Odzivi favonoida in fitooksilipina v listih granatnega jabolka (Punica Granatum L.), 1. del

Prosim kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza več informacij

Povzetek:Metil jasmonat (MeJA), proizveden v rastlinah, lahko posreduje pri njihovem odzivu na okoljske obremenitve. Pokazalo se je tudi, da eksogena uporaba MeJA aktivira signalne poti in inducira kopičenje fitoaleksina pri številnih rastlinskih vrstah. Da bi razumeli, kako se rastline granatnega jabolka biokemično odzivajo na okoljske obremenitve, je bila izvedena analiza presnovkov v listih granatnega jabolka, ki so bili izpostavljeni aplikaciji MeJA, in je razkrila edinstvene spremembe hidrolizirajočih taninov, flavonoidov in fitooksilipinov. Poleg tega so analize transkriptoma in qPCR v realnem času listov granatnega jabolka, obdelanih z lažnimi in MeJA, identificirale različno izražene presnovne gene in transkripcijske faktorje, ki so potencialno vključeni v nadzorhidrolizirajočpoti tanina, flavonoida in fitooksilipina. Molekularna, biokemijska in bioinformatska karakterizacija edinegalipoksigenazaz dolgotrajno ekspresijo, ki jo povzroča MeJA, je pokazala, da je sposobna oksidirati večkrat nenasičene maščobne kisline, čeprav se ne nahaja v podceličnem predelu, kjer so bili proizvedeni nejasmonatni (ne-JA) fitooksilipini. Ti rezultati skupaj kažejo, da medtem ko je široko zatiranje flavonoidov in antocianinov vsaj delno nadzorovano na ravni transkripcije, inducirana biosinteza ne-JAFitooksilipiniverjetno ni transkripcijsko urejeno. Na splošno boljše razumevanje tega, kako se listi granatnega jabolka odzivajo na okoljske obremenitve, ne bo le spodbudilo zdravja in produktivnosti rastlin, temveč bo vplivalo tudi na zdravje ljudi, saj so sadeži, pridelani iz rastlin granatnega jabolka, bogat vir hranilnih spojin.

Ključne besede:Metil jasmonat.flavonoid·Antocianin· Maščobna kislina.Fito-oksilipin· Lipoksigenaza

Za več informacij kliknite tukaj

Uvod

Ko so rastlinojede živali in patogeni ranjene ali napadene, rastline proizvajajo in oddajajo metil jasmonat (MeJA), ki ga zaznajo neranjena rastlinska tkiva in sosednje rastline, da aktivirajo obrambni odziv (Cheong in Choi 2003). Poleg tega se je pokazalo, da eksogena uporaba MeJA na rastlini izzove signalne poti ter proizvodnjo proteinov, povezanih s patogenezo, in obrambnih kemikalij, znanih kot fitoaleksini. Fenolni fitoaleksini, npr. flavonoidi in antocianini, so pokazali povečano kopičenje kot odgovor na zdravljenje z MeJA v različnih rastlinah, kot so Arabidopsis thaliana, grozdje (Vitis vinifera), banana (Musa acuminate), jabolko (Malus Domestica) in rdeča malina (Rubus idaeus). )(Pandey et al.2016; Portu et al.2015; De Geyteret et al.2012; Shafiq et al.2011; Flo-res in Ruiz del Castillo 2014). Biosinteza flavonoidov in antocianinov se začne s tvorbo naringenin halkona iz kumaroil CoA in treh molekul malonil CoA, ki jih katalizira kalkon sintaza (CHS), in kasnejšo izomerizacijo naringenin halkona v naringenin s kalkon izomerazo (CHI). Naringenin se nato uporabi za ustvarjanje osrednjih flavonoidnih in antocianinskih skeletov, ki so nadalje modificirani z glikozilnimi, metilnimi, hidroksilnimi in prenilnimi funkcionalnimi skupinami, da povzročijo različne strukture in funkcije (Tian et al. 2008).

