Rho-GTPase aktivirajoči protein miozin MYO9A identificiran kot nov kandidatni gen za monogensko žariščno segmentno glomerulosklerozo

joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Qi Li1, Ashima Gulati2,6, Mathieu Lemaire3,7, Timothy Nottoli4, Allen Bale3 in Alda Tufro1,5

1 Oddelek za pediatrijo, Oddelek za nefrologijo, Medicinska fakulteta Yale, New Haven, Connecticut, ZDA; 2 Oddelek za interno medicino, Oddelek za nefrologijo, Medicinska fakulteta Yale, New Haven, Connecticut, ZDA; 3 Oddelek za genetiko, Yale School of Medicine, New Haven, Connecticut, ZDA; 4 Yale Gene Editing Center, Yale School of Medicine, New Haven, Connecticut, ZDA; in 5 Oddelek za celično in molekularno fiziologijo, Yale School of Medicine, New Haven, Connecticut, ZDA

KLJUČNE BESEDE: FSGS; interakcija Myo9A-aktin-kalmodulin; Različice MYO9A; RhoA dejavnost

Fokalna segmentna glomeruloskleroza(FSGS) je podocitopatija, ki vodi v odpoved ledvic, katere molekularni vzrok pogosto ostaja nerešen. Tukaj opisujemo redko nesmiselno heterozigotno mutacijo MYO9A zaradi izgube funkcije (p.Arg701*) kot možnega povzročitelja bolezni pri bratu in sestri z družinskoFSGS/proteinurija. Različice MYO9A negotovega pomena so bile identificirane s sekvenciranjem celotnega eksoma v kohorti 94 z biopsijo dokazanih bolnikov s FSGS. MYO9A je nekonvencionalen miozin z domeno Rho-GAP, ki nadzoruje sestavljanje spoja epitelijskih celic, navzkrižne povezave in združevanje aktina ter deaktivira majhen protein GTPase, ki ga kodira gen RHOA. Aktivnost RhoA je povezana z regulacijo citoskeleta tvorbe aktinskih stresnih vlaken in kontraktilnosti aktomiozina. Myo9A je bil odkrit v mišjih in človeških podocitih in vitro in in vivo. Miši Knockin, ki nosijo p.Arg701* MYO9A (Myo9AR701X), ustvarjeno z urejanjem genov, so razvili

proteinurija, izbris podocitov inFSGS. Ledvice in podociti mutantnih miši Myo9AR701X/D so razkrili haploinsuficienco Myo9A, povečano aktivnost RhoA, zmanjšano interakcijo Myo9A-aktin-kalmodulin, oslabljeno pritrditev podocitov in migracijo. Naši rezultati kažejo, da je Myo9A nova komponenta citoskeletnega aparata podocitov, ki uravnava aktivnost RhoA in delovanje podocitov. Tako Myo9AR701X/þ knock-in miši povzamejo fenotip probanda FSGS, dokazujejo, da je p.R701X Myo9A mutacija, ki povzroča FSGS pri miših, in kažejo, da lahko heterozigotne mutacije MYO9A z izgubo funkcije povzročijo novo obliko avtosomno prevladujočega človeka FSGS. Zato je identifikacija patogenega MYO9A

različice pri dodatnih posameznikih z družinskimi ali sporadičnimiFSGSje potrebno za ugotavljanje prispevka genov k bolezni.

Prevajalska izjava

To delo identificira mutacijo zaradi izgube funkcije miozina 9A (MYO9A) v družini s proteinurijo in žariščno segmentno glomerularno sklerozo (FSGS) inRazličice MYO9Anegotovega pomena v kohorti FSGS. Myo9A knock-in miši z mutacijo p.Arg701* razvijejo proteinurijo inFSGS, ki reproducirajo fenotip probandov. Ta novi živalski model ponuja nove mehanistične vpoglede v funkcije Myo9A v podocitih in omogoča testiranje eksperimentalnih terapij za FSGS. Podatki kažejo, da lahko heterozigotne mutacije MYO9A z izgubo funkcije prispevajo kFSGSpatogeneza. Predlagamo vključitev MYO9A v panele za genetsko testiranje FSGS.

Fokalna segmentna glomeruloskleroza(FSGS) je histološka lezija, ki lahko povzroči končno ledvično odpoved.1 Genetske študije kažejo, da je FSGS v veliki meri podocitopatija, saj podociti izražajo večino vzročnih mutantnih genov.2,3 Vendar pa molekularni vzrok za FSGS ni znan. v več kot polovici primerov.3 Tako je identifikacija dodatnih genov, ki povzročajo FSGS, in njihova molekularna patogeneza klinično pomembna. Tukaj identificiramo miozin 9A (MYO9A) kot nov kandidatni gen za človeški FSGS s sekvenciranjem celotnega eksoma (WES). Splošni cilj te študije je ugotoviti, ali redka različica MYO9A, identificirana pri bolnikih, spremeni funkcijo podocitov in povzroči FSGS in vivo. MYO9A kodira nekonvencionalen, nemišični miozin, ki prej ni bil povezan s človeško ledvično boleznijo.4 O mutacijah MYO9A so poročali pri bolnikih z artrogripozo in prirojenim miasteničnim sindromom.5,6 Miozini so družina molekularnih motorjev, ki vežejo aktin za ustvarjanje sile in gibanja ter služijo več celicam funkcije, vključno z regulacijo gibljivosti in oblike, prometom z organeli in signalizacijo.7–9 Poročali so, da mutacije miozina IIA (MYH9) in miozina 1E (MYO1E) povzročajo glomerularno bolezen in avtosomno recesivno FSGS.10–12 Razred-9 miozini obsegajo MYO9A in MYO9B, ki ju izražajo epitelne oziroma imunske celice.9,13 Njihovi značilni značilnosti sta procesna ena glava, ki se premika po F-aktinu, in repna domena proteina, ki aktivira Rho-gvanozin trifosfatazo (Rho-GAP), ki inaktivira RhoA. Myo9A mRNA se izraža v možganskem ependimalnem epiteliju ter v epiteliju testisov, pljuč in ledvic.4 Miši z izločenimi Myo9A razvijejo progresivni hidrocefalus, blago hidronefrozo in tubulopatijo.14,15 In vitro Myo9A nadzoruje sestavljanje epitelijskih celic in skupno migracijo celic. 9 Pomembno je, da Myo9A zadostuje za navzkrižno povezovanje in združevanje aktinskih filamentov, kar povzroči nastanek aktinskih mrež.16

RhoA modulira dinamiko aktina podocitov in vzdržuje prepustnost glomerulov.17 Motnje aktivnosti Rho-gvanozin trifosfataze (Rho-GTPaze) v podocitih vodijo do glomerularne bolezni (pregledano v Mouawad et al.18). Mutacije spodnjih efektorjev (INF2)19 in regulatorjev Rho gvanozin difosfat disociacije–inhibitorja alfa (ARHGDIA)3 in Rho-GAP24 (ARHGAP24) 20 povzročajo proteinurijo in FSGS. Tako fino prilagajanjeAktivnost Rho-GTPazeje ključnega pomena za vzdrževanje normalnega fenotipa podocitov in vivo. 18

Tukaj poročamo, da je MYO9A nov podocitni protein, ki ob mutaciji pri miših povzroči proteinurijo, izbris nožnega procesa (FPE) in FSGS, ki posnema človeški fenotip, povezan z različico p.Arg701* MYO9A. Naše ugotovitve razkrivajo pomembnost Myo9A v podocitih, dokazujejo, da Myo9A uravnava RhoA podocitov, in zagotavljajo prvi dokaz, da p.Arg701* Myo9A povzroča disfunkcijo podocitov, ker ne uspe negativno regulirati RhoA in zmanjša interakcijo Myo9A-aktin-kalmodulin.

cistanchelahkozdravijo bolezni ledvicizboljšatidelovanje ledvic

METODE

WES

WES vzorcev DNK 2 prizadetih bratov in sester ter 94 oseb iz kohorte iz kliničnega preskušanja žariščne segmentne glomeruloskleroze (FSGS-CT; NCT00135811) je bil izveden v Centru za analizo genoma Yale in kliničnem laboratoriju Yale DNA na platformah Illumina.21–26 FSGS- Nabor podatkov CT kohorte WES je bil zaslišan za identifikacijoRazličice MYO9Az manjšo mejo frekvence alelov #{{0}}.01 odstotkov za heterozigotne različice in #0,1 odstotka za homozigotne in sestavljene heterozigotne različice, ocenjeno z bioinformatičnimi rezultati MetaSVM,27 SIFT,28 in CADD29. Različice MYO9A so bile potrjene s Sangerjevim sekvenciranjem. Genska plošča 64 genov, ki povzročajo FSGS, temelji na OMIM, Online Mendelian Inheritance in Man, zbirki podatkov (omim.org) in literaturi, povezani s "FSGS", "glomerularno proteinurijo" ali "nefrotskim sindromom" (ali kombinacijo ti izrazi) so bili uporabljeni za identifikacijo ustreznih različic.

