Drobni delci 2.5 uravnavajo melanogenezo v celicah človeškega melanoma A375
Jul 19, 2023
Uredniku: Epidemiološke študije so pokazale, da izpostavljenost drobnim trdnim delcem 2,5 (PM2,5) poveča tveganje za hiperpigmentacijo kože.[1] Nedavna študija je dokazala, da lahko PM2.5 inducira melanogenezo z uravnavanjem tirozinaze (TYR) in s tirozinazo povezanih proteinov 1 (TYRP1) in 2 (TYRP2) preko arilnega ogljikovodikovega receptorja (AhR)/mitogen-aktivirane proteinske kinaze, ki signalizira aktivacijo.[ 2] AhR je zelo razširjen v kožnih celicah in njegova ligacija nadzoruje oksidacijo/antioksidacijo, funkcijo epidermalne pregrade, foto-induciran odziv, prirojeno imunost in melanogenezo. Lahko ga aktivirajo dioksin in policiklični aromatski ogljikovodiki (sestavine PM2,5), njegova aktivacija pa inducira transkripcijo genov, ki kodirajo ksenobiotične presnovne encime faze I in faze II (citokromi P450 [CYP] 1A1, CYP1A2 in CYP1B1). [3,4] BaP in nevarni dioksini aktivirajo AhR z močnim nastajanjem reaktivnih kisikovih vrst (ROS), ki jih vsaj delno posreduje CYP1A1. Poleg tega je oksidativni stres, ki ga posreduje CYP1A1-, odgovoren za nastajanje vnetnih citokinov, kot so interlevkin (IL)-1, IL-6 in IL-8 v okolju. človeških keratinocitov, obdelanih s kontaminanti [3,5] Vendar pa obstaja zelo malo študij o toksičnih učinkih PM2.5 na melanogenetske celice. Tu smo obdelali celice človeškega melanoma A375 z različnimi koncentracijami PM2.5, da bi raziskali, ali lahko PM2.5 spodbuja melanogenezo in njegovo povezavo s signalizacijo AhR, oksidativnim stresom in vnetnim odzivom.
Glikozid cistanche lahko tudi poveča aktivnost SOD v srčnem in jetrnem tkivu ter znatno zmanjša vsebnost lipofuscina in MDA v vsakem tkivu, učinkovito lovi različne reaktivne kisikove radikale (OH-, H₂O₂ itd.) in ščiti pred povzročeno poškodbo DNK z OH-radikali. Cistanche feniletanoidni glikozidi imajo močno sposobnost lovljenja prostih radikalov, večjo redukcijsko sposobnost kot vitamin C, izboljšajo aktivnost SOD v suspenziji semenčic, zmanjšajo vsebnost MDA in imajo določen zaščitni učinek na delovanje membrane semenčic. Cistanche polisaharidi lahko povečajo aktivnost SOD in GSH-Px v eritrocitih in pljučnem tkivu eksperimentalno starajočih se miši, ki jih povzroča D-galaktoza, pa tudi zmanjšajo vsebnost MDA in kolagena v pljučih in plazmi ter povečajo vsebnost elastina. dober čistilni učinek na DPPH, podaljša čas hipoksije pri starajočih se miših, izboljša aktivnost SOD v serumu in upočasni fiziološko degeneracijo pljuč pri eksperimentalno starajočih se miših. Pri celični morfološki degeneraciji so poskusi pokazali, da ima Cistanche dobro antioksidativno sposobnost in ima potencial, da postane zdravilo za preprečevanje in zdravljenje bolezni staranja kože. Hkrati ima ehinakozid v Cistanche pomembno sposobnost čiščenja prostih radikalov DPPH in ima sposobnost čiščenja reaktivnih kisikovih vrst ter preprečuje razgradnjo kolagena, ki jo povzročijo prosti radikali, ima pa tudi dober učinek popravljanja na poškodbe anionov prostih radikalov timina.
