Fisetin oslabi z lipopolisaharidi povzročene vnetne odzive v makrofagih

Za več informacij kontaktirajtetina.xiang@wecistanche.com

Več študij je poročalo o učinkovitosti in varnosti polifenolov za zdravje ljudi; vendar preverjanje njihove učinkovitosti ostaja nezadostno. Namen te študije je bil preučiti, ali lahko fisetin, eden od flavonoidov, ki so pretežno prisotni v sadju in zelenjavi, zavre lipopolisaharide (LPS-)vnetnaodzivi v makrofagih. LPS je povečal številčnost vnetne mRNA （MCP 1, IL-1ß in iNOS）, vendar jih je fisetin zavrl. Povečanje dušikovega oksida z LPS, faktorjem oksidativnega stresa, je oslabil fisetin. Poleg tega se je zmanjšala fosforilacija z mitogenom aktivirane proteinske kinaze (ERK in JNK), povečana z LPS. Nazadnje je fisetin oslabil izražanje ali aktivnost uPA, uP AR, MMP-2 in MMP-9, ki so znani kot povezani dejavniki rekrutacije ali infiltracije makrofagov. V zaključku,fizetinje obetavno terapevtsko sredstvo za vnetne bolezni, povezane z makrofagi, kot sta sepsa in ateroskleroza.

Kliknite tukaj, če želite izvedeti več informacij.

1. Uvod

Terapevtska uporaba naravnih sestavin je v zadnjih dveh desetletjih pridobila večjo pozornost. Na podlagi njihove velike učinkovitosti in nizke toksičnosti je 40 odstotkov terapevtskih sredstev, ki jih je odobrila FDA, sestavine naravnega izvora ali njihovi derivati ​​[1]. Toksičnost, povezana z drugimi zdravili, so uspešno preprečili različni naravni proizvodi [2]. Zato je zelo pomembno in pomembno nadaljevati raziskovanje naravnih spojin rastlinskega izvora.

Polifenoliso rastlinski sekundarni metaboliti in so široko prisotni v hrani in pijači rastlinskega izvora, sadju, zelenjavi, začimbah, čaju in vinu. Čeprav ne veljajo za bistvena mikrohranila, več vrst literature dokazuje njihove ugodne učinke na zdravje ljudi, zlasti pri dietah, povezanih z velikim uživanjem sadja in zelenjave [3-5]. V desetletjih so bile izvedene številne študije za raziskave farmakoloških učinkov polifenolov, ki kažejo na koristi za zdravje. Vse več dokazov je pokazalo, da imajo nekateri polifenoliprotivnetnolastnosti

[6-8]. Poleg tega so nedavne študije pokazale, da lahko več vrst polifenolov zavira regulativne encime ali transkripcijske faktorje, ki sodelujejo pri vnetju [9].

Prehrana vpliva na različne stopnje vnetja in dokazuje pomemben vpliv na številne vnetne bolezni [10,11]. Vnetje ima ključno vlogo pri razvoju bolezni, kot so sladkorna bolezen, astma, srčno-žilne bolezni in rak [12]. Zato lahko obvladovanje vnetja prepreči te bolezni. Ker so makrofagi glavni mediatorji vnetja, imajo različne funkcije pri tkivni homeostazi in vnetju. Tako so sredstva, ki učinkovito modulirajo njihove funkcije, velike klinične vrednosti, saj lahko nenormalna aktivacija makrofagov povzroči škodljive imunske odzive. Trenutna tendenca raziskav jasno kaže, da so naravni izdelki eden najpomembnejših virov novih zdravil [13].

En polifenol, isetin (3,3',4',7-tetrahidroksiflavon), je bogato prisoten v jagodah, jabolku, paradižniku, čebuli, pomarančah, breskvah, grozdju, kiviju, kakiju, čaju in vinu [14] . Do sedaj je fisetin poročal o močnem protivnetnem [15-17],

antioksidativni [18], protitumorski [19, 20, antiangiogeni [21], antidiabetični [22], nevroprotektivni [23] in kardioprotektivni učinki [24] tako v celični kulturi kot na živalskih modelih, pomembnih za človeške bolezni. Čeprav ima fisetin številne fiziološke učinke, o njegovem učinku na makrofage ni veliko poročil.