Generacija miši knockin Myo9AR701X

Z urejanjem genov, posredovanim s CRISPR/Cas9-, smo ustvarili Myo9AR701X knock-in miši.30 Celotne metode so vključene v dopolnilne metode. Myo9AR701X knockin in divji tipi sorodnikov iz legla, samci in samice, so bili uporabljeni v skladu s protokoli, ki jih je odobril odbor za oskrbo in uporabo živali Yale Animal Research Center.

Histologija/IF

Biopsijo človeških ledvic in mišje ledvice smo obdelali za histologijo, imunofluorescenco (IF) in transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM), kot je opisano. 31, 32 IF smo izvedli v zamrznjenih odsekih mišjih ledvic in kultiviranih podocitih. Primarna protitelesa so bila mišje anti-MYO9A (klon 4C11; Abnova, Taipei, Tajvan), kunčji anti-podocin (P0372; Sigma, St. Louis, MO), kunčji anti-laminin (L9393; Sigma), kunčji anti-akvaporin2 (PAS). -78809; Invitrogen, Carlsbad, CA) in kunčja anti-megalin;33 sekundarna protitelesa so bila Alexa Fluor-488 in 594-konjugirana (Invitrogen). Slike so bile pridobljene s konfokalnim mikroskopom Olympus IX71 (Olympus Corp, Shinjuku, Japonska) ali Leica SP5-Spectral (Leica Camera, Wetzlar, Nemčija).

Imunoblot/imunoprecipitacija

Proteine ​​smo ločili z elektroforezo v natrijevem dodecil sulfatu in poliakrilamidnem gelu in imunoblotirali, kot je opisano prej;31,32 z anti-MYO9A (klon 4C11), aktinom (A2066; Sigma), kalmodulinom (EP799Y; Abcam, Cambridge, UK), gliceraldehidom{{ 9}} primarna protitelesa fosfat dehidrogenaze (6C5; Millipore Corp, Burlington, MA), RhoA (67B9; Cell Signaling Technology, Beverly, MA). Koimunoprecipitacijo smo izvedli, kot je opisano,34,35 s kunčjim poliklonskim protitelesom anti-MYO9A (A305-702AM; Bethyl Laboratories, Montgomery, TX), čemur je sledilo imunoblotiranje

cistanche za žariščno segmentno glomerulosklerozo

Kvantitativni PCR

Celotna RNA je bila reverzno prepisana z uporabo iScript cDNA Synthesis kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), pomnožena z iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) in Myo9A primerji verižne reakcije s polimerazo (PCR): 50 TCTGAGAAGTAGCAGGAATGC-30 in 50- AGCAACCACAGCTCTGAAA-30 z uporabo CFX96-Touch-Real-Time-PCR (Bio-Rad). MRNA Myo9a je bila normalizirana na mRNA GAPDH z metodo 2-DDCt, kot je opisano.36

TEM/imunoelektronska mikroskopija

TEM smo izvedli, kot je opisano.32 Za immunogold EM smo fiksirali mišjo ledvico divjega tipa, ultratanke kriosekcije pogasili, blokirali in inkubirali z mišjim primarnim protitelesom proti MYO9A (klon 4C11). Sekundarno protitelo je bilo kunčje protimišje IgG, zlati konjugat je bil kozje proti kunčje 10 nm zlato. Odseki so bili naknadno fiksirani, obarvani in pregledani na FEI Tecnai Biotwin (LaB6, 80 kV) TEM.

Primarna izolacija podocitov in funkcionalni testi

Podociti so bili izolirani iz divjega tipa in Myo9AR701X/þ ledvic, kot je opisano34 z nekaj modifikacijami. 37,38 Testi adhezije so bili izvedeni, kot je opisano, in kvantificirani z barvanjem s kristalno vijolično.37

Myo9A knockdown

Knockdown Myo9A (Myo9AKD) je bil induciran v ovekovečenih mišjih podocitih divjega tipa z uporabo Myo9A majhne interferenčne RNA (siRNA) (L-006539-ON-TARGETplus, Dharmacon; Horizon Discovery, Cambridge, UK) po navodilih proizvajalca. Netransfektirani podociti in podociti, transficirani z neciljno siRNA (D-001810-10-ON-TARGETplus Non-Targeting-control, Dharmacon), so služili kot kontrole.

Figure 1 | Heterozygous nonsense MYO9A mutation in a family with focal segmental glomerular sclerosis (FSGS)/proteinuria. (a) A novel heterozygous single base-pair mutation that leads to a stop codon in exon 14 of MYO9A c.C2101T: p.R701X (p.Arg701*) in a patient with proteinuria and FSGS. Nucleotide sequence traces show the C>Mutacija T, ki si jo delijo proband, sestra in mati (zgoraj, označeno z *) ter zaporedje divjega tipa (WT) od očeta (spodaj), ki temelji na človeškem referenčnem zaporedju MYO9A NM_006901.4. (b) Biopsija ledvic probanda kaže FSGS in blag intersticijski infiltrat (barvanje s periodično kislino–Schiff, prvotna povečava X 400). (c) Družinski rodovnik kaže segregacijo genotip-fenotip: posamezniki s proteinurijo/FSGS in različico MYO9A p.R701X (trdni simboli), divji tip (prazen simbol) ali neznan genotip MYO9A (označen z #). (d) Proteinske domene divjega tipa MYO9A (NP_008832.2): motorična domena (siva) vključuje zanko 2 (rumena) in mesto vezave kalmodulina (rdeča), domena vratu (modra), domena repa (roza ) vključno z domeno proteinov, ki aktivirajo Rho–gvanozin trifosfatazo (Rho-GAP) (zeleno); domenske meje so označene s številom aminokislinskih ostankov; predvideni p.R701X MYO9A se konča znotraj mesta vezave kalmodulina v zanki 2, brez domene vratu in repa, zvezdice označujejo lokacijo missenseRazličice MYO9Aneznanega pomena. (e) Evolucijsko ohranjanje aminokislinskih ostankov, spremenjenih z misencem MYO9A (nadaljevanje)

Slika 1|(nadaljevanje) mutacije, ugotovljene pri bolnikih s FSGS: MYO9A spremenjeni ostanki p.D156G (p.Asp156) in p.E765D (p.Glu765) (rdeče puščice) so visoko ohranjeni skozi filogenijo. Pristopne številke: H. sapiens (NP_008832.2), M. musculus (NP_766606.2), R. norvegicus (NP_599162.1), G. gallus (XP _015134553.1), D. rerio (E7EZG2.1) in X. tropicalis (XP_002934596.2) so bili uporabljeni za poravnavo več sekvenc MYO9A s Clustal Omega, EMBL-EBI (Evropska molekularna biologija). Laboratorij – Evropski inštitut za bioinformatiko, https://www.ebi.ac.uk/ Tools/MSA/clustalo/). Za optimizacijo gledanja te slike si oglejte spletno različico tega članka na www.kidney-international.org.