Cistanche lahko izboljša imuniteto

In addition to phenolic phytoalexins, the production of Phyto-oxylipins upon MeJA induction has also been reported in a few plant species (Deboever et al.2020). Phyto-oxylipins are oxygenated fatty acids and derivatives that play a role in plant growth, development, stress response, and innate immunity(Wasternack and Feussner 2018). The initial step of Phyto-oxylipin biosynthesis involves oxidation of polyunsaturated fatty acids(PUFAs) to fatty acid hydroperoxides (HPOs)by lipoxygenases(LOXs)(Andreou and Feussner 2009). Plant LOXs are grouped into two subfamilies according to their protein sequences; type ILOXs are highly homologous(>75-odstotna podobnost) in ne vsebujejo signalnega peptida, medtem ko imajo LOX tipa II splošno nizko podobnost zaporedja (<35%)but all="" contain="" a="" chloroplast="" target="" peptide="" (feussner="" and="" wasternack="" 2002).="" plant="" loxs="" can="" also="" be="" classified="" based="" on="" enzymatic="" activities;9-loxs="" and="" 13-loxs="" target="" the="" c-9="" and="" c-13="" position="" of="" the="" fatty="" acid="" substrate,="" respectively="" (feussner="" and="" wasternack="" 2002).="" hpos="" generated="" by="" loxs="" can="" be="" further="" transformed="" to="" various="" phyto-oxylipins,="" such="" as="" hydroxy="" fatty="" acids="" by="" reductases,="" keto="" fatty="" acids="" by="" loxs,="" epoxy="" fatty="" acids="" by="" per-oxygenases(pxgs),="" and="" dihydroxy="" fatty="" acids="" by="" loxs="" or="" α-dioxygenase="" α-doxs).="" notably,13-hydroperoxy-linolenic="" acid(an="" hpo)produced="" from="" linolenic="" acid="" by="" 13-lox="" can="" initiate="" a="" series="" of="" reactions="" to="" form="" jasmonic="" acid(ja),="" meja,="" and="" the="" bioactive="" ja-isoleucine="">

Granatno jabolko (Punica granatum L.) je posebna vrtnarska rastlina, cenjena zaradi obilice fenolnih spojin v svojem sadju, kot so flavonoidi, antocianini in hidrolizirajoči tanini (HT), ki izhajajo iz intermediata šikimatne poti (Ono et al. 2016). ). Številne študije so se doslej osredotočale na vlogo fenolov granatnega jabolka pri lajšanju stresa in bolezni pri ljudeh (Wu in Tian 2017). Nasprotno pa je malo znanega o delovanju fenolov in drugih fitokemikalij pri obrambi granatnega jabolka pred abiotskimi in biotskimi dejavniki (npr. poškodbe, patogeni, indukcija MeJA) v listih in plodovih. Dve nedavni poročili sta ocenili obdelavo z MeJA pred žetvijo glede kakovosti plodov granatnega jabolka po žetvi (Koushesh Saba in Zarei 2019; Garcia-Pastor et al. 2020). Skupne antocianine, flavonoide in fenole plodov, obdelanih z MeJA, vendar ne listov, smo skupaj analizirali s spektrofotometrom. Ena od študij je analizirala tudi posamezne antociane z masno spektrometrijo (Garcia-Pastor et al. 2020). Vendar pa ostaja nejasno, kako se rastlinska tkiva granatnega jabolka, bodisi listi ali plodovi, odzivajo na okoljske obremenitve pred nastavkom plodov.

Da bi začeli razčlenjevati interakcije med rastlinami granatnega jabolka in okoljskimi dejavniki, smo raziskali presnovni odziv listov granatnega jabolka na eksogeno aplikacijo MeJA z uporabo tekočinske kromatografije visoke ločljivosti (HPLC) in tandemske masne spektrometrije s tekočinsko kromatografijo in elektrosprejno ionizacijo (LC-ESI-MS/MS). . V listih granatnega jabolka, zdravljenih z MeJA, so opazili edinstvene spremembe HT, flavonoidov in antocianov ter spremembe lipidov, maščobnih kislin in fitooksilipinov. Primerjalna analiza transkriptoma, potrjena z analizo qPCR v realnem času, je pokazala, da so bili strukturni in/ali regulatorni geni, vključeni v presnovo HT, flavonoidov, antocianina in fitooksilipina, različno izraženi v listih granatnega jabolka, obdelanih z lažnimi in MeJA. Edini gen LOX, ki je pokazal trajno povečano ekspresijo v listih, obdelanih z MeJA, je bil podvržen nadaljnji molekularni, biokemični in filogenetski karakterizaciji.