V tej študiji smo raziskali ugodne učinke fisetina na vnetni odziv makrofagov, ki jih aktiviralipopolisaharid(LPS).

2. Materiali in metode

2.1. Izolacija rezidentnih peritonealnih makrofagov.

Miši BALB/c so bile pridobljene z Inštituta za medicinske znanosti Univerze v Tokiu in vzdrževane v Centru za živalske vire Univerze Okayama. Vsi poskusi na živalih so bili izvedeni v skladu s smernicami NIH (Vodnik za nego in uporabo laboratorijskih živali). Eksperimentalni protokol so odobrili odbori za etično presojo poskusov na živalih Podiplomske šole za medicino, zobozdravstvo in farmacevtske znanosti Univerze Okayama (OKU-2018449). Vse miši so bile vzdrževane v pregradnem objektu in hranjene z običajno laboratorijsko prehrano. Samci in samice miši BALB/c, stare 16 ± 4 tedne, so bili anestezirani z izofluranom in evtanazirani z dislokacijo materničnega vratu. Makrofage smo pobrali s peritonealno lavažo z uporabo fiziološke raztopine (5 ml). Raztopino peritonealne lavaže centrifugiramo pri 1500 obratih na minuto 5 minut. Usedlino smo suspendirali v malo DMEM (SIGMA, kat. št. D6046). Rdeče krvne celice so bile lizirane z raztopino amonijevega klorida. Število makrofagov je bilo izračunano s hemocitometrom, nato resuspendirano v DMEM, ki je vseboval toplotno inaktiviran FBS (10 odstotkov vv), penicilin (10 U/mL) in streptomicin (10 mg/mL), ter naneseno v 6-vdolbinico plošče (Corning Incorporated, kat. št. 3516) [25,26].

2.2. Pogoji celične kulture.

Po nočnem stradanju v serumu so makrofage inkubirali z izbranimi koncentracijami fisetina (10, 30 in 100 μM); SIGMA, kat. št. F4043) ali nosilec 3 ure in inkubiramo v prisotnosti ali odsotnosti LPS (10 ng/mL; SIGMA, kat. št. L4391) ustrezen čas. Nato smo zbrali medij in celice. Medij je bil uporabljen za test dušikovega oksida (NO) in želatinsko zimografijo. Celični lizati so bili uporabljeni za kvantitativno verižno reakcijo s polimerazo (qPCR) in western blot.

2.3. Verižna reakcija s polimerazo v realnem času.

mRNA smo ekstrahirali iz makrofagov z uporabo RNeasy Mini Kits (QIAGEN, kat. št. 74104). Reverzno transkripcijo smo izvedli z uporabo iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, kat. št. 1708891). qPCR je bil izveden s sistemom ABI Step One za PCR v realnem času (Applied Biosystems, QuantStudio 3) z uporabo hitre mešanice PCRM v realnem času SYBR Green (Applied Biosystems, kat. št. 4385612) [27]. Primerji za monocitni kemotaktični protein 1 (MCP-1) (Takara Bio Inc., kat. št. MA066003), interlevkin 1 beta (IL-1 ) (Takara Bio Inc., kat. št. MA025939), inducibilna sintaza dušikovega oksida (iNOS) (Takara Bio Inc., kat. št. MA083369), matrična metaloproteinaza-(MMP-)2 (Takara Bio Inc., kat. št. MA127110), MMP-9(Takara Bio Inc. ., Kat. št. MA031311) in 18S ribosomska RNA (18S) (Takara Bio Inc., Kat. št. MA050364) sta bili komercialno dostopni. Vsak vzorec je bil normaliziran na vrednosti za izražanje mRNA 18S (metoda AACT) [27].