RhoA dejavnost

Aktivni RhoA smo izmerili z Rho-aktivacijskim pulldown testom (Millipore) po navodilih proizvajalca.39 Aktivni RhoA smo odkrili z imunoblotingom.40

Statistična analiza

Podatki so bili analizirani z uporabo programske opreme GraphPad Prism 8 (San Diego, CA) z neparnim Studentovim t-testom z Welchovim popravkom ali Welchovo analizo variance, kot je primerno. P < 0.05="" je="" veljalo="" za="" statistično="">

REZULTATI

Identifikacija variant MYO9A pri bolnikih s proteinurijo in FSGS

WES21 identified a rare truncating MYO9A mutation in 2 siblings diagnosed with FSGS/proteinuria at 15 and 14 years of age (Figure 1a), presenting with asymptomatic proteinuria w1 to 2 g/d, normal blood pressure, normal renal ultra-sounds, and estimated glomerular filtration rate of 72 and 96 ml/min per 1.73 m2, respectively. Renal biopsy performed on the index case showed FSGS, mild interstitial fifibrosis, and no tubular abnormalities (Figure 1b). The proband's disease progressed over 3 years: estimated glomerular filtration rate decreased to 46 ml/min per 1.73 m2 and proteinuria >2 g/ d while his sister's estimated glomerular filtration rate and proteinuria remained stable. Relevant family history includes a maternal uncle with chronic kidney disease of unknown etiology, a mother with a history of proteinuria and a healthy father, and no consanguinity (Figure 1c). WES revealed a shared nonsense heterozygous MYO9A (NM_006901 c.2101C>T, p.Arg701* ) in the siblings (Figure 1a). This rare MYO9A variant was identified in 1 of 113,632 alleles tested in the Genome Aggregation Database, or gnomAD (http://gnomad. broadinstitute.org), the allele frequency of 8.8 X 10–6. The parents' genotype revealed that only the mother is heterozygous for c.2101C>T, p.Arg701* Različica MYO9A, ki kaže na avtosomno dominantno dedovanje mutacije (slika 1c). Genotip materinega strica s kronično boleznijo ledvic ni na voljo. Pričakuje se, da bo MYO9A p.Arg701* (p.R701X) povzročil izgubo funkcije zaradi nesmiselnega razpada mRNA ali okrnitve v zanki 2 glavne domene MYO9A (slika 1d), ki je potrebna, da Myo9A navzkrižno poveže aktin .16 Dodatna tabela S1 prikazuje vse različice, ki si jih delijo bratje in sestre. Nobenih mutacij v genih, ki povzročajo FSGS ali nefrotski sindrom, o katerih so do danes poročali, niso odkrili nobenih sorodnikov (dodatna tabela S2). Kolikor vemo, je to prvo poročilo, ki povezuje mutacijo MYO9A zaradi izgube funkcije z boleznijo ledvic pri ljudeh.

Analysis of WES data from 94 FSGS patients (from the FSGS-CT cohort)41 identifified 5 unrelated individuals with heterozygous MYO9A missense variants (Table 1) meeting a minor allele frequency cutoff #0.01%; 2 of these individuals' MYO9A variants, p.Asp156Gly and p.Glu765Asp (Figure 1d), are predicted to be deleterious by at least 2 bioinformatics scores: MetaSVM, SIFT, and CADD >18;27–29 se druge 3 napačne različice štejejo za benigne na podlagi 3 rezultatov napovedi bioinformatike. Aminokisline, substituirane v različicah p.Asp156Gly in p.Glu765Asp, bodo verjetno imele ustrezno funkcijo, ker so ti ostanki ohranjeni skozi evolucijo (slika 1e). Identificirali smo tudi 1 bolnika z različico MYO9A (p.Arg2283His), ki ni izpolnjevala naših meril frekvence manjših alelov, o katerih smo prej poročali pri sindromu prirojene miastenije.6 Ni patogenih mutacij ali škodljivih različic v genih, ki povzročajo FSGS/NS/proteinurijo (dodatna tabela S2 ) so identificirali pri 5 posameznikih z različicami MYO9A.

Ekspresija MYO9A v podocitih in glomerularna bolezen

Ekspresija proteina Myo9A je bila odkrita z imunoblotingom v mišjih ledvicah ter mišjih in človeških podocitih (slika 2a). Imunocitokemija je potrdila citoplazmatsko izražanje MYO9A v človeških podocitih (slika 2b). Imunoreaktivni Myo9A se odkrije z IF mikroskopijo v mišjih glomerulih, kjer se delno kolokalizira s podocinom (slika 2c). Dvojno označevanje in konfokalna mikroskopija razmejujeta lokalizacijo Myo9A vzdolž zunanjega vidika glomerularne bazalne membrane (GBM), ki je tesno povezana ali kolokalizirana s podocinom (slika 2d) in lamininom (slika 2e). Immunogold EM prikazuje natančno lokalizacijo Myo9A. Zlati delci so porazdeljeni v citoplazmi stopala in celičnem telesu podocita (slika 2f in g, dodatna slika S1B in D). Režaste diafragme so enotno neoznačene. Mesangialne in endotelne celice ne kažejo pomembnega označevanja. Zlati delci so zaznani tudi v celicah proksimalnih tubulov (dodatna slika S1C).

Da bi ocenili, ali je izražanje Myo9A moteno pri glomerulnih boleznih, smo pregledali 2 mišja modela, povezana s proteinurijo v nefrotskem območju. Podobno se glomerularni Myo9A zmanjša pri miših z napredovalo diabetično glomerulosklerozo, posredovano s streptozotocinom, inducirano s prekomerno ekspresijo Vegfa,32 v primerjavi z Myo9A, odkritim pri diabetičnih miših brez prekomerne ekspresije Vegfa (slika 3b) in nediabetičnih miših (slika 2c). Lokalizacija procesa stopala podocitov Myo9A in zmanjšan glomerularni Myo9A v obeh modelih proteinurične bolezni kažeta, da lahko Myo9A igra vlogo pri pregradni funkciji glomerularne filtracije.

Tabela 1|Različice Missense MYO9A, identificirane v kohorti bolnikov FSGS-CT

p.D156G, p.Asp156Gly; p.E765D, Glu765Asp; str.M2384V, str.Met2384Val; str.P1704S, str.Pro1704Ser; p.T389M, Thr389Met. Različice, filtrirane pri frekvenci manjšega alela #0,01 odstotka, n=94 vzorcev po opombi ANNOVAR.

Gensko urejene miši MYO9AR701X za razvoj FSGS

Da bi ugotovili, ali nesmiselna mutacija p.Arg701* (p.R701X) MYO9A povzroča glomerularno bolezen pri miših, smo z urejanjem genov, posredovanim s CRISPR/Cas9-, ustvarili knock-in miši p.Arg701* (v nadaljevanju imenovane Myo9AR701X).30 Heterozigotni Myo9AR701X/þ mutirane miši (slika 4a) dajejo žive mutirane mladiče na mendelski način, kar dokazuje, da mutacija ni embrionalno smrtonosna. Homozigotni mutanti razvijejo progresivni hidrocefalus (dodatna slika S2), ataksijo in epileptične napade ter skoraj vsi poginejo pred 3 tedni starosti, kar spominja na Myo9A-null miši.14 Heterozigotni mutanti Myo9AR701X/þ ob rojstvu nimajo očitnega fenotipa, so plodni in preživijo do odraslosti.

Vse mutirane miši Myo9AR701X razvijejo FPE in proteinurijo, čeprav v različnih starostih. Homozigotni mutanti Myo9AR701X/R701X kažejo dismorfne glomerule, tubularno dilatacijo in beljakovinske odlitke pri svetlobni mikroskopiji pri starosti 2 tednov (slika 4b, dodatna slika S3A). TEM 2-tednov starih mutantnih ledvic Myo9AR701X/R701X razkrije obsežen FPE, debel in nepravilen GBM ter pomanjkanje zarezanih diafragm, nadomeščenih z adherenčnimi spoji (slika 4d). V nasprotju s tem pa 2-tedne stari heterozigotni mutanti Myo9AR701X/þ kažejo normalno ledvično histologijo in ultrastrukturo pregrade za glomerularno filtracijo (slika 4c in e), ki se ne razlikujejo od divjih tipov sorodnikov iz legla (slika 4f), kar potrjuje kvantifikacija procesov stopal (FP/mm GBM) (slika 4g). Albuminurijo odkrijejo v vzorcih urina heterozigotnih in homozigotnih mutantnih miši Myo9AR701X z elektroforezo v natrijevem dodecil sulfatu in poliakrilamidnem gelu (slika 4h) pri starosti 2 tednov.