Materiali in metode

Standarda -glukogalina in pentagaloil glukoze sta bila kupljena pri Shanghai Yuanye Bio-Technology Co. Ltd (Šanghaj, Kitajska). Kemikalije, uporabljene v testu LOX, so bile pridobljene od naslednjih prodajalcev: 3-(dimetilamino)benzojska kislina (DMAB) (Adamas Reagent, Co., Ltd., Šanghaj, Kitajska), linolna kislina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA), 3-metil-2-benzotiazolinon (MBTH) in hemoglobin (Sangon Biotech Co., Ltd., Šanghaj, Kitajska).

Rastlinski material Plodove in semena granatnega jabolka (cv. Wonderful) je velikodušno zagotovila Panzhihua Academy of Agricultural and Forest Sciences, identificiral pa jih je dr. Binjie Ge v botaničnem vrtu Chenshan v Šanghaju. Vzorec vavčerja (št. CSHO173966) je bil deponiran v herbariju šanghajskega botaničnega vrta Chenshan v Šanghaju na Kitajskem. Sadike granatnega jabolka so gojili v rastni sobi s kontrolirano temperaturo 6 tednov pri 25 stopinjah in 16 h svetlobe/8 h teme. Koncentracija MeJA za nanos pršila na rastlinska tkiva naj bi se gibala od 100 do 250 μM（Ku et al.2014; Hickman et al. 2017). Na listih granatnega jabolka so bile sprva uporabljene različne koncentracije MeJA, od tega je 200 μM MeJA v predhodni analizi vodilo do opaznega presnovnega odziva in je bilo uporabljeno za analize metabolitov in izražanja genov, opisane v tej študiji. Pred obdelavo z MeJA je bila polovica rastlin granatnega jabolka prestavljena v drugo rastno sobo s podobnimi pogoji. Medtem ko so bile rastline v eni rastni sobi poškropljene z 200 μM MeJA, so bile rastline v drugi rastni sobi poškropljene z vodo (tj. lažni nadzor). Ob 2-h,3-h,6- h,12-h,24-h, 30-h,36-h,48-h,in72-h po zdravljenju odide od3. do 5 lažno obdelanih rastlin ali rastlin, obdelanih z MeJA, ki predstavljajo eno biološko ponovitev. Tri biološke ponovitve so bile zbrane za poskuse lažnega zdravljenja in zdravljenja z MeJA; vsaka biološka ponovitev je bila razdeljena na alikvote za profiliranje metabolitov in analize genske ekspresije.

Analiza profiliranja metabolitov

Listi granatnega jabolka so bili liofilizirani, stehtani in zmleti v fin prah z uporabo kroglic cirkonijevega oksida v stepalni napravi (Mixer Mill MM 400, Retsch GmbH, Haan, Nemčija) za 90-a pri 30 Hz. Za analizo HPLC smo vzorec listov ekstrahirali v 70-odstotnem metanolu 60 minut pod ultrazvočno obdelavo in centrifugirali pri 13,000 obratih na minuto 10 minut. Supernatant smo prenesli v vialo HPLC, od tega 30 μL vbrizgali na reverzno fazno HPLC (Agilent 1200, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ZDA) in analizirali, kot je opisano prej (Wil-son et al. 2019). Metabolite so zaznali z UV-absorpcijo pri 254 nm, 280 nm, 320 nm in 360 nm. Izdelane so bile standardne umeritvene krivulje -glukogalina in pentagaloil glukoze; uporabljeni so bili za pretvorbo območij vrhov, ki se ujemajo z retenzijskimi časi in absorpcijskimi spektri -glukogalina in pentagaloil glukoze, v ustrezne koncentracije.