2.4. Test dušikovega oksida.

Supernatante posamezne celične kulture smo zbrali in centrifugirali 10 minut pri 14,000rpm pri 4 stopinjah. Nato smo supernatant uporabili za test dušikovega oksida (NO). Test NO je bil izveden, kot je opisano v komercialno dostopnih kompletih (BioAssay Systems, kat. št. D2NO-100). Komplet za testiranje dušikovega oksida QuantiChrom podjetja BioAssay Systems je kolorimetrični test za določanje proizvodnje NO po redukciji nitrata v nitrit z uporabo izboljšane Griessove metode.

2.5. Western Blotting.

Celocelične beljakovine smo ekstrahirali iz makrofagov z liznim pufrom (Cell Signaling, kat. št. 9803). Vsak vzorec smo nanesli v 10-odstotno SDS-PAGE in prenesli na membrano iz poliviniliden fluorida, imunoblotirano s primarnimi protitelesi (fosforilacija zunajcelične signalno regulirane kinaze (p-ERK); Cell Signaling, kat. št. 9101, fosforilacija c-Jun N-terminalna kinaza (p-JINK); Celična signalizacija, Kat. št. 9251, aktivator plazminogena urokinaze (uPA); Abcam, Kat. št.

ab20789, aktivator plazminogena urokinaze in receptor (uPAR); R&D, kataloška št. AF534 in -aktin; Sigma Cat. št. A5441)[28]. Membrane smo nato inkubirali z ustreznimi sekundarnimi protitelesi in imunske komplekse vizualizirali s kemiluminiscenco (Merck Millipore, kat. št. WBLUF0100, kat. št. WBLUC0100) in kvantificirali z uporabo General Electric Imager (GE Healthcare, LAS4000 mini) [29].

2.6. Želatinska zimografija.

Supernatante celične kulture smo v neredukcijskih pogojih raztopili s SDS-PAGE (10 odstotkov m/vol), polimerizirano v prisotnosti želatine (0,1 odstotka m/m), da bi ocenili aktivnosti MMP{ {4}}. Gele smo spirali s Triton X-100 (2,5 odstotka vol/vo) 60 minut in destilirano vodo 15 minut dvakrat. Gele smo nato čez noč inkubirali pri 37 stopinjah Cin 50 mM Tris pufra, ki je vseboval kalcijev klorid (5 mM) pH 8,0. Po inkubaciji smo gele obarvali s Coomassie Brilliant Blue R-250 (Bio-Rad, kat. št.{ {18}}) 30 minut pri sobni temperaturi, nato pa sledi razbarvanje z raztopino za razbarvanje Coomassie Brilliant Blue R-250 (Bio-Rad, kat. št.161-0438), dokler se ne pojavijo jasni trakovi. Slike gela so bile kvantificirane z uporabo General Electric Imager (GE Healthcare, LAS 4000 mini); neobarvane, prosojne prebavljene regije so predstavljale področja aktivnosti MMP [30].

2.7. Statistika.

Vse statistične analize so bile izvedene z uporabo Sigma Plot v14.0(Systat Software Inc, Kalifornija, ZDA). Podatki so predstavljeni kot povprečje ± standardna napaka povprečja. Statistični pomen med več skupinami je bil ocenjen z enosmerno ali dvosmerno analizo variance, ki ji je sledil Holm-Sidakov post hoc test ali Student-Newman-Keulsov post hoc test. pvalue<0.05 was="" considered="" statistically="">

3. Rezultati

3.1. Fisetin je oslabil vnetne mediatorje v makrofagih, stimuliranih z LPS.

Ker aktivirani makrofagi proizvajajo proinflamatorne citokine in vnetne mediatorje, kot je NO[8], smo preučevali učinke fisetina na vnetne mediatorje v makrofagih, stimuliranih z LPS. Najprej, da bi preučili, ali ima fisetin protivnetni učinek na transkripcijski ravni, smo določili nivoje izražanja mRNA A vnetnih genov, kot so MCP-1, IL-1 in iNOS (slika 1(a) ). Kot je bilo pričakovano, je ekspresijo teh vnetnih genov zavrl fisetin na način, odvisen od odmerka. Da bi potrdili, ali fisetin zavira vnetni odziv v makrofagih, smo ocenili njegovo sposobnost zaviranja proizvodnje NO v makrofagih, zdravljenih z LPS (slika 1 (b)). Kot je bilo pričakovano, je fisetin zmanjšal proizvodnjo NO na način, ki je odvisen od odmerka.