Kliknite na dodatek Cistanche Tubulosa
【Za več informacij:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】
PM2,5 so zbirali pozimi (od decembra do januarja) v Pekingu. HY-1000 inteligentni vzorčevalnik skupnih suspendiranih delcev (TSP) z velikim pretokom (izbirni rezalnik PM2,5, Qingdao Hengyuan Technology Development Co., Ltd., Qingdao, Kitajska) je bil uporabljen za vzorčenje s kvarčnim filtrom. Kvarčno membrano smo potopili v 75-odstotni etanol, čemur je sledilo ultrazvočno stresanje. Za pripravo osnovne raztopine z visoko koncentracijo smo uporabili sterilno vodo. Celice človeškega melanoma A375 smo gojili v 5 odstotkih CO2 pri 37 stopinjah v običajnem Dulbeccovem modificiranem mediju Eagle (Invitrogen Co., Ltd., Carlsbad, CA, ZDA), ki je vseboval fetalni goveji serum (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, ZDA). Celice A375 smo 24 ur obdelali z različnimi koncentracijami PM2.5 (0, 100, 200 in 400 ug/mL) in celice uporabili za naslednje študije. Za statistično analizo sta bila uporabljena neparni Studentov t-test in enosmerna analiza variance, P <0,05 pa je veljal za statistično značilen.
Da bi raziskali vpliv PM2.5 na celice A375, smo zaznali celično proliferacijo s kompletom CCK-8 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA), celično apoptozo pa smo zaznali z aneksin V fluorescein izotiocianatom/ komplet za apoptozo s propidijevim jodidom (FITC/PI) (Multisciences, ZDA), ki temelji na navodilih proizvajalca. Rezultati so pokazali, da je PM2.5 pokazal od koncentracije odvisno citotoksičnost za celice A375, vendar ni vplival na apoptozo [dodatna slika 1, http://links.lww.com/CM9/A917].
Za določanje vsebnosti melanina smo uporabili metodo NaOH. Celice A375, obdelane s PM2.5-, smo sprali s fiziološko raztopino s fosfatnim pufrom (PBS) in lizirali z vodo. Lizate centrifugiramo pri 12, 000 vrt/min 5 minut, speremo z 10 odstotno trikloroocetno kislino (500 mL) (Sigma, St. Louis , MO, ZDA) in 75-odstotnim etanolom (500 ml) in nato ponovno zbistrili. Nato smo peletom za 1 uro pri 80 stopinjah dodali 50 ml 1 mol/L NaOH, ki je vseboval 10 odstotkov dimetil sulfoksida. Absorbanco pri 490 nm (OD 490) smo izmerili s čitalnikom mikroplošč. Ker je TYR najpomembnejši melanogeni encim, smo nato aktivnost TYR odkrili s testom levodope (L-DOPA). Plošče Sixwell (Corning, ZDA) so bile zasejane s celicami A375 pri gostoti 3 105 celic/jamico. Celice smo nato sprali s PBS in lizirali z 0,5-odstotnim natrijevim deoksiholatom (Sigma). Lizat smo razdelili v tri skupine in vsakemu vzorcu dodali 0,1 odstotka L-DOPA (Sigma). Po 5 minutah smo izmerili OD 490 in kot standard uporabili 0,1 % L-DOPA. Izmerili smo tudi ravni ekspresije mRNA in beljakovin TYR. Celotno RNA smo ekstrahirali z uporabo mini kompleta RNeasy (Qiagen, Valencia, CA, ZDA). Reverzna transkripcija je bila izvedena z uporabo kompleta ReverTra Ace qPCR RT (TOYOBO, Japonska). Nato je bila izvedena kvantitativna verižna reakcija polimeraze v realnem času (qRT-PCR) na Bio-Rad CFX96 TouchTM Realtime PCR Master Mix (TOYOBO, Japonska). Primerji iz Invitrogena so predstavljeni v dodatni tabeli 1, http://links. lww.com/CM9/A917, raven izražanja vsake mRNA pa je bila izračunana z uporabo metode 2*DDCT. Raven ekspresije proteina je bila analizirana z Western blotom. Celice smo sprali s PBS in lizirali v pufru RIPA (Beyotime, Kitajska), ki je vseboval fenilmetilsulfonil fluorid (mešanica inhibitorjev proteaz, 20:1, Sigma-Aldrich). Koncentracije beljakovin so bile izmerjene s kompletom za analizo beljakovin BCA (Beyotime, Kitajska). Celoten protein je bil kuhan pri 70 stopinjah 10 minut, ločen v 4- do 12-odstotnem gelu pri 200 V 40 minut, prenesen na membrano pri 4 stopinjah z uporabo 120 mA 75–100 minut in nato inkubiran s 5 odstotki nemastnega mleka 1 uro. Membrane so bile nato testirane s protitelesi anti-TYR, anti-AhR, anti-CYP1A1 in anti-CYP1B1 (Abcam) čez noč pri 4 stopinjah. Kot sekundarno protitelo smo uporabili s hrenovo peroksidazo konjugirano protitelo proti miši IgG (Proteintech, ZDA). Rezultati so pokazali, da je PM2,5 povečal vsebnost melanina in aktivnost TYR v odvisnosti od odmerka. Tako ravni ekspresije mRNA kot beljakovin TYR so bile regulirane [dodatna slika 2 A–D, http://links.lww.com/CM9/A917].
