni na mikroskopska stekelca. Za preverjanje ohranjenosti tkiva je bil vsak 10. rez obarvan s hematoksilinom in eozinom [54]. Depart-feminizacija in imunohistokemija sta bili izvedeni, kot je opisano prej [2,55,56]. Po izpiranju v PBS smo mikroskopska stekelca čez noč inkubirali s primarnimi protitelesi v vlažni komori pri 22 ◦C (sistem za barvanje stekelcev StainTray; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA). Primarna uporabljena protitelesa so bila kunčje monoklonsko protitelo proti alfa tubulinu (razredčitev 1:1000; ab179484, Abcam, Cambridge, UK), kunčje poliklonsko protitelo proti inverziji (razredčitev 1:100; ab65187, Abcam, Cambridge, UK), mišje monoklonsko DVL -1 protitelo (razredčenje 1:150; sc-8025, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, ZDA) in kunčje poliklonsko protitelo proti gama tubulinu (za preverjanje primarnega za cilije specifičnega obarvanja z alfa- tubulin, razredčitev 1:500; ab11321, Abcam, Cambridge, UK). Po izpiranju v PBS so eno uro dajali sekundarna protitelesa, kot je navedeno: oslovski protitelesa proti kuncem IgG H&L, Alexa Fluor 488 (razredčitev 1:400; ab150073, Abcam, Cambridge, Združeno kraljestvo) in kozja protitelesa proti mišjim IgG H&L, TRITC (razredčitev 1:400; ab6786, Abcam, Cambridge, Združeno kraljestvo) 4',6-diamidino-2-fenilindol dihidroklorid (DAPI) smo uporabili za barvanje jeder in po 2-minutni inkubaciji stekelca so bili sprani v PBS in prekriti z medijem za pritrditev in pokrovnimi stekelci. Nespecifično obarvanje smo preprečili z uporabo proteinskega bloka (ab64226; Abcam, Cambridge, Združeno kraljestvo) pred primarnim nanosom protiteles. Kot negativno kontrolo smo izvedli predadsorpcijski test, specifičnost sekundarnih protiteles pa smo preverili tako, da smo primarna protitelesa izpustili iz postopkov barvanja.

4.3. Elektronska mikroskopija

Pritrditevledvicatkiva smo izvajali v 4-odstotnem paraformaldehidu 24 ur, čemur je sledila naknadna fiksacija v 1-odstotnem osmijevem tetroksidu 1 uro. Postopek dehidracije je bil izveden s serijo etanola in končan z vdelavo v smolo LX 112 [22]. En mikrometrski tanki rezi so bili obarvani s toluidin modrim in proučeni, da bi izbrali ultratanke reze. Po obarvanju z uranil acetatom in svinčevim citratom so pregledali ultratanke reze z debelino 0.05 mikrometrov. Za pridobitev mikrofotografij je bil uporabljen mikroskop JEOL 1200 EX.

4.4. Genetska analiza

Kot je bilo že opisano [19], smo z uporabo levkocitov iz periferne krvi ekstrahirali genomsko DNK. Ugotovljena je bila homozigotna misenska mutacija v genu NPHS1 (c.1096A > C; p.Ser366Arg), kar je potrdilo diagnozo kongenitalnega nefrotskega sindroma finskega tipa (CNF) [57].