For LC-ESI-MS/MS analysis, the homogenized leaf sample(100 mg) was extracted in 1 mL of 70% methanol at 4℃Covernight.On the following day, the methanolic extract was centrifuged at 10,000×g for 10 min and the supernatant was passed through a CNWBOND Carbon-GCB SPE cartridge（ANPEL, Shanghai, China） and a 0.22-μm syringe filter(ANPEL) prior to metabolite analysis. The extract （2 μL） was analyzed using LC-ESI-MS/MS (Shim-pack UFLC, Shimadzu, Kyoto, Japan; QTRAP6500, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)and a reverse phase C1s column(ACQUITY UPLC HSS T3,1.8 βm, 2.1 mm×100 mm, Waters, Milford, MA, USA).Metabolites were eluted using solvents(A)water containing 0.04%acetic acid,and(B)acetonitrile containing0.04% acetic acid at a gradient of 0-11 min,95-5%A;11-12 min,5% A;12-12.1 min,5-95%A;12.1-15min,95%A.The flow rate was maintained at 0.4 mL min-1. Linear ion trap (LIT) and triple quadrupole(QQQ)MS scans were acquired in positive-and negative-ion modes. The turbo spray ion source was operated at 500℃C with an ionization voltage of 5500 V. The ion source gas I, gas I, and curtain gas were set at 55 psi,60 psi, and 25 psi, respectively. The collision gas (nitro-gen) was set at 5 psi. For the MRM analysis, declustering potential (DP)and collision energy(CE) were optimized for each precursor-product ion transition. For metabolite identification, the LC-ESI-MS/MS data were compared with an MS2T library of commercial standards and previously identified compounds published in mass spectral databases (when commercial standards are not available)(Chen et al.2013). Pomegranate metabolites were annotated based on the retention times, accumulate m/z values, and fragmentation patterns that match the MS2T library entries(Chen et al.2013). Metabolite quantification was performed using the MRM method as described by Dresen et al. (Dresen et al.2010). The biological replicates of each treatment (mock or MeJA)were averaged for comparative metabolite analysis. The Variable Importance in Projection(VIP) value was obtained from the Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis(OPLS-DA)model. Metabolites with ILog, FCl>1, and VIP>=1 so bile obravnavane kot bistveno spremenjene.

Analiza transkriptoma

Celotno RNK smo ekstrahirali iz listov granatnega jabolka z reagentom TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA) in kvantificirali z uporabo Nanodrop2000 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, ZDA). Celovitost vzorcev RNA je bila preverjena z ločevanjem na agaroznem gelu (brez vidne razgradnje) in določitvijo razmerja OD20/28o (med 1,8 in 2,2) z uporabo Nanodrop2000. Obogatitev mRNA iz celotne RNA je bila izvedena z uporabo oligo (dT) magnetnih kroglic (Invitrogen). Knjižnice mRNA-Seq so bile izdelane z uporabo kompleta za pripravo knjižnice Truseq RNA (Illumina, San Diego, CA, ZDA). Analiza transkriptoma je bila izvedena na Illumina HiSeq4000 in za vsako vzorčno knjižnico je bilo pridobljenih 55-60 milijonov 150-bp seznanjenih končnih branj (PE150). Podatki neobdelanega zaporedja so bili obdelani z odstranitvijo zaporedij adapterjev in kratkih (<50 bp),="" low="" quality=""><30), and="" poly(="">10%)reads using SeqPrep (https://github.com/jstjohn/seqprep)and Sickle (HTTPS: GitHub. com/Joshi/sickle). Over 95% of the cleaned reads were uniquely mapped to the reference pomegranate genome for each sample library using HISAT2(Kim et al.2015) and the mapped reads were assembled using StringTie(Pertea et al.2015). The assembled transcriptome sequences were annotated using NCBI NR(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/). Transcript abundance was determined by the RNA-Seq by Expectation-Maximization(RSEM) method and expressed as Transcripts Per Kilobase Million(TPM)(Li and Dewey 2011). Differential gene expression analysis was performed using DESeq2 (Love et al.2014), with a thresh-old of the log, FCl>1 in prilagojena vrednost P<>

Analiza qPCR v realnem času

Celotno RNA smo ekstrahirali iz listov granatnega jabolka, obdelanih z lažnimi in MeJA, z uporabo RNAprep Pure Plant Kit (Tiangen Biotech Co., Ltd., Peking, Kitajska). Reverzna transkripcija (RT) je bila izvedena z uporabo celotne RNA in PrimeScriptTM RT Reagent Kit (Takara Bio Inc., Kusatsu, Japonska). Kvantitativni PCR (qPCR) je bil izveden z uporabo kompleta TB GreenTM Premix Ex Taq TM (Tli RNaseH Plus) ( Takara) in sistem PCR v realnem času StepOnePlus (Ther-moFisher Scientific). Izvedena je bila analiza talilne krivulje, ki je pokazala en produkt pomnoževanja za vsak par primerjev. Za analizo RT-qPCR so bile pregledane tri biološke ponovitve in vsaka s tremi tehničnimi ponovitvami za lažno obdelane vzorce in vzorce, obdelane z MeJA. Izražanje genov je bilo analizirano s primerjalno metodo C,(△AC) (Livak in Schmittgen 2001), ravni pomembnosti pa so bile določene z dvostranskim Studentovim t-testom. Zaporedja primerjev za analizo qPCR v realnem času in učinkovitosti pomnoževanja parov primerjev so prikazani v tabeli S1.

