FGIN-1-27 je sintetični mitohondrijski receptor za zaviranje diazepama (MDR)agonist, ki je pokazal proapoptotično, anti-anksiozno in steroidogeno delovanjev različnih študijah. Tukaj poročamo, zaprvičas, antimelanogena učinkovitostodFGIN-1-27in vitroinin vivo. FGIN-1-27 znatnoinhibirano bazalno in melanocite stimulirajoči hormon ( -MSH)-, 1-Oleoil-2-acetil-sn-glicerol (OAG)-in endotelin-1 (ET-1) inducirana melanogeneza brez celične toksičnosti.Test aktivnosti gobove tirozinaze je pokazal, da FGIN-1-27 ne zavira neposrednoaktivnost tirozinaze, kar nakazuje, da FGIN-1-27 ni neposredni zaviralec tirozinaze. Čeprav ni mogel modulirati katalitične aktivnostigobja tirozinazain vitro, FGIN-1-27 je znižal nivoje izražanjaključnih proteinov, ki delujejo pri melanogenezi. FGIN-1-27 je igral te funkcijez zatiranjem PKA/CREB, PKC- , in poti MAPK. Ko je enkrat inaktiviran, jezmanjšalo izražanje MITF, tirozinaze, TRP-1 in TRP-2 ter zaviraloaktivnost tirozinaze,končnozaviranje melanogeneze. Medin vivoposkusi,FGIN-1-27 je zaviral pigmentacijo telesa cebricin zmanjšano UVB povzročenohiperpigmentacija kože morskega prašička, ne pa zmanjšanje števila melanocitov.Našugotovitveje pokazalo, da FGIN-1-27 ni pokazal citotoksičnosti in je zaviralmelanogeneza pri obehin vitroinin vivomodeli. Lahko se izkaže za zelo uporabnega kotvarnejše sredstvo za beljenje kože.

Glede na ustrezne študije,cistancheje navadno zelišče, ki je znano kot »čudežno zelišče, ki podaljšuje življenje«. Njegova glavna sestavina je cistanozid, ki ima različne učinke kot nprantioksidant, protivnetno, in spodbujanje imunske funkcije. Mehanizem med cistančo inbeljenje koželeži v antioksidativnem učinku cistančnih glikozidov.Melaninv človeški koži nastane z oksidacijo tirozina, ki jo kataliziratirozinaza, oksidacijska reakcija pa zahteva sodelovanje kisika, zato radikali brez kisika v telesu postanejo pomemben dejavnik, ki vpliva na proizvodnjo melanina. Cistanche vsebuje cistanozid, ki je antioksidant in lahko zmanjša nastajanje prostih radikalov v telesu.zaviranje proizvodnje melanina.

Kliknite na Cistanche Tubulosa

Za več informacij: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

UVOD

Melanogeneza je najpomembnejša funkcija melanocitov v koži. Pojasnjenih je bilo več kritičnih dejavnikov, ki vključujejo melanogenezo (Raposo in Marks, 2007; Noguchi et al., 2014). Ključni encim, ki uravnava melanogenezo, je tirozinaza in deluje s tirozinazo sorodnim proteinom 1 (TRP1) in s tirozinazo sorodnim proteinom 2 (TRP2) za spodbujanje sinteze melanina (Zhu et al., 2015). Drug pomemben dejavnik, ki sodeluje pri pigmentaciji, je transkripcijski faktor, povezan z mikroftalmijo (MITF), ki ne samo uravnava proliferacijo in preživetje melanocitov, ampak uravnava tudi izražanje tirozinaze, TRP1 in TRP2 (Kawasaki et al., 2008; Levy in Fisher, 2011). ). Okoljski dražljaji, kot je ultravijolično (UV) sevanje, igrajo ključno vlogo pri melanogenezi (Abdel-Naser et al., 2003). Pri izpostavljenosti UV-sevanju aktivirani keratinociti in melanociti proizvajajo -melanocite stimulirajoči hormon (-MSH), diacilglicerol (DAG) in endotelin-1 (ET-1) (D'Mello et al., 2016; Bae Harboe in Park, 2012). Ko se -melanocite stimulirajoči hormon (-MSH) veže na receptor melanokortina-1 (MC1R) v melanocitih, lahko poveča znotrajcelične ravni cikličnega adenozin monofosfata (cAMP) in aktivira protein kinazo A (PKA)/(CREB ) pot, ki končno spodbuja melanogenezo (Corre et al., 2004; Rzepka et al., 2016). Diacilglicerol (DAG) je bistven za aktivacijo protein kinaze C- (PKC-) v melanocitih, ki poveča aktivnost tirozinaze in povzroči pigmentacijo (Kim in sod., 2006; Kawaguchi in sod., 2012; Yuan in Jin, 2018). ). 1-Oleoil-2- acetil-sn-glicerol (OAG) je sintetični analog DAG, prepusten za membrano, ki se v veliki meri uporablja kot farmakološki aktivator PKC- (Rainbow et al., 2011). Endotelin-1 (ET- 1) inducira melanogenezo v melanocitih preko aktivacije poti protein kinaze, aktivirane z mitogenom (MAPK) (Park et al., 2015; Regazzetti et al., 2015).