Pri starosti 4 mesecev heterozigotne miši Myo9AR701X/þ kažejo FSGS pri svetlobni mikroskopiji (sliki 5a in g), TEM pa razkrije FPE (bele puščice), nenormalne diafragme z režami (kratke črne puščice), nepravilno GBM in mezangialno ekspanzijo (slika 5b) . Kvantifikacija stopalnih procesov kaže pomembno FPE v Myo9AR701X/þ v primerjavi z divjim tipom odraslih ledvic (slika 5c). Ta glomerularni fenotip je izjemno podoben tistemu, ki so ga opazili pri biopsiji ledvic probanda (slika 1b). Odrasle heterozigotne miši z mutacijo Myo9AR701X/þ imajo znatno višja razmerja med albuminom in kreatininom v urinu kot miši divjega tipa, ki ustrezajo starosti (slika 5d) in ne kažejo nobenih znakov poliurije ali izgube teže (sliki 5e in f). Pri periodičnem acid-Schiffovem pregledu ledvice odraslih Myo9AR701X/þ kažejo FSGS različne resnosti (puščice, slika 5g) in odsotnost tubularne atrofije in dilatacije ali intersticijskih infiltratov. Dvojno označevanje in konfokalna mikroskopija zaznata Myo9A v proksimalnih tubulih, periferno od megalina (konice puščice, slika 5h in k), medtem ko Myo9A ni zaznana v segmentih distalnega nefrona, ki izražajo akvaporin2 (sliki 5h in i). Označevanja obeh tubularnih markerjev pri odraslih Myo9AR701X/þ ni mogoče razlikovati od ledvic divjega tipa s konfokalno mikroskopijo (slika 5h ter k in i in l). Nasprotno pa je obarvanje Myo9A v proksimalnih tubulih in glomerulih zmanjšano pri Myo9AR701X/þ (slika 5h in i) v primerjavi z ledvicami divjega tipa (slika 5k in l). Te ugotovitve skupaj kažejo, da je p.Arg701* mutacija Myo9A pri miših, ki povzroča FSGS in povzema fenotip in avtosomno dominantno dedovanje heterozigotne različice MYO9A p.Arg701*, identificirane v probandu.

Kako p . Arg701* Mutacija Myo9A povzroča FSGS?

Za preučevanje molekularne patogeneze FSGS, ki jo povzroča mutacija p.Arg701* MYO9A, smo uporabili Myo9AR701X knock-in miši. Ekspresija Myo9A v knockin Myo9AR701X ledvicah se znatno zmanjša pri heterozigotih in ni zaznana pri homozigotih z IF (slika 6a) in imunoblotingom (sliki 6b in c). Izvedli smo kvantitativno PCR, da bi ocenili, ali se haploinsuficienca, posredovana z nesmiselnim razpadom mRNA42, pojavi pri mutantih Myo9AR701X/þ. Ekspresija mRNA Myo9A v ledvicah Myo9AR701X/þ je w50 odstotkov nižja kot v ledvicah divjega tipa (48,3 ± 5,6 odstotka; P <0,0001) (slika="" 6d),="" kar="" je="" skladno="" s="">

Zmanjšan Myo9A zmanjša njegovo interakcijo z aktinom in kalmodulinom

Preučili smo, ali haploinsuficienca Myo9A spremeni interakcijo Myo9A-aktin-kalmodulin. Poskusi koimunoprecipitacije, ki primerjajo ledvice in podocite divjega tipa ter Myo9AR701X/þ, potrjujejo interakcijo Myo9A z aktinom in kalmodulinom ter kažejo, da se interakcija Myo9A z obema proteinoma zmanjša za w50 odstotkov v Myo9AR701X/þ mutantnih ledvicah in podocitih (slika 6e in f), zmanjšanje podobno kot pri Myo9A polne dolžine. Nasprotno pa ravni ekspresije aktina in kalmodulina ostanejo nedotaknjene (vnos, slika 6e in f). Za analizo interakcij Myo9A v okolju zmanjšane ekspresije smo inducirali w50 odstotkov Myo9AKD v ovekovečenih mišjih podocitih divjega tipa z uporabo siRNA, ocenjeno s kvantitativno PCR in imunoblotingom (slika 7a in b), nato pa izvedli poskuse koimunoprecipitacije. Myo9AKD zmanjša interakcijo Myo9A-aktin-kalmodulin sorazmerno z izražanjem Myo9A (slika 7c). Ugotovitve koimunoprecipitacije skupaj kažejo, da heterozigotna mutacija p.Arg701* Myo9A in Myo9AKD zmanjšata številčnost Myo9A in s tem njegovo interakcijo z aktinom in kalmodulinom. Ker Myo9A navzkrižno povezuje aktin v molskem razmerju 1:1,16 naši podatki kažejo, da lahko zmanjšan Myo9A v heterozigotnih podocitih Myo9AR701X/þ poslabša navzkrižno povezovanje in povezovanje aktina, ki ga posreduje Myo9A.

Slika 2|(nadaljevanje) do podocina (zeleno) na njegovi GBM strani (puščice). Vložki kažejo večjo povečavo. Palice=25 mm. (e) Konfokalna mikroskopija kaže obarvanje Myo9A, ki je tesno sosednje ali kolokalizirano z lamininom (zeleno) vzdolž zunanjega vidika GBM (vstavki in konica puščice). Palice=25 mm. ( f , g ) Lokalizacija Myo9A z elektronsko mikroskopijo imunskega zlata v glomerulih mišjih ledvic divjega tipa: zlati delci (črne puščice) so opaženi v telesu podocitne celice (POD) in citoplazmi stopalnega procesa (FP), vidnih je nekaj zlatih delcev na bazi FP poleg glomerularne bazalne membrane, vendar ne na režastih diafragmah. Prečke ¼ 500 nm. Za optimizacijo gledanja te slike si oglejte spletno različico tega članka na www.kidney-international.org.

Mutacija Myo9AR701X poveča aktivnost Rho-A

Izmerili smo aktivnost RhoA z uporabo padajočega testa pri Myo9AR701X mutantnih in divjih miših, pri čemer smo se osredotočili na heterozigotne Myo9AR701X/þ, da bi zagotovili mehanični vpogled v človeški p.Arg701* fenotip MYO9A. Aktivni RhoA je znatno povečan v celih ledvicah Myo9AR701X/þ (slika 8a), izoliranih glomerulih (slika 8b) in primarnih podocitih (slika 8c) v primerjavi z ustreznimi kontrolnimi vzorci divjega tipa. Velikost povečanja GTP-RhoA v vzorcih Myo9AR701X/þ se giblje od w60 odstotkov v izoliranih glomerulih do w{18}}krat v celih ledvicah in v podocitih (slika 8a–c). Aktivni RhoA je nekoliko višji pri homozigotnih kot pri heterozigotnih mutiranih ledvicah, vendar razlika ni pomembna (slika 8a). Ti poskusi skupaj kažejo, da Myo9AR701X povzroča povečano aktivnost RhoA

Mutacija Myo9AR701X/D in Myo9AKD spremenita obnašanje podocitov

Da bi ocenili učinek oslabljene interakcije Myo9A-aktin in povečane aktivnosti RhoA, odkrite v mutantnih podocitih Myo9AR701X/þ, na njihovo delovanje, smo izmerili adhezijo in gibljivost podocitov s testi pritrditve in migracije, pri čemer smo primerjali divji tip z mutiranimi primarnimi podociti v kontrolnih pogojih in na Inhibicija signalizacije RhoA z zaviralcem kinaze, povezanega z Rho, Y27632. Ti poskusi jasno kažejo, da Myo9AR701X/þ poslabša gibljivost podocitov (slika 8d; dodatna slika S4) in pritrditev podocitov (slika 8e) na način, ki je odvisen od aktivnosti RhoA. Za neposredno ovrednotenje učinka haploinsuficience Myo9A na funkcijo podocitov smo izvedli teste pritrditve in migracije, v katerih smo primerjali mišje podocite divjega tipa s podociti Myo9AKD, ki izražajo w50 odstotkov Myo9A mRNA in proteina (sliki 7a in b). Neciljni podociti, obdelani s siRNA, so služili kot dodatna kontrola. Myo9AKD znatno zmanjša pritrditev in migracijo podocitov, enako napako, opaženo pri podocitih Myo9AR701X/þ (sliki 8f in g). Skupaj mehanični podatki kažejo, da heterozigotna p.Arg701* mutacija Myo9A povzroči haploinsuficienco Myo9A, kar povzroči zmanjšano interakcijo Myo9A-aktin-kalmodulin in povečano aktivno RhoA v ledvicah, zlasti v podocitih. Razlagamo, da ti mehanizmi skupaj motijo ​​delovanje podocitov, kar kaže zmanjšana pritrditev in gibljivost in vitro ter prisotnost proteinurije in vivo.