CISTANCHE BO IZBOLJŠAL OKUŽBO LEDVIC/LEDVIC

4.5. Analiza podatkov

Analiza rezov je bila izvedena na FL fluorescenčnem mikroskopu z uporabo 3 FL fluorescenčnih kanalov (Olympus BX51, Tokio, Japonska). Slike so bile posnete z digitalnim fotoaparatom DP71 (Olympus, Tokio, Japonska) pri veliki povečavi (×40). Samoledvičnaskorja, ki vsebuje proksimalne zavite tubule (pct), distalne zavite tubule (dct) in glomerule (g). Slike je nato obdelala programska oprema ImageJ (Rasband, WS, ImageJ, ameriški nacionalni inštitut za zdravje, Bethesda, MD, ZDA, https://imagej.nih.gov/ij/ (dostopano 15. oktobra 2018), 1997–2021. ) in Adobe Photoshop (Adobe Inc., San Jose, Kalifornija, ZDA) za nadaljnjo oceno. Pred štetjem celic je bilo uporabljeno orodje split channels ImageJ. Nato je bila prvotna imunofluorescenčna mikroskopska fotografija odšteta z rdečim ali zelenim kanalom (odvisno od tega, kakšen je bil prvotni kanal) z uporabo orodja ImageJ za izračun slike, da se prepreči uhajanje signala. Vrednosti pod pragom 50 so bile obravnavane kot negativne. Prešteli smo imunoreaktivne signale v celicah z vsaj 20 strukturami (pct, dct ali g) na stopnjo ali skupno pozitivno število celic na mikrofotografijo multicistične displastikeledvicatkiva, FSGS in CNF. Celice smo razvrstili kot pozitivne, če se je imunofluorescenčni signal nabral na kateri koli ravni membrane, citoplazme ali jedra nad vrednostjo 50, izmerjeno v programski opremi ImageJ z uporabo ukaza praga. Negativne celice so bile kategorizirane kot celice brez kakršne koli imunoreaktivnosti. Dva neodvisna preiskovalca sta analizirala podatke.

4.6. Polkvantitativna analiza

Intenzivnost -tubulina, inverzijo in signal obarvanja DVL-1 sta ovrednotila dva neodvisna raziskovalca z uporabo programske opreme ImageJ. Celotna intenzivnost signala je bila izmerjena po tem, ko je bila slika nastavljena na 8-bitni tip; nato je bila intenzivnost obarvanja markerja ovrednotena v 20 pct, dct in g z merjenjem začrtane površine strukture. Če so bili rezultati med ocenjevalci različni, je tretji neodvisni raziskovalec razjasnil dvom. Največja intenziteta signala za -tubulin je bila 84,125 ± 3,214 SD, za inverzijo 71,50 ± 2,715 SD in za DVL-1 80,916 ± 1,875 SD. Najvišja nasičenost barve signala na mikroskopskih fotografijah je bila označena kot 3 (66,66–99,99 odstotka celotne intenzivnosti slike signala), sledi 2 (33,33–66,66 odstotka) za vmesno intenzivnost signala in 1 (0,33 odstotka –33,33 odstotka) za nizko jakost signala (Tabela 1.).

4.7. Statistična analiza

Za določitev razlik med stopnjami in strukturami je bil opravljen Kruskal–Wallisov test, ki mu je sledil Dunnov post hoc z uporabo programske opreme GraphPad Prism (Graphpad Software Inc., San Diego, Kalifornija, ZDA, www.graphpad.com (dostopano 15. oktobra). 2018.)). Število pozitivnih celic je bilo izraženo v odstotkih kot povprečna vrednost ± standardna deviacija (SD), statistična značilnost pa je bila priznana pri p < 0,05.="" število="" analiziranih="" struktur="" je="" bilo="" 4200="" v="" 35="" vzorcih,="" skupno="" pa="" je="" bilo="" preštetih="" 135.256="" celic.="" uporabili="" smo="" 2-way="" anova="" s="" sidakovim="" post="" hoc="" testom="" za="" testiranje="" razlik="" v="" izražanju="" -tubulina,="" inverziji="" in="" dvl-1="" v="" različnih="" razvojnih="" stopnjah.="" za="" preučevanje="" izražanja="" beljakovin="" glede="" na="" razvojni="" čas="" smo="" uporabili="" linearno="" regresijo.="" enosmerna="" anova,="" ki="" ji="" je="" sledil="" tukeyjev="" post="" hoc="" test,="" je="" bila="" uporabljena="" za="" raziskovanje="" razlik="" v="" izražanju="" -tubulina,="" inverzije="" in="" dvl-1="" pri="">ledvicatkiva v primerjavi s tkivi MCDK, FSGS in CNF. Razlike v izražanju beljakovin med MCDK, FSGS in CNF so bile raziskane z 2-way ANOVA, ki ji je sledil Sidakov post hoc test. Enosmerna ANOVA, ki ji je sledil Tukeyjev post hoc test, je bila uporabljena za ovrednotenje razlik v dolžini cilij in višini epitelijskih celic pct med zdravo kontrolo in patološkoledvicatkiva. Podatki so bili prikazani kot povprečna vrednost ± standardna deviacija (SD) s statistično razliko, priznano pri p <>