Melanin igra pomembno vlogo pri zaščiti kože pred škodljivimi učinki ultravijoličnega sevanja, kot sta kožni rak in staranje (Slominski et al., 2004). Kljub temu prekomerna proizvodnja in nenormalno kopičenje melanina vodi do estetskih težav kože, kot so melazma, pege in temne lise (Jadotte in Schwartz, 2010). Več aktivnih belilnih spojin, vključno s kojično kislino in arbutinom, je bilo že odobrenih kot kozmetični dodatki (Kim et al., 2008). Vendar so poročali, da ima arbutin citotoksične učinke in da lahko kojična kislina povzroči raka (Singh et al., 2016). Zato je najpomembnejše odkritje učinkovitejših in varnejših sredstev za beljenje kože.

Mitohondrijski receptor za zaviranje diazepama (MDR) ima osrednjo vlogo pri regulaciji sinteze lipidov in steroidov in je široko porazdeljen v perifernih tkivih, vključno s kožo (Alho et al., 1993). V naših prejšnjih študijah je diazepam, en agonist MDR, reguliral pigmentacijo preko poti PKA/CREB (Lv et al., 2019). Poleg tega so nedavne ugotovitve pokazale, da je aktivacija MDR nekoliko povečala število novih melanocitov pri cebricah (Allen et al., 2020). V primerjavi z diazepamom ima FGIN-1-27 (N,N-diheksil-2-(4-fluorofenil)indol-3- acetamid) relativno večjo afiniteto in specifičnost za MDR (Freeman in Young, 2000). FGIN-1–27 je pokazal proapoptotično in steroidogeno delovanje (Lacapère in Papadopoulos, 2003). Pred kratkim so poročali, da je FGIN-1-27 in vivo povzročil učinke proti anksioznosti in paniki (Lima-Maximino et al., 2018). Vendar pa o učinku FGIN-1-27 na pigmentacijo in vitro in in vivo niso poročali.

MATERIALI IN METODE

Materiali

FGIN-1-27(N,N-diheksil-2-(4-fluorofenil)indol-3-acetamid), OAG (1-Oleoil-2-acetil-sn -glicerol), protitelesa proti PKC- (1:200), p-PKA cat (fosfo T197)(1:200), PKA mačka (1:500), p-CREB (1:200), CREB (1:200), p-ERK(1:200), ERK (1:200), p-p38 (1:200), p38 (1:200), p-JNK (1:200),in JNK (1:200) sta bila pridobljena pri Santa Cruz Biotechnology(CA, ZDA). Tirozinaza iz gob, -MSH, ET-1(Endothelin-1) in PTU(N-Phenylthiourea) sta bila pridobljenaod Aladdin (Šanghaj, Kitajska). Protitelesa protitirozinaza (1:1,000), TRP-1(1:1,000), TRP-2 (1:1,000), MITF(1:2000) in -aktin (1:3, 000) so bili pridobljeni iz Abcam(Cambridge, Velika Britanija). Masson-Fontana raztopina za barvanje melaninaje bilo kupljeno pri SenBeiJia Biological Technology (Nanjing,Kitajska). Kompleti RT-qPCR so bili kupljeni pri Takara BiomedicalTehnologija (Peking, Kitajska). Pufer za celično lizo in BCA proteinkomplet za analizo so pridobili pri Beyotime Biotechnology (Šanghaj,Kitajska).