Ekspresija in čiščenje rekombinantnih proteinov in encimski testi

Odprti bralni okvir Pgr025417 (ki kodira domnevni LOX) je bil sintetiziran za optimalno uporabo kodona v E. coli (Genewiz, Suzhou, Kitajska) in kloniran v pET28a. Rekombinantni plazmid je bil transformiran v E. coli BL21 (DE3) celice. Kulturo 5-mL Luria Bertani (LB) s 50ug mL-ikanamicina smo začeli iz ene same kolonije in inkubirali čez noč s stresanjem pri 37C. Kulturo čez noč smo uporabili za inokulacijo 100-mL medija LB s 50 ug mL-kanamicina in pustili rasti do OD600 0,5. Nato smo dodali izopropil- -D-tiogalaktozid (IPTG) do končne koncentracije 0,1 mM za indukcijo izražanja beljakovin. Po inkubaciji s stresanjem pri 16 stopinjah 18 ur smo celice pobrali s centrifugiranjem. Celične pelete smo resuspendirali v pufru za lizo (50 mM NaH, PO, pH 7,4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol) in homogenizirali z uporabo celičnega motilca (Constant Systems Ltd, Northants, UK). His-označene beljakovine smo očistili z uporabo Ni-NTA kroglice (ThermoFisher Scientific) s pralnim pufrom (50 mM NaH, PO, pH 7,4,300 mM NaCl, 25 mM imidazol) in elucijskim pufrom (50 mM NaH, PO, pH 7,4,300 mM NaCl, 500 mM imidazol). Očiščene beljakovine smo ločili na 10-odstotnem SDS-PAGE gelu za vizualizacijo čistosti beljakovin. Koncentracijo očiščenih proteinov smo določili z uporabo Bradfordovega testa (Bradford 1976).

Za test LOX je bila kot substrat uporabljena linolna kislina v dvostopenjski kolorimetrični metodi z rahlimi modifikacijami (Anthon in Barrett 2008). Reakcijska mešanica 500-µL, vključno s 50 mM Na-fosfatom, pH 6, 10 mM DMAB, 0,5 mM linolne kisline in različnimi količinami prečiščenih rekombinantnih proteinov (1,5 mg mL -), smo inkubirali pri 25 stopinjah 10 minut. Reakcijski zmesi smo dodali drugo raztopino (500 µL), ki je vsebovala 0,2 mM MBTH in 0,1 mg mL-hemoglobina, ki smo jo inkubirali dodatnih 5 minut. Reakcijo smo zaključili z dodatkom 500 μL 1 odstotka (m/v) natrijevega lavril sulfata. Določena je bila absorpcija svetlobe pri 598 nm. Subcelična lokalizacija in filogenetske analize Iskanje označenega genoma granatnega jabolka (Qin et al. 2017) je identificiralo 1l domnevnih LOX polne dolžine (786 aa do 970 aa), vključno s Pgr025413, Pgr020032, Pgr025418, Pgr025417, PgrO18982, PgrO2grO180 -dolžinsko zaporedje v GenBank XP_031395793),Pgr009839, Pgr008562, Pgr025678 in PgrO13780. Subcelična lokalizacija in mesta cepitve signalnih peptidov za LOX granatnega jabolka so bila predvidena z uporabo TargetP 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/servi ces/TargetP/) (Almagro Armenteros et al. 2019).

Analiza mesta vezave TF

Za napovedovanje vezavnih mest TF-jev je bilo 1000 bp pred začetnim kodonom ATG ciljnih genov pridobljenih iz GenBank in preiskanih v primerjavi s TF-ji Eucalyptus Grandis v PlantRegMap (različica 5) (Tian et al. 2020). Vrednost praga za vezavo identifikacija mesta je bila nastavljena na P manj kot ali enako le-4. Statistična analiza za kvantifikacijo metabolitov, transkriptome in podatke qPCR v realnem času je opisana v ustreznih razdelkih.