PM2.5 lahko poveča aktivnost TYR z aktiviranjem poti AhR. Da bi ugotovili, ali PM2.5 vpliva na signalizacijo AhR, smo s qRT-PCR in western blottingom odkrili ravni transkripcije AhR in njegovih klasičnih spodnjih genov CYP1A1 in CYP1B1. Rezultati so pokazali, da je PM2.5 dvignil nivoje ekspresije mRNA AhR in CYP1A1, kot tudi ekspresijo proteina CYP1A1 [dodatna slika 2 E–G, http://links.lww.com/CM9/A917].
Aktivacija AhR povzroči nastanek ROS, kar lahko poveča tudi aktivnost TYR.[5] Zato smo ovrednotili proizvodnjo ROS z uporabo 20,70 -diklorofluorescein diacetata (DCFHDA) in pretočne citometrije. Po 24 urah obdelave s PM2.5 smo celice A375 inkubirali z DCFH-DA (5 mmol/L) 30 minut pri 37 stopinjah v temi. Celice smo dvakrat sprali v PBS in izmerili fluorescenco s pretočnim citometrom. Srednja intenzivnost fluorescence je bila kvantificirana s programsko opremo FACS Diva 6.0 (BD Bioscience, New York, NY, ZDA). Ker naj bi bila proizvodnja ROS, ki jo povzroči CYP1A1-, odgovorna za vnetni odziv [5], so stopnje izražanja mRNA provnetnih citokinov (IL-1a, IL-6, IL{ {19}} in faktor tumorske nekroze [TNF]-a). Ugotovljeno je bilo, da je PM2.5 povečal proizvodnjo ROS, pa tudi ravni mRNA IL-1a, IL-6 in IL-8 v celicah A375 [dodatna slika 2 H in I, http ://povezave. lww.com/CM9/A917].
Ugotovitve te študije so pokazale, da PM2.5 spodbuja melanogenezo in povečuje aktivnost in izražanje TYR v celicah A375. Poleg tega bi lahko PM2.5 aktiviral signalizacijo AhR in induciral oksidativni stres in vnetni odziv, ki je lahko melanogena signalna kaskada, odgovorna za hiperpigmentacijo.
Zahvala
Iskreno se zahvaljujemo naslednjim: prof. dr. Masutaka Furue in prof. dr. Tsuji Gaku iz univerzitetne bolnišnice Kyushu, ki sta izboljšala rokopis in pomagala z informacijami, povezanimi z AhR. Hvaležni smo tudi za angleško urejanje, ki ga je zagotovil prof. dr. Robert Schwartz z medicinske šole Rutgers New Jersey.
financiranje
To študijo je podprla donacija Nacionalne naravoslovne fundacije Kitajske (št. 2101000271).
Nasprotja interesov
Noben.
Reference
Peng F, Xue CH, Hwang SK, Li WH, Chen Z, Zhang JZ. Izpostavljenost drobnim trdnim delcem, povezana s senilnim lentigom pri kitajskih ženskah: presečna študija. J Eur Acad Dermatol Venereol 2016;31:355–360. doi: 10.1111/jdv.13834.
Shi Y, Zeng Z, Liu J, Pi Z, Zou P, Deng Q, et al. Trdni delci spodbujajo hiperpigmentacijo prek aktivacije signala AhR/MAPK in z zvišanjem parakrinih ravni a-MSH v keratinocitih. Onesnaževanje okolja 2021; 278: 116850. doi: 10.1016/j.envpol.2021. 116850.
Peng F, Tsuji G, Zhang JZ, Chen Z, Furue M. Potencialna vloga PM2.5 v melanogenezi. Environ Int 2019; 132: 105063. doi 10.1016/j. envint.2019.105063.
Napolitano M, Patruno C. Arilni ogljikovodikov receptor (AhR) možna tarča za zdravljenje kožnih bolezni. Med hipoteze 2018; 116: 96–100. doi: 10.1016/j.mehy.2018.05.001.
Dijkhoff IM, Drasler B, Karakocak BB, Petri-Fink A, Valacchi G, Eeman M, et al. Vpliv trdnih delcev v zraku na kožo: sistematičen pregled od epidemiologije do študij in vitro. Del Fiber Toxicol 2020; 17:35. doi 10.1186/s12989-020-00366-y.
【Za več informacij:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】