Kultura celic

Test viabilnosti celic

Viabilnost celic SK-MEL-2 in HEM smo izmerili s testom MTT (Zhou et al., 2014). Celice SK-MEL-2 in HEM so bile posajene v 96-plošče z vdolbinicami pri gostoti 2 × 104 celic na vdolbinico. FGIN-1-27 (0, 1, 2, 4, 8, 16 μM) smo 48 ur nanesli na celice SK-MEL-2 in HEM. V vsako vdolbino 96-plošče z vdolbinicami smo še 4 ure dodajali raztopino MTT (20 μL). Po odstranitvi raztopine smo v vsako vdolbinico dodali DMSO (200 μL) in preiskali absorbanco pri 570 nm z uporabo spektrofotometra za mikroploščo (BioTek Instruments).

Test melanina

Celice SK-MEL-2 in HEM so bile posajene v 6-plošče z vdolbinicami pri koncentraciji 5×105 celic na vdolbinico. Po 24 urah inkubacije pri 37 stopinjah smo na celice SK-MEL-2 in HEM nanesli FGIN-1-27 (0, 1, 2, 4 μM). Celice smo inkubirali nadaljnjih 48 ur, jih sprali s PBS, čemur je sledila liza s pufrom za celično lizo 20 minut pri 4 stopinjah C in lizate centrifugirali pri 13,000 obratih na minuto 10 minut pri 4 stopinjah C. Skupni melanin v celični peleti je bil raztopljen v 100 μL raztopine NaOH (1 mol/L, ki vsebuje 10 odstotkov DMSO) pri 80 stopinjah C za 1 uro (Lv et al., 2015). Optično absorbanco smo izmerili pri 405 nm s spektrofotometrom za mikroploščo (BioTek Instruments).

Test aktivnosti tirozinaze

Aktivnost celične tirozinaze je bila izvedena, kot je opisano prej (Lv et al., 2020). Celice SK-MEL-2 so bile 12 ali 48 ur inkubirane z različnimi koncentracijami FGIN-1-27 (0, 1, 2, 4 μM) ali OAG (200 μM) in nato lizirane s pufrom za lizo celic. Celične lizate centrifugiramo pri 13,000 obratih na minuto 10 minut pri 4 stopinjah C, da dobimo supernatant za test aktivnosti tirozinaze. Koncentracije beljakovin so bile določene s kompletom BCA z govejim serumskim albuminom (BSA) kot standardom. 100 μL PBS (0,1 M, pH 6,5), ki je vseboval 30 ug proteinov, pomešanih s 100 μL L-DOPA (0,1 odstotka) in nato inkubiranih pri 37 stopinjah C 1 uro. Optično absorbanco smo izmerili pri 475 nm s spektrofotometrom za mikroploščo (BioTek Instruments).

Neposredni učinek FGIN{{0}} na aktivnost tirozinaze je bil izveden v skladu s prejšnjo metodo (Tomita et al., 2010; Lv et al., 2020). 100 μL PBS (0,1 M, pH 6,5), ki vsebuje različne koncentracije FGIN-1-27, pomešanega z gobjo tirozinazo (10 enot) in 50 μL L-tirozina (0,05 odstotka) in nato inkubirano pri 37 stopinjah 10 minut. Optično absorbanco smo izmerili pri 475 nm s spektrofotometrom za mikroploščo (BioTek Instruments).

Masson–Fontana barvanje z amoniačnim srebrom

Za detekcijo pigmenta melanina smo celice SK-MEL-2 nanesli na 6-ploščo z vdolbinicami, ki je vsebovala 13-mm steklena pokrovna stekelca v 2.0 ml gojišča kulture (10 % fetalnega govejega seruma) v vsako vdolbinico. 48 ur po dajanju so bile celice 20 minut fiksirane s formalinom (10-odstotno nevtralno pufrano).

Celice in preparati kože so bili obarvani po metodi obarvanja z amonijevim srebrom Masson–Fontana (Lee et al., 2013). Celice in kožna stekelca smo inkubirali z raztopino za barvanje melanina Masson-Fontana 16 ur pri sobni temperaturi. Nato smo celice in kožna stekelca 3-krat splaknili z destilirano vodo in 7 minut inkubirali s hipo raztopino. Po temeljitem pranju v destilirani vodi so bile celice in kožna stekelca obarvani z nevtralnim rdečim madežem 7 minut. Celice in preparate kože smo opazovali z mikroskopom Nikon Ti2-U.