Rezultati

MeJA modulira celično signalizacijo in presnovne poti v listih granatnega jabolka

Za razumevanje genomskega transkripcijskega odziva granatnega jabolka na sprožanje MeJA so bili potrebni transkriptomi listov granatnega jabolka pri 2-h,6-h,24-h in 72-h po MeJA oz. analizirali lažno zdravljenje (vsako s tremi biološkimi ponovitvami) (slika S1). Za vsak transkriptom je bilo pridobljenih približno 55 milijonov neobdelanih branj zaporedja (2 × 150 bp seznanjeni konec) z vsebnostjo GC okoli 52 odstotkov in vrednostmi Q30 v razponu od 91,6 do 95 odstotkov (tabela S2). Za vse transkriptome je bilo več kot 96 odstotkov očiščenih odčitkov zaporedja preslikanih v referenčni genom granatnega jabolka (Qin et al. 2017) (tabela S3). Večina sestavljenih transkriptov je bila manjša od 1000 bp (34,3 odstotka), 1000 bp- 2000 bp (32,9 odstotka) ali 2000 bp—3000 bp (18,1 odstotka) (tabela S4).

To identify pathways that are significantly enriched with differentially expressed genes (DEGs)at the above-mentioned time points, genes that show significantly different expression(log, FCl>1, prilagojeno P<0.05)between meja-="" and="" mock-treated="" leaves="" were="" compared="" to="" the="" kyoto="" encyclopedia="" of="" genes="" and="" genomes(kegg)database="" (fig.s1).="" application="" of="" meja="" modulated="" the="" expression="" of="" genes="" in="" plant="" hormone="" and="" mitogen-activated="" protein="" kinase="" (mapk)signaling="" pathways="" as="" well="" as="" fatty="" acid="" metabolism="" at="" all="" time="" points,="" with="" the="" only="" exception="" of="" those="" in="" plant="" hormone="" pathways="" at="" 24-h="" (fig.="" s1).="" while="" changes="" in="" aromatic="" amino="" acid="" metabolic="" (including="" the="" shikimate="" pathway)genes="" became="" evident="" at="" 6-h="" after="" meja="" treatment="" (fig.s1b),="" a="" surge="" of="" modified="" expression="" of="" flavonoid="" metabolic="" genes="" was="" observed="" for="" the="" 24-h="" and="" 72-h="" post-meja="" treatment="" leaves="" (figs.="" slc="" and="" s1d).="" shikimate="" and="" ht="" pathway="" genes="" and="" ht="" metabolites="" were="" induced="" in="" meja-treated="" pomegranate="" leave="" as="" revealed="" in="" the="" transcriptome="" and="" kegg="" pathway="" enrichment="" analysis,="" three="" shikimate="" biosynthetic="" path-way="" genes="" showed="" upregulated="" expression="" in="" meja-treated="" leaves="" relative="" to="" mock="" controls="" at="" 6-h,="" including="" 3-deoxy-d-arabinose-heptulosonate-7-phosphate="" synthase="" (dahps),="" 3-dehydrogenate="" synthase(dhs),="" and="" the="" bifunctional="" 3-dehydrogenate="" dehydratase/shikimate="" dehydrogenase="" (dhq/sdh;="" abbreviated="" as="" sdh)(figs.s1b="" and="" la).in="" particular,="" three="" isoforms="" of="" pomegranate="" sdhs="" were="" identified="" and="" showed="" differential="" expression="" in="" the="" transcriptome="" analysis,="" pgr020271,="" pgr019030,="" and="">