3.2. Fisetin zmanjša z mitogenom aktivirano protein kinazo v makrofagih, stimuliranih z LPS.

Ker so poročali, da fisetin zavira poti protein kinaze, aktivirane z mitogenom (MAPK) v različnih vrstah celic [31, 32], smo preučili učinke fisetina na MAPK v makrofagih. Najprej so opazili aktivacijo MAPK, ki jo inducira LPS v makrofagih (slika 2(a)). Povečanje p-ERK z LPS je doseglo vrh 15 minut po stimulaciji, medtem ko je povečanje p-JNK z LPS doseglo vrh po 30 minutah. Tako smo v naslednjih poskusih makrofage stimulirali z LPS 30 minut. Sočasno zdravljenje s fisetinom je znatno zmanjšalo povečanje p-ERK in p-JNK, ki ga povzroči LPS (sliki 2(b) in 2(c)).

3.3. Fisetin zmanjša uPA in uPAR v makrofagih, stimuliranih z LPS.

Aktivacija makrofagov je tesno povezana z invazivnostjo celic. Poleg tega uPA in uPAR v makrofagih prispevata k infiltraciji celic. Tako je bil raziskan učinek fisetina na izražanje uPA in uPAR. LPS je povzročil številčnost beljakovin uPA (slika 3(a)) in uPAR (slika 3(b)). Sočasno zdravljenje s fisetinom je zmanjšalo povečanje uPA (slika 3(a)) in uPAR z LPS (slika 3(b)).

3.4. Fisetin zmanjša MMP-2 in MMP-9 v makrofagih, stimuliranih z LPS.

Poleg tega smo za pojasnitev učinka fise-tin na MMP preučili izraze MMP-2 in MMP-9, mediatorja uPA/uPAR na nižji stopnji. Kar zadeva raven mRNA, je LPS znatno povečal izražanje mRNA MMP-2 in MMP-9 v primerjavi z zdravljenjem z vehiklom (slika 4(a)). Fisetin je zmanjšal povečanje teh genskih izražanj MMP-2 ali MMP9, induciranih z LPS, na način, ki je odvisen od odmerka (slika 4(a)). Poleg tega so bile proteinske aktivnosti MMP-9 ovrednotene z zimografijo (slika 4(b)). Proteinske aktivnosti MMP-9(92kDa) so bile povečane s stimulacijo LPS, ki se je zmanjšala s fisetinom (slika 4(b)).

4. Razprava

Ugotovili smo pomemben učinek fisetina proti vnetju v makrofagih. Ta študija je pokazala, da je fisetin oslabil indukcijo vnetnih komponent, kot so MCP-1, IL-1, iNOS in NO, ki jih inducira LPS v makrofagih. Poleg tega je fisetin zaviral aktivacijo MAPK in oslabil z LPS povzročeno povečanje izražanja uPA in uPAR. Poleg tega je fisetin oslabil povečanje številčnosti mRNA MMP-2 in MMP-9 ter aktivnost MMP-9.

Pri sepsi, ki jo povzroča gram-negativna okužba, je LPS splošno prepoznan kot povzročitelj sepse. V številnih študijah je bil LPS uporabljen kot model sepse in vnetja. Poleg tega kronično vnetje povzroči zgodnji rak z aktivacijo vnetnih celic in nepravilno proizvodnjo vnetnega mediatorja, kot je iNOS, in transkripcijskih faktorjev, kot je jedrski transkripcijski faktor kappa B (NF-xB) [33]. Poleg tega so poročali tudi, da se oksidativni stres zmanjša z zmanjšanjem izražanja iNOS [34]. Naša študija je pokazala, da je lahko fisetin učinkovit pri preprečevanju in zdravljenju sepse in septičnega šoka zaradi supresivnega učinka na številčnost mRNA provnetnih genov in produkcijo NO. V tej študiji je fisetin zaviral nastajanje NO z zmanjšanjem izražanja mRNA proinflamatornega gena (iNOS); zato je bilo verjetno, da je fisetin zmanjšal oksidativni stres. Posledično so ti rezultati podprli protivnetne, protitumorske in antioksidativne učinke fisetina.