Imunohistokemija za S-100

Imunohistokemija S-100 je bila izvedena, kot je opisano prej (Lee et al., 2013). Predmetna stekelca so blokirali s 5 odstotki BSA 1 uro pri sobni temperaturi in nato inkubirali v primarnem protitelesu proti S-100 (Dako, Carpentaria, CA), razredčenem v raztopini za blokiranje, čez noč pri 4 stopinjah C. Naslednji dan so predmetna stekelca 4-krat sprali s TBST in inkubirali s sekundarnim protitelesom (Dako, Carpentaria, CA). Nato smo preparate obdelali z aminoetil karbazolom, da smo razvili reze. Kožna stekelca so opazovali z mikroskopom Nikon Ti2-U.

Reverzna transkripcija-kvantitativni PCR (RT-qPCR)

RT-qPCR je bil izveden, kot je opisano prej (Lv et al., 2020). Na kratko, celotno RNK celic SK-MEL-2 smo ekstrahirali z reagentom TRIzol in kvantificirali spektrofotometrično. Enoverižna cDNA je bila sintetizirana z uporabo reverzne transkriptaze SuperScript II po navodilih proizvajalca. Kvantitativno PCR analizo SYBR-Green smo izvedli s sistemom za odkrivanje zaporedja ABI PRISM (Applied Biosystems) in predhodno validiranimi kompleti primerjev. Vsi vzorci so bili testirani v treh izvodih. Mejne cikle smo umestili v logaritemski del krivulje pomnoževanja in rezultate normalizirali na GAPDH. Kratno razliko med obema vzorcema smo določili z metodo delta-delta Cq. Zaporedja primerjev gena Mitf so 5′-AGAGCAGGGCAGAGAGTGAGTG-3′, 5′-AACTTGATT CCAGGCTGATGATGTC-3′.

Western blot analiza

Proteinsko suspenzijo smo dobili po zgoraj omenjeni metodi. Ekstrahirane intracelularne beljakovine (30 ug) smo ločili s SDS-PAGE (10 odstotkov) in nato prenesli na membrano iz poliviniliden L fluorida (PVDF) po standardnem protokolu mokrega prenosa. Membrana je bila blokirana z 2,5-odstotnim BSA pri sobni temperaturi 1 uro, izpostavljena ustreznim primarnim protitelesom pri 4 stopinjah C čez noč in 4-krat sprana s TBST. Membrane so bile 1 uro izpostavljene s HRP označenim kozjim protizajčjim IgG (1:1, 000) ali kozjim protimišjim IgG (1:1, 000) pri sobni temperaturi in sprane z TBST 4-krat (Liao et al., 2017). Membrane smo nato vizualizirali z uporabo večnamenskega kemiluminiscenčnega slikovnega sistema (Tanon 4600). Notranje kontrole iz istega madeža so bile testirane z antiaktinom.

Vrednotenje na osnovi fenotipa in določanje vsebnosti melanina pri cebricah

Odrasle ribe cebrice so hranili v akvariju z naslednjimi pogoji: 28,5 stopinj, s 14/10 h ciklom svetloba/tema. Zarodki so bili pridobljeni iz naravnega drstenja, ki smo ga sprožili zjutraj s prižigom luči. Zbiranje zarodkov je bilo končano v 30 minutah. Vrednotenje na podlagi fenotipa je bilo izvedeno, kot je opisano prej (Choi et al., 2007). Na kratko, sinhronizirane zarodke smo zbrali in razvrstili s pipeto (3-4 zarodkov na vdolbino v 96-ploščah z vdolbinicami, ki vsebujejo 200 ul medija zarodkov). FGIN-1-27 in PTU sta bila raztopljena v 0,1-odstotnem DMSO, nato dodana v medij zarodka od 35 do 60 ur (25-urna izpostavljenost). Pod stereomikroskopom so opazili učinke na melanogenezo cebric.