DISKUSIJA

Ta študija identificira Myo9A kot novo komponento citoskeletnega aparata podocitov, ki vpliva na delovanje podocitov z negativno regulacijo aktivnosti RhoA. Opisujemo redko nesmiselno mutacijo MYO9A (p.Arg701*), povezano z

družinsko FSGS/proteinurijo in dokazujejo, da ta mutacija povzroča FSGS podobne lezije pri miših, kar zagotavlja vpogled v mehanizem bolezni.

Naše ugotovitve podpirajo idejo, da je MYO9A kandidatni gen za FSGS in da je p.Arg701* MYO9A različica, vpletena v človeški FSGS, ki temelji na smernicah American College of Medical Genetics za pripisovanje vzročnosti z uporabo algoritmov za napovedovanje genov, frekvenc alelov, eksperimentalnih živalskih modelov in funkcionalni testi.43,44 Proband bratje in sestre, ki nosijo p.Arg701* MYO9A, nimajo doslej znanih mutacij v genih, ki povzročajo FSGS, in ne kažejo nobenih dokazov, ki bi kazali na sekundarne vzroke za FSGS. Ta različica se segregira v majhnem sorodstvu po avtosomno dominantnem vzorcu dedovanja s spremenljivo ekspresivnostjo. Predvideva se, da je MYO9A p.Arg701* različica z izgubo funkcije, ni v kontrolnih eksomih in ima frekvenco alelov<0.0001 in="" population="" databases,="" in="" compliance="" with="" american="" college="" of="" medical="" genetics="" standards="" to="" support="" pathogenicity="" and="" consistent="" with="" parameters="" used="" in="" a="" recent="" comprehensive="" report="" on="" genetic="" contributions="" to="" fsgs.43–45="" moreover,="" loss-of-function="" observed/expected="" upper="" bound="" fraction="" for="" myo9a="" is="" 0.3,="" suggestive="" of="" low="" tolerance="" to="" gene="" inactivation="" with="" a="" constraint="" similar="" to="" genes="" known="" to="" cause="" autosomal="" dominant="" fsgs="" (e.g.,="" wt1,="" 0.25="" or="" inf2,="">

WES presejanje velike skupine nepovezanih FSGS otrok in mladih odraslih41 je identificiralo 2 bolnika z redkimi heterozigotnimi missenčnimi različicami MYO9A (p.Asp156Gly in p.Glu765Asp). Obe napačni različici MYO9A vključujeta visoko ohranjene ostanke in imata manjše frekvence alelov<0.01%, are="" predicted="" to="" be="" deleterious="" and="" have="" not="" previously="" been="" associated="" with="" human="" disease.="" three="" additional="" myo9a="" missense="" variants="" (thr389met,="" p.pro1704ser,="" p.met2384val)="" identified="" in="" this="" fsgs="" cohort="" were="" deemed="" benign="" by="" bioinformatics="" scores.="" these="" 5="" individuals="" do="" not="" carry="" mutations="" in="" known="" fsgs-causing="" genes.="" for="" clinical="" purposes,="" these="" missense="" variants="" should="" be="" considered="" variants="" of="" unknown="" significance="" given="" the="" absence="" of="" experimental="" data="" evaluating="" how="" they="" impact="" myo9a="" function.43,44="" to="" our="" knowledge,="" no="" myo9a="" mutation="" has="" been="" proven="" to="" cause="" a="" specific="" human="" disease="" by="" american="" college="" of="" medical="" genetics="" guidelines.43,44="" association="" of="" compound="" heterozygote="" missense="" myo9a="" variants="" (p.g2282e="" and="" p.y203c)="" with="" arthrogryposis="" was="" reported="" in="" 1="" patient,5="" and="" compound="" heterozygote="" or="" homozygote="" missense="" myo9a="" variants="" (p.r1517h/p.r2283h="" and="" p.d1698g,="" respectively)="" were="" described="" in="" association="" with="" congenital="" myasthenia="" syndrome.6="" a="" nonsense="" homozygous="" myo9a="" (p.r513x)="" was="" associated="" with="" severe="" ventriculomegaly="" and="" fetal="" demise.47="" elegant="" expression="" studies="" support="" a="" role="" for="" myo9a="" at="" the="" neuromuscular="" junction="" and="" its="" intriguing="" regulation="" of="" agrin="" secretion="" and="" actin="">

Slika 3|Glomerularna ekspresija Myo9A v mišjih modelih glomerularne bolezni. (a) Razvojni nefrotski sindrom, povzročen s prekomerno ekspresijo Vegfa31: imunofluorescenca kaže Myo9A (rdeča) v glomerulih normalnih, neinduciranih 2-tednov starih miši in jasno zmanjšano ekspresijo Myo9A v glomerulih nefrotičnih miši, ki prekomerno izražajo Vegfa, medtem ko podocin (zelen) je nespremenjena. (b) Sladkorna bolezen, povzročena s streptozotocinom, z ali brez prekomerne ekspresije Vegfa32: imunofluorescenca zazna Myo9A (zeleno) v glomerulih iz neinduciranih diabetičnih ledvic (kontrola DM) in izrazito zmanjšano imunoreaktivnost Myo9A v glomerulih diabetičnih miši s prekomerno ekspresijo Vegfa, pri katerih se razvije diabetična glomeruloskleroza (napredovala DN), 40,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (moder) prikazuje jedra iz obeh odsekov z obrisanimi glomeruli (šrafirana bela črta). Palice=50 mm. Če želite optimizirati ogled te slike, si oglejte spletno različico tega članka na www. ledvična-mednarodna.

Figure 4 | Genotype and phenotype analysis of knockin Myo9AR701X mice at 2 weeks of age. (a) Sanger sequencing traces and deduced amino acid sequences from exon 14 are shown from mutant mice: heterozygous (Het) Myo9AR701X/þ (top), homozygous (Hom) Myo9AR701X/R701X (middle), and wild-type (WT) littermate (bottom). C>T mutacija nadomešča CGA, ki kodira Arg (R), s TGA, stop kodonom, ki napoveduje prekinitev prevoda pri aminokislini 701. (b) Reprezentativno periodično kislinsko-Schiffovo barvanje iz 2-teden stare homozigotne Myo9AR701X/R701X mutirane ledvice kaže nenormalne glomerule, tubularno dilatacijo in beljakovinske odlitke. Bar=20 mm. (c) Reprezentativno periodično barvanje s Schiffovo kislino iz 2-tednov stare heterozigotne Myo9AR701X/þ ledvice kaže normalno histologijo. Bar=20mm. (d) Reprezentativna transmisijska elektronska mikroskopija iz 2-tednov starega glomerula Myo9AR701X/R701X kaže masivno izbris nožnega odrastka (bele puščice), odsotnost diafragm z režami, nadomeščene s stičišči adherentov (črne puščice) in zadebeljeno, nepravilno glomerularno dno membrana (GBM). Palica =1 mm. (e) Reprezentativna transmisijska elektronska mikroskopija iz 2-tednov starega heterozigotnega glomerula Myo9AR701X/þ kaže normalne procese na stopalih (črne tanke puščice) in normalne režne diafragme (bele tanke puščice). Palica =1 mm. (f) Transmisijska elektronska mikroskopija iz 2-tedna starega sorodnika WT iz legla kaže normalno glomerularno filtracijsko pregrado: tanke nožne procese, povezane z razrezano diafragmo, fenestrirane endotelne celice (EC) in tanko GBM. Palica =1 mm. (g) Kvantifikacija izbrisovanja nožnega procesa pri 2 tednih starosti: homozigotne Myo9AR701X/R701X ledvice kažejo manj kot polovične izrastke (FP)/mm GBM kot WT ali heterozigotni Myo9AR701X/þ sorodniki iz legla, kar kaže na hudo izbris nožnega procesa. P < 0,0001="" (analiza="" variance).="" (h)="" vzorci="" urina,="" ločeni="" z="" elektroforezo="" natrijevega="" dodecil="" sulfata="" in="" poliakrilamidnega="" gela="" coomassie="" modro,="" kažejo="" albuminurijo="" (alb)="" v="" myo9ar701x/r701x="" (plus="" )="" in="" myo9ar701x/þ="" (þ/="" plus),="" medtem="" ko="" je="" urin="" wt="" brez="" albumina.="" goveji="" serumski="" albumin="" (10="" mg)="" služi="" za="" nadzor="" molekulske="" mase.="" pod,="" podocit.="" za="" optimizacijo="" gledanja="" te="" slike="" si="" oglejte="" spletno="" različico="" tega="" članka="" na="">