Več študij je poročalo, da LPS inducira fosforilacijo MAPK, vključno z ERK in JNK [35]. Poleg tega so poročali, da fisetin zavira migracijo in invazijo človeških celic materničnega vratu z znižanjem izražanja uPA z zaviranjem MAPK [36]. V makro -fagov je na voljo nekaj poročil o učinku fisetina na izražanje in aktivnost uPA in uPAR. Naša študija je prvič pokazala, da je fisetin zaviral izražanje uPA in uPAR, induciran z LPS, z zaviranjem signalizacije MAPK v makrofagih, kot so prej poročali v rakavih celicah.

MMP so družina proteaz, katerih izražanje je povezano z določenimi procesi, kot so razvoj, fiziologija in patologija. Na splošno je bil MMP-9 prepoznan kot marker različnih vnetnih bolezni, kot so ateroskleroza, artritis in sistemski eritematozni lupus [37]. Poleg tega je bil MMP-9 tesno povezan z migracijo celic [38,39]. Več študij je zlasti poročalo, da sta MMP-2 in MMP-9 vključena v aterogenezo in imata pomembno vlogo pri stabilizaciji aterosklerotičnih plakov 40-42]. Glede na to naši rezultati kažejo, da zaviralci MMP-9 lahko ponudi obljubo kot terapevtski pristop za stabilizacijo ranljivih oblog. Poleg tega so nedavne raziskave pokazale, da je celjenje ran na koži oslabljeno zaradi prekomerne aktivacije MMP-9 [43]. Zato je bilo predlagano, da ima fisetin tudi potencial kot terapevtski pristop za zdravljenje kože. Za pojasnitev njegovih podrobnosti o molekularnih mehanizmih bodo potrebne prihodnje študije.

Nedavni trend v farmacevtski industriji je odkrivanje strategij za razvoj same naravne rastline kot novega zdravila. Dve nedavni študiji na živalih sta dejansko pokazali, da sta zdravljenje s fisetinom izboljšala akutno pljučno vnetje, ki ga povzroča LPS, in artritis, ki ga povzroča kolagen |32,44. Druga študija ex vivo je tudi pokazala, da je fisetin lahko zmanjšal sproščanje citokinov, ki ga povzroči LPS, iz levkocitov bolnikov s kronično obstruktivno pljučno boleznijo ali sladkorno boleznijo tipa 2 [45]. Veliko imunosupresivnih zdravil je bilo razvitih za ublažitev vnetnih in avtoimunskih bolezni[46-50]; kljub temu ima večina spojin znatne stranske učinke. Ker so polifenoli običajno prisotni v prehranskem sadju in zelenjavi, so verjetno lahko varnejši imunosupresivi [51, 52]. Sadje in zelenjava vsebujeta široko paleto fitokemikalij, vključno s seskviterpenskimi laktoni, terpenoidi, polisaharidi in fenolnimi spojinami. Naši rezultati, ki dokazujejo protivnetne, protitumorske in antioksidativne učinke fisetina, močno kažejo, da ga je mogoče razviti kot novo zdravilo. Čeprav je fisetin obetaven kandidat za imunoterapijo, je treba potencial naravnih izdelkov, ki vsebujejo fisetin kot terapevtsko sredstvo za določeno bolezen, dodatno preveriti v kliničnem okolju.

5. Sklepi

Ta študija je pokazala, da je fisetin zmanjšal povečanjavnetnagenov (MCP-1, IL-1b in iNOS), proizvodnjo NO in fosforilacijo MAPK, uPA, uPAR in MMP, ki jo inducira LPS v makrofagih. Ti rezultati kažejo, da je fisetin lahko terapevtsko sredstvo za več bolezni, povezanih z makrofagi.