Model morskega prašička z UVB povzročeno hiperpigmentacijo

Osem rjavih morskih prašičkov (6 tednov, približno 300 g) je bilo pridobljenih z Inštituta za laboratorijsko živalsko znanost (Peking, Kitajska). Morski prašički so bili nameščeni posamezno v prostor z nadzorovano temperaturo v standardnih laboratorijskih pogojih, s ciklom 12 ur svetlobe/12 ur teme (luči prižgane od 9:00 zjutraj do 9:00 popoldne) z konstantna temperatura (23 ± 3 stopinje) in vlažnost (50 ± 10 odstotkov). Ločena območja (1 cm diametralni krog) hrbta vsake živali so bila izpostavljena 500 mJ/cm2 UVB (Sigma SH-4, Šanghaj, Kitajska) enkrat na dan 1 teden (Fujimoto et al., 1988; Lee et al., 2013). Nato smo nosilec (PEG400/EtOH 7:3) in FGIN-1-27 (1 odstotek) dajali hiperpigmentiranim območjem (20 ul raztopine na krog) dvakrat na dan 3 tedne. Stopnja pigmentacije je bila izmerjena s spektrofotometrom (YS3010, 3nh, Shenzhen, Kitajska). ΔL-vrednost je bila določena glede na L-vrednost, izmerjeno s spektrofotometrom, kot sledi: ΔL L (na vsak dan merjenja)-L (na dan 0). Vsi postopki na živalih za to študijo so bili izvedeni v skladu z "Navodilom NIH za nego in uporabo laboratorijskih živali" in odobren s strani odbora za nego in uporabo živali Univerze Changzhou.

Statistična analiza

REZULTATI

FGIN-1-27 inhibirana -MSH, OAG ali ET-1-inducirana sinteza melanina v celicah SK-MEL-2

Pred raziskovanjem učinkov FGIN-1-27 (slika 1A) na pigmentacijo je bil opravljen test viabilnosti celic, da bi preučili učinke FGIN-1-27 na rast celic SK-MEL-2. Kot je prikazano na sliki 1B, FGIN-1-27 ni vplival na rast celic SK-MEL- 2 pri razponu odmerjanja 1–16 μM po 48 urah. V testu vsebnosti melanina je FGIN-1-27 zaviral bazalno melanogenezo (slika 1C). -MSH je dvigovalnik intracelularnega cAMP, ki pomembno inducira melanogenezo (Rzepka et al., 2016; Corre et al., 2004; Lee et al., 2013). FGIN-1-27 je tudi zaviral -MSH-inducirano sintezo melanina (slika 1C). Masson–Fontana barvanje z amonijevim srebrom je dosledno pokazalo, da je FGIN-1-27 znatno zmanjšal koncentracijo melanina v celicah SK-MEL-2 z ali brez -MSH (slika 1D). Poleg tega je OAG dvigalnik PKC, ET-1 pa aktivator poti MAPK, oba pa lahko spodbujata sintezo melanina (Kim et al., 2006; Park et al., 2015; Regazzetti et al., 2015). Kot je prikazano na slikah 1E in 1F, je FGIN-1-27 prav tako izrazito zaviral melanogenezo, ki jo povzroča OAG ali ET-1-.

FGIN-1-27 je zaviral izražanje tirozinaze, TRP-1, TRP-2 in zmanjšal aktivnost celične tirozinaze

Melanogenezo nadzirajo trije ključni encimi: tirozinaza, TRP-1 in TRP-2 (Zhu et al., 2015). -MSH in ET-1 spodbujata sintezo melanina s povečanjem izražanja treh ključnih melanogenih encimov (Regazzetti et al., 2015; Lee et al., 2013). Da bi raziskali, ali so učinki beljenja FGIN-1-27 povezani z izražanjem teh proteinov, smo preučevali učinek FGIN-1-27 na izražanje tirozinaze, TRP-1 in TRP{{10 }} z Western-blot analizo. Kot je prikazano na sliki 2A, je FGIN-1-27 zaviral izražanje tirozinaze, TRP-1 in TRP-2 z ali brez -MSH. FGIN-1-27 je tudi dosledno obrnil ET-1- inducirano povečanje izražanja tirozinaze, TRP-1 in TRP-2 (slika 2B). Za razliko od -MSH in ET-1 je OAG spodbujal melanogenezo z neposrednim povečanjem aktivnosti celične tirozinaze (D'Mello et al., 2016). Kot je prikazano na slikah 2C in 2D, je 12-urno zdravljenje s FGIN-1-27 zaviralo z OAG povzročeno povečanje aktivnosti celične tirozinaze in ni vplivalo na izražanje tirozinaze. Poleg tega je bil opravljen test aktivnosti gobove tirozinaze, da bi preučili neposredne učinke FGIN-1-27 na aktivnost tirozinaze. Kot je prikazano na sliki 2E, FGIN-1-27 ni vplival na encimske aktivnosti gobje tirozinaze. Ti rezultati kažejo, da je FGIN-1-27 zaviral izražanje tirozinaze, TRP-1 in TRP-2 ter zmanjšal aktivnost celične tirozinaze, vendar ni imel neposrednega vpliva na encimske aktivnosti tirozinaze.