Slika 5|Analiza fenotipa odraslih heterozigotnih Myo9AR7{{20}}1X/D trkajočih miši. (a) Reprezentativno barvanje s periodično kislino – Schiff (PAS) 4-mesečno stare Myo9AR701X/þ ledvice kaže glomerul z obsežno žariščno segmentno glomerularno sklerozo in mezangialno proliferacijo. Palica=50 mm (b) Reprezentativna transmisijska elektronska mikroskopija iz 4-mesečno stare ledvice Myo9AR701X/þ kaže obsežno izbris nožnega odrastka (bele puščice), delno zamenjavo diafragm z režami (tanke črne puščice) z adherentnimi spoji (debele črne puščice). Bar =2 mm (c) Kvantitativno izbris izrastka stopala pri odraslih Myo9AR701X/þ mutantnih miših: 4 mesece stari heterozigotni (Het) Myo9AR701X/ þ kažejo 2,2±0,06 FP/mm v primerjavi z divjim tipom (WT ) 3,7±0,13 FP/mm. ****P<0.0001. (d)="" urine="" (u)="" albumin/creatinine="" (creat)="">

Figure 5 | (continued) ratio at 4 months of age is higher in Myo9AR701X/þ (Het, red dots) than in WT mice (black dots). ***P>0,001. (e) Volumen urina (24 ur) in (f) telesna teža se pri miših WT (n=18) in Myo9AR701X/þ (Het, n=16) ne razlikujeta. (g,j) Reprezentativno barvanje PAS iz Myo9AR701X/þ (g) in WT (j) ledvic: (g) kaže zgodnjo žariščno sklerozo (puščice) in mezangialno proliferacijo v 2 glomerulih, normalne hrbtne tubule in brez infiltratov; (j) prikazuje normalne glomerule in tubule v ledvicah WT. Palice=50 mm. (h,k) Konfokalna mikroskopija imunofluorescence Myo9A/Megalina: (h) Myo9AR701X/þ ledvica kaže omejen Myo9A (rdeč) signal (puščice) v proksimalnih tubularnih celicah, označenih z megalinom (zeleno), proksimalni tubuli niso razširjeni; (k) Ledvica WT kaže obilnejši Myo9A (puščice), ki meji na megalin v celicah proksimalnih tubulov. Palice=25 mm. (i,l) Konfokalna mikroskopija imunofluorescence Myo9A/Aquaporin2 (AQP2) , ki niso razširjeni; (l) Ledvica WT kaže obarvanje Myo9A v glomerulu in obarvanje AQP2 v segmentih distalnega nefrona. Palice=25 mm. EC, endotelna celica; FP, nožni procesi citoplazma; GBM, glomerularna bazalna membrana. Za optimizacijo gledanja te slike si oglejte spletno različico tega članka na www.kidney-international.org.

Slika 6|Ekspresija Myo9A in interakcija Myo9A-aktin-kalmodulin v Myo9AR701X knock-in ledvicah in podocitih. (a) Imunofluorescenca zazna glomerularni Myo9A in podocin: glomerularno imunsko obarvanje Myo9A (rdeče) je močno v ledvicah divjega tipa (WT), znatno se zmanjša v glomerulih Myo9AR701X/þ in ni zaznano v glomerulih Myo9AR701X/R701X; podocin (zelen) se lokalizira na podocite pri vseh miših; delna kolokalizacija podocita-Myo9A je prikazana z združitvijo (rumeno). Palice=50 mm. (b) Imunobloting: intaktna ekspresija Myo9A (280 kDa) se zmanjša na približno polovico v Myo9AR701X/þ (heterozigotnih [Het]) ledvicah in ni zaznana v Myo9AR701X/R701X (homozigotnih [Hom]) ledvicah, *manjši pasovi (<75 kda)="" are="" considered="" nonspecific,="" w50="" kda="" bands="" correspond="" to="" igg="" heavy="" chain="" in="" all="" genotypes.="" (c)="" myo9a/actin="" quantification="" (mean±sd),="" n="3" independent="" experiments,="" pool="" from="" 3="" mice="" each.=""><0.001. (d)="" quantitative="" polymerase="" chain="" reaction="" (qpcr):="" myo9a="" mrna="" expression="" normalized="" to="" gapdh="" mrna,="" fold="" change="" (mean±sd),="" n="3" independent="" experiments,="" n="3" individual="" mice="" each.="">< 0.0001.="" (e,f)="" coimmunoprecipitation="" (ip)="" of="" kidney="" lysates="" (e)="" and="" primary="" podocytes="" (f)="" show="" decreased="" myo9a-actin-calmodulin="" interaction="" in="" myo9ar701x/þ="" (het)="" proportionally="" to="" the="" reduced="" myo9a="" expression="" (input);="" note="" input="" of="" actin="" and="" calmodulin="" is="" equal="" in="" both="" genotypes.="" ab,="" antibody.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">

We demonstrate Myo9A protein expression in podocyte cell lines and mouse kidney glomeruli and Myo9A subcellular localization in podocytes. Dual immunolabeling and confocal microscopy localized Myo9A along the external aspect of the GBM stained by laminin, tightly contiguous to podocin. Immunogold EM determined precisely Myo9A localization to the cytoplasm of foot processes and podocyte cell bodies, leaving slit diaphragms unlabeled. The apparent Myo9A mesangial localization in nonconfocal IF images was not confirmed by immunogold EM. Our findings are consistent with glomerular MYO9A immunohistochemical localization in human renal biopsies (www.proteinatlas.org/ ENSG00000066933-MYO9A/tissue/kidney). Myo9A was also detected in proximal tubules by IF and immunogold-EM, extending a previous report that did not detect Myo9A in glomeruli.15 The discrepancy in Myo9A tissue localization is probably due to different affinities of the primary antibodies used by Thelen et al.15 and in this study. Similar discrepancies in glomerular MYO9A staining of the same human renal biopsies were noticed using 2 affinity-purified polyclonal antibodies, the higher specificity antibody by protein array resulting in the stronger glomerular signal. Localization of Myo9A mRNA in the kidney by in situ hybridization has also been discrepant;4,15 Myo9A developmental regulation might be involved. RNA-sequencing data suggest Myo9A expression along with most nephron segments in mice and humans, raising the possibility that loss-of-function mutations may lead to phenotypes involving several cell types. Interestingly, we observed a clear decrease in glomerular Myo9A expression in 2 mouse models of proteinuria: developmental nephrotic syndrome and advanced diabetic disease. The latter is consistent with a >2-kratno zmanjšanje izražanja Myo9A z nizom DNK, o katerem so poročali pri diabetičnih podganah Zucker.49 Podatki o izražanju Myo9A skupaj kažejo, da lahko Myo9A igra vlogo pri glomerulni filtracijski pregradi.