Da bi ugotovili, ali lahko spremembe v količini transkriptov biosintetičnega gena šikimata in HT vplivajo na raven presnovkov, pridobljenih iz teh poti, so fenolne presnovke ekstrahirali iz listov, nabranih ob 24-h, 30-h. 36-h,48-h in 72-h po MeJA ali lažnem nanosu in analizirano s HPLC (slika 2). Opozoriti je treba, da so bile te časovne točke izbrane tako, da upoštevajo čas, potreben za sintezo beljakovin in proizvodnjo in kopičenje metabolitov po opazovanih spremembah izražanja shikimata in biosintetskih genov HT pri 6-h. Retenzijski časi in absorpcijski spektri dveh metabolitov, eluiranih pri 4,57 min (vrh 1) in 24,98 min (vrh 2), so se ujemali s tistimi intermediatov poti HT - glukogallina oziroma Penta zlitin - glukoze (sliki la in 2a). Oba vrhova sta pokazala pomembne spremembe v integriranih površinah vrhov v več časovnih točkah (slika 2b). Natančneje, vrh 1 se je povečal v listih, obdelanih z MeJA, glede na lažne kontrole pri 30-h, 36-h in 48-h (slika 2b). Zanimivo je, da se je vrh 2 v listih, obdelanih z MeJA, sprva zmanjšal pri 24-h, nato pa se je povečal pri 30-h in 36-h, preden se je vrnil na raven, podobno lažnim kontrolam pri 48- h in 72-h (slika 2b). Zmanjšanje večine flavonoidov in antocianinov ter povečana vsebnost metiliranih flavonov in flavonolov je bilo očitno v listih granatnega jabolka, obdelanih z MeJA.

To investigate whether exogenous application of MeJA may trigger broad-scale metabolic changes in pomegranate, metabolite profiling analysis was conducted on leaves collected at 72-h after mock- or MeJA treatment using LC-ESI-MS/MS. Metabolite annotation and quantification were performed using an MS/MS spectral tag (MS2T)library and multiple reaction monitoring(MRM), respectively. Of the 658 metabolites that were detected,29 showed increased and 73 exhibited decreased accumulation in MeJA-treated leaves compared to the mock controls (ILog, FCl>1; preglednici S5 in S6). Pri različno akumuliranih presnovkih je prišlo do splošne obogatitve metabolitov, vključenih v sekundarni/specializirani metabolizem rastlin (67 od 102), zlasti fenolnih spojin (63 od 102) (tabela S6).

Med fenoli je bilo očitno usklajeno zmanjšanje širokega spektra flavonoidov in antocianinov (42 od 73 zmanjšanih spojin) v listih, obdelanih z MeJA (slika 3; tabela S6). Zanimivo je, da so bili trije mono- ali di-O-metilirani flavoni in flavonoli, vključno z di-O-metil kvercetinom, krizoberil O-heksozil-O-heksozidom in prodajnim 5-O-heksozidom, povečani v listih, obdelanih z MeJA (slika 3; tabela S6). Več intermediatov flavonoidnih in antocianinskih poti, vključno z luteolinom, krizoberilom, dihidrokempferolom, dihidrokvercetinom, dihidromiricetinom, epikatehinom, delfinidinom in pelargonidinom, je bilo mogoče zaznati, vendar niso pokazali pomembnih sprememb v listih, obdelanih z MeJA (slika 3; tabela S5). Derivati ​​hidroksicin-namoila, izoflavoni in kumarini so bili med drugimi fenoli, ki so pokazali zmanjšano kopičenje po indukciji MeJA (tabela S6). Nasprotno pa sta bili dve fenolni kislini, 2,3-dihidroksibenzojska kislina in protokatehuinska kislina (3,4-dihidroksibenzojska kislina), ter kumarin, 6-metil kumarin, povečani v listih, obdelanih z MeJA (Tabela S6).

V skladu z močno zmanjšanimi flavonoidi in antocianini v listih granatnega jabolka, obdelanih z MeJA, so transkripti dveh ključnih encimov za biosintezo flavonoidov in antocianinov. CHS(Pgr005566) in CHI (Pgr025966) sta se znatno zmanjšala pri 6-h in 24-h po aplikaciji MeJA glede na analizo transkriptoma (slika 4). Izvedena je bila analiza qPCR v realnem času, da se preuči izražanje CHS in CHI z dodatnimi časovnimi točkami, vključno z 2-h, 3-h, 6-h,12-h,{{ 11}}h,48-h in 72-h (slika 4). Transkripti CHS so padli v listih, obdelanih z MeJA, pri 3-h in so ostali znatno nižji od tistih v lažnem nadzoruje do 72-h, z največjim zmanjšanjem pri 12-h. Nasprotno pa je bilo zmanjšanje izražanja CHI pomembno le pri 24-h, 48-h in 72-h po zdravljenju z MeJA (slika 4).

Ta članek je izvleček iz Planta (2021) 254:89 https://doi.org/10.1007/s00425-021-03735-9