FGIN-1-27 Zmanjšal izraz MITF

MITF je glavni transkripcijski faktor, ki inducira izražanje tirozinaze, TRP-1 in TRP-2 (Kawasaki et al., 2008; Levy in Fisher, 2011). Kot je prikazano na sliki 3A, je FGIN-1-27 zaviral transkripcijo MITF. Izmerili smo tudi izražanje MITF po tem, ko smo celice SK-MEL-2 obdelali z -MSH v prisotnosti ali odsotnosti FGIN-1-27. Kot je prikazano na sliki 3B, je -MSH znatno spodbudil izražanje MITF. Zanimivo je, da se je izražanje MITF znatno zmanjšalo v prisotnosti FGIN-1-27. FGIN-1-27 je prav tako dosledno zaviral povečanje izražanja MITF, ki ga povzroča ET-1- (slika 3C). Ti rezultati kažejo, da FGIN-1-27 zavira izražanje MITF.

FGIN-1-27 Zmanjšal izražanje PKC-, p-PKA Cat, p-CREB, p-p38 in p-ERK

PKA, PKC in MAPK so kritične transdukcijske poti v melanogenezi (D'Mello et al., 2016). Drugi messenger cAMP bi lahko aktiviral PKA, ki fosforilira CREB, kar končno spodbuja izražanje MITF (Corre et al., 2004; Rzepka et al., 2016). PKC- -odvisna pot uravnava melanogenezo z aktivacijo tirozinaze (Kim in sod., 2006; Kawaguchi in sod., 2012; Yuan in Jin, 2018). Poročali so, da MAPK, vključno s p38, zunajcelično signalno regulirano proteinsko kinazo (ERK) in c-jun N-terminalno kinazo (JNK), uravnava pigmentacijo (Zhou et al., 2014). Za nadaljnje razumevanje molekularnih mehanizmov regulacije melanogeneze s FGIN-1-27 smo izmerili transdukcijske poti, ki sodelujejo pri pigmentaciji. Kot je prikazano na sliki 4, je FGIN-1-27 izrazito zmanjšal izražanje PKC-, p-PKA cat, p-CREB, p-p38 in p-ERK.

FGIN-1-27 zavira melanogenezo v človeških melanocitih

Inhibicijo FGIN-1-27 na melanogenezo so ocenili v melanocitih človeške povrhnjice (HEM). Kot je prikazano na dodatni sliki S1, FGIN -1-27 po 48 urah ni vplival na rast HEM pri razponu odmerjanja 1–16 μM. Kot je prikazano na sliki 5A, je FGIN-1-27 znatno zaviral melanogenezo v HEM. Western blotting analiza je pokazala, da je FGIN-1-27 zmanjšal ravni izražanja tirozinaze, TRP-1 in TRP-2 v HEM (slika 5B). Kot je prikazano na dodatni sliki S2, je zdravljenje s FGIN- 1-27 12 ur zaviralo povečanje aktivnosti celične tirozinaze v HEM, ki ga povzroča OAG. Poleg tega smo izmerili izražanje MITF po HEM, obdelanem z -MSH v prisotnosti ali odsotnosti FGIN-1-27. Kot je prikazano na sliki 5C, se je izražanje MITF znatno zmanjšalo v prisotnosti FGIN-1-27. Poleg tega je bila, tako kot v celicah SK-MEL-2, vpletenost PKC-, PKA in MAPK v FGIN-1-27-posredovano antimelanogeno delovanje potrjena tudi v HEM (slika 5D).

Za več informacij: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501