Da bi razumeli pomembnost nesmiselne mutacije p.Arg701* MYO9A in vivo, smo z urejanjem genov ustvarili miši Myo9AR701X knock-in. Pri homozigotnih mutantih Myo9AR701X/R701X se razvije progresivni hidrocefalus, ki povzroči smrt do starosti 3 tednov, podobno kot pri miših brez Myo9A.14 Pri starosti 2 tednov homozigotne ledvice Myo9AR701X/R701X razkrivajo hud glomerulo-tubularni fenotip: obsežno FPE, nenormalnosti GBM, in pomanjkanje diafragm z režami in razširjenih tubulov, povezanih z albuminurijo. Odrasle Myo9A-null miši so pokazale proksimalno tubulopatijo, poliurijo in proteinurijo z nizko molekulsko maso.15 Na žalost v poročilo niso bili vključeni nobeni ultrastrukturni podatki glomerulov;15 presenetljivo 3- do 6-mesečni Myo9A -null miši niso podlegle progresivnemu hidrocefalusu, kot je opisano prej.14 Ker homozigotni mutanti Myo9AR701X/R701X ne preživijo do odrasle dobe, lahko ugotovimo samo zgodnji glomerularni fenotip, opisan tukaj. Tubularna dilatacija, opažena pri 2-teden starih mutantih Myo9AR701X/R701X, lahko predstavlja zgodnji dokaz tubulopatije, opisane pri odraslih miših brez Myo9A.

Figure 8 | RhoA activity and podocyte function in Myo9AR701X kidneys and Myo9A knockdown (Myo9AKD) podocytes. (a–c) Active RhoA (guanosine triphosphate [GTP]–RhoA) is increased in Myo9A R701X mutants versus wild-type (WT): >2-fold in whole kidneys (a), w60% in isolated glomeruli (b), >2-krat v primarnih podocitih (c), Western bloti reprezentativni za n=3 do 4 neodvisnih poskusov, lizati, združeni iz 3 miši vsakega, kvantifikacija (srednja vrednost ± SD), analiza variance (ANOVA) (a ) ali neparni t-test (b,c). *P<0.05,><0.001. (d)="" podocyte="" migration="" assay="" (wound="" assay)57:="" quantification="" of="" the="" migration="" area="" shows="" that="" myo9ar701x/þ="" (heterozygous="" [het])="" podocyte="" migration="" is="" decreased;="" preincubation="" with="" y26732="" partially="" abrogates="" the="" migration="" defect.="" ***p="" <="" 0.0005="" (anova),=""><0.0001 (unpaired="" student's="" t-test).="" (e)="" podocyte="" attachment="" assay="" shows="" decreased="" attachment="" of="" myo9ar701x/þ="" (het)="" podocytes;="" preincubation="" with="" y26732="" corrects="" the="" attachment="" defect.=""><0.0005 (anova).="" (d,e)="" data="" are="" mean±sd,="" n="3" to="" 4="" independent="" experiments,="" n="" ¼="" 3="" mice="" per="" genotype="" per="" experiment.="" (f)="" podocyte="" migration="" assay:="" small="" interfering="" rna="" (sirna)–mediated="" myo9akd="" decreases="" immortalized="" mouse="" podocytes="" migration=""><0.05, anova;=""><0.01, unpaired="" t-test),="" whereas="" migration="" of="" nontargeting="" (n-t)="" sirna-treated="" podocytes="" is="" not="" different="" from="" normal="" podocytes="" (wt).="" (g)="" attachment="" assay:="" myo9akd="" decreases="" immortalized="" mouse="" podocytes="" attachment,="" as="" compared="" to="" podocytes="" treated="" with="" nontargeting="" sirna="" and="" untreated="" wt="" podocytes.="" myo9akd="" data="" are="" mean±sd,="" n="" >="" 3="" independent="" experiments.=""><0.05,><0.01. hom,="" homozygous;="" ns,="" not="" significant;="" od,="" optical="">

Ključna ugotovitev te študije je, da so heterozigotne Myo9AR701X/þ knock-in miši fenotipsko normalne ob rojstvu, vendar razvijejo albuminurijo, FSGS in FPE podocitov pri starosti 4 mesecev, kar dokazuje, da je p.Arg701* Myo9A mutacija, ki povzroča FSGS odrasle miši. Zanimivo je, da histološke in ultrastrukturne spremembe Myo9AR701X/þ mutiranih ledvic povzemajo diagnostične značilnosti probandove biopsije ledvic. Še več, miši z mutacijo Myo9AR701X/þ razvijejo precejšnjo albuminurijo namesto masivne albuminurije, kar poustvari nenefrotsko proteinurijo, opaženo pri bratih in sestrah probanda in pri mnogih bolnikih s FSGS v odrasli dobi. Predlagano je bilo, da lahko delecija Myo9A povzroči glomerularno sklerozo, ki je posledica poliurične tubulopatije .15 Nekonvencionalni miozini so bili vpleteni v reabsorpcijo albumina v proksimalnih tubulih prek njihovih interakcij z Dab2 in kubilinom, vendar vpletenost Myo9A v ta proces ni bila dokazana.51 Nismo odkrili nobenih znakov tauopatij, kot so poliurija, tubularna dilatacija, atrofija , ali nenormalna porazdelitev proksimalnih ali distalnih tubularnih markerjev pri odraslih heterozigotnih miših Myo9AR701X/þ. Ti podatki ne podpirajo hipoteze, da je FSGS, opažen pri miših Myo9AR701X/þ, posledica obstrukcije ali tubularnih okvar.

Mehansko smo ugotovili, da sta mRNA Myo9A in protein Myo9A polne dolžine zmanjšana za w50 odstotkov, kar močno nakazuje, da mutacija vodi do haploinsuficience Myo9A zaradi nesmiselnega razpada mRNA.42 Ker se točkovna mutacija Myo9AR701X lokalizira na ekson 14 od 42, mRNA Myo9A regulacija sledi standardnim nesmiselnim pravilom razpada mRNA za skrajšanje mutacij, ki se nahajajo navzgor od predhodnega zadnjega eksona.42,52 V skladu s tem so opazili hidrocefalus in prezgodnjo smrt pri homozigotnih mutantih Myo9AR701X/R701X, ki posnemajo ničelne miši Myo9A.14 Ugotovili smo, da w50-odstotno zmanjšanje izražanja proteina Myo9A v mutantnih ledvicah in primarnih podocitih Myo9AR701X/þ ter v ovekovečenih podocitih Myo9AKD sorazmerno zmanjša interakcijo med Myo9A, aktinom in kalmodulinom. Te ugotovitve podpirajo razlago, da je haploinsuficienca Myo9A osnova za zmanjšano interakcijo Myo9A-aktin-kalmodulin, opaženo pri mutantih Myo9AR701X/þ.

Kritična ugotovitev tega dela je, da p.Arg701* Myo9A povzroči izgubo funkcije Rho-GAP, kar ima za posledico povečan aktivni RhoA v celih ledvicah Myo9AR701X, izoliranih glomerulih in primarnih podocitih. Poleg tega mutantni podociti Myo9AR701X/þ kažejo zmanjšano vezavo in gibljivost, odvisno od RhoA. Signalizacija Myo9A-GAP zmanjša aktivno RhoA in ima majhen učinek na Rac1 in Cdc42.9,53 Poveča se izguba funkcije Rho-GAPAktivnost Rho-GTPazein vodi do poškodbe podocitov, proteinurije in FSGS.3,18,20 Tako lahko nenormalno vedenje mutantnih podocitov Myo9AR701X/þ sčasoma prispeva k razvoju FPE in FSGS pri miših Myo9AR701X/þ. Naši podatki so skladni s poročanim učinkom disregulacije RhoA na delovanje podocitov in vivo in in vitro. 54–56

Ker Myo9A navzkrižno povezuje aktin in inducira tvorbo aktinskih snopov in vitro v rednih 36-nm intervalih s sodelovanjem z aktinom in kalmodulinom, se domneva, da je stehiometrija njune interakcije ključna.16 Zato je verjetno, da obstaja haplopomanjkanje Myo9A za zmanjšanje aktinskih navzkrižnih povezav in snopov, posredovanih z Myo9A, kar zagotavlja manj mest vzdolž aktinskih filamentov, kjer pride do inaktivacije RhoA, s čimer se spremeni dinamika aktina v neposredni bližini in obnašanje podocitov na celični ravni. Zaviralec kinaze, povezan z Rho, Y27632, je delno obnovil okvaro pritrditve in migracije, ki jo je povzročil Myo9AR701X/þ, kar kaže, da so vključeni dodatni efektorji RhoA, kot je mDia1. Druga možnost je, da lahko zmanjšane aktinske navzkrižne povezave v Myo9AR701X/þ neposredno prispevajo k poslabšanju pritrditve in migracije podocitov. Haplonezadostnost Myo9A lahko vpliva tudi na mehanizme trgovine.7–9 Natančne molekularne mehanizme, s katerimi Myo9A uravnava dinamiko aktina podocitov, je treba še razjasniti. Če povzamemo, identificirali smo Myo9A kot novo komponento citoskeletnega aparata podocitov in nesmiselno mutacijo MYO9A, ki implicira MYO9A kot kandidatni gen za človeški FSGS, z reprodukcijo fenotipa človeške proteinurije/FSGS pri Myo9AR701X/þ knock-in miših in z avtosomno prevladujoča kosegregacija fenotipa v majhnem sorodstvu. Skupaj podatki močno kažejo, da je haploinsuficienca Myo9A molekularna osnova za fenotip, opažen pri odraslih miših Myo9AR701X/þ. Dokazali smo, da sta pritrjevanje in migracija oslabljena v knockin mutantnih Myo9AR701X/þ podocitih, kar vključuje povečano aktivnost RhoA in zmanjšano interakcijo Myo9A-aktin-kalmodulin. Glede na to, da Myo9A inducira navzkrižno povezovanje in združevanje aktina pri molskem razmerju 1:116 in naše opažanje, da Myo9AR701X/þ vodi do haploinsuficience, izbris podocitov in FSGS nadure, špekuliramo, da je lahko Myo9A kritičen za normalno dinamiko aktina podocitov, podobno kot drugi proteini, ki vežejo aktin (ACTN4, INF2), za katere je znano, da povzročajo avtosomno dominanten FSGS pri odraslih, če so mutirani. Dodatne študije so upravičene za razjasnitev, kako Myo9A medsebojno deluje s podocitnim RhoA, citoskeletnimi proteini in proteini diafragme z režami, in ali napake, ki jih posreduje Myo9A, v navzkrižni povezavi aktina in tvorbi snopov neposredno spremenijo strukturo citoskeleta podocitov. Omejitve te študije za ugotavljanje vzročne zveze vključujejo nezmožnost razširitve rodovnika genotipa probanda in pomanjkanje dodatnih sorodnikov z isto mutacijo. Potrebne so nadaljnje študije za potrditev naših ugotovitev WES pri dodatnih bolnikih z družinsko ali občasno FSGS pred p.Arg701*Različica MYO9Ase lahko obravnava kot povzročitelj bolezni in te informacije se lahko uporabijo za klinično odločanje.

RAZKRITJE

Vsi avtorji so izjavili, da nimajo konkurenčnih interesov.

ZAHVALA

To delo so podprli donacije Nacionalnega inštituta za zdravje za AT (NIH-RO1DK109434) in Yale Center for Mendelian Genomics (NIH-U54-HG006504).

Zahvaljujemo se M. Saleemu (Univerza v Bristolu, Združeno kraljestvo) za zagotavljanje ovekovečenih človeških podocitov, G. Moeckelu (Medicinska šola Yale, Oddelek za patologijo) za zagotavljanje slik biopsije, laboratoriju S. Ishibe (Medicinska šola Yale, Oddelek za medicino/ Nefrologija) za nasvete o izolaciji podocitov in testu adhezije, T. Ardito (Medicinska fakulteta Yale, Oddelek za patologijo) in V. Kakade (Medicinska šola Yale, Oddelek za medicino/nefrologijo) za prispevke k IF

in konfokalno slikanje, SueAnn Mentone (Yale School of Medicine, Oddelek za celično in molekularno fiziologijo) za prispevke k študijam EM,žariščna segmentna glomerulosklerozabolnike in družine ter repozitorij Nacionalnega inštituta za sladkorno bolezen ter prebavne in ledvične bolezni (FSGS-CT, NCT00135811) za zagotavljanje vzorcev DNK.

DODATNO GRADIVO

Dodatna datoteka (PDF)

Dopolnilne metode. Analiza podatkov WES in bioinformatike, ustvarjanje trkačih miši Myo9AR701X in druge podrobne metode.

Slika S1. Immuno-EM lokalizira ekspresijo Myo9A na mišje glomerularne podocite in tubularni epitelij.

Slika S2. Myo9AR701X/R701X povzroča neonatalni progresivni hidrocefalus.

Slika S3. Postnatalna ledvična histologija pri mutiranih miših Myo9AR701X.

Slika S4. Test migracije podocitov (test rane).

Tabela S1. Seznam vseh različic, ki si jih delijo bratje in sestre probanda.

Tabela S2. Seznam 64 genov FSGS-proteinurija-NS, zaslišanih v kohorti FSGS-CT. Dodatne reference.

REFERENCE

1. Wiggins RC. Spekter podocitopatij: enoten pogled na glomerularne bolezni. Kidney Int. 2007; 71: 1205–1214.

2. Sadowski CE, Lovric S, Ashraf S, et al. Enogenski vzrok v 29,5 odstotkih primerov na steroide odpornega nefrotskega sindroma. J Am Soc Nephrol. 2015; 26: 1279–1289.

3. Gee HY, Saisawat P, Ashraf S, et al. Mutacije ARHGDIA povzročajo nefrotski sindrom prek okvarjenega signaliziranja RHO GTPaze. J Clin Invest. 2013; 123: 3243–3253.

4. Gorman SW, Haider NB, Grieshammer U, et al. Kloniranje in razvojno izražanje nekonvencionalnega miozina IXA (MYO9A) gena v regiji Bardet-Biedlovega sindroma (BBS4) na kromosomu 15q22- q23. Genomika. 1999; 59: 150–160.

5. Bayram Y, Karaca E, Coban Akdemir Z, et al. Molekularna etiologija artrogripoze v več družinah večinoma turškega izvora. J Clin Invest. 2016; 126: 762–778.

6. O'Connor E, Töpf A, Müller JS, et al. Identifikacija mutacij v genu MYO9A pri bolnikih s prirojenim miasteničnim sindromom. možgani. 2016; 139: 2143–2153.

7. Masters TA, Kendrick-Jones J, Buss F. Miozini: organizacija domene, motorične lastnosti, fiziološke vloge in celične funkcije. Handb Exp Pharmacol. 2017; 235: 77–122.

8. Liu KC, Cheney RE. Miozini v celičnih stikih. Bioarhitektura. 2012; 2: 158–170.

9. Omelchenko T, Hall A. Myosin-IXA uravnava kolektivno migracijo epitelijskih celic z usmerjanjem aktivnosti RhoGAP na stike med celicami. Curr Biol. 2012; 22: 278–288.

10. Sekine T, Konno M, Sasaki S, et al. Pri bolnikih z Epstein-Fechtnerjevim sindromom zaradi mutacij MYH9 R702 se razvije progresivna proteinurična ledvična bolezen. Kidney Int. 2010; 78: 207–214.

11. Mele C, Iatropoulos P, Donatelli R, et al. Mutacije MYO1E in družinska žariščna segmentna glomeruloskleroza v otroštvu. N Engl J Med. 2011; 365: 295–306.

12. Krendel M, Kim SV, Willinger T, et al. Motnje miozina 1e spodbujajo poškodbo podocitov. J Am Soc Nephrol. 2009;20:86–94.

13. Bähler M, Elfrink K, Hanley PJ, et al. Celične funkcije miozina razreda IX v epiteliju in imunskih celicah. Biochem Soc Trans. 2011; 39: 1166–1168.

14. Abouhamed M, Grobe K, San IV, et al. Miozin IXa uravnava diferenciacijo epitelija, njegovo pomanjkanje pa povzroči hidrocefalus. Mol Biol Cell. 2009; 20: 5074–5085.

15. Thelen S, AbouhamedM, Ciarimboli G, et al. RhoGAPmyosin IXa je regulator delovanja ledvičnih tubulov. Am J Physiol Renal Physiol. 2015; 309: F501–F513.

16. Saczko-Brack D, Warchol E, Rogez B, et al. Samoorganizacija aktinskih mrež z monomernim miozinom. Proc Natl Acad Med US A. 2016; 113: E8387–E8395.

17. Asanuma K, Yanagida-Asanuma E, Faul C, et al. Synaptopodin orkestrira organizacijo aktina in gibljivost celic z regulacijo signalizacije RhoA. Nat Cell Biol. 2006; 8: 485–491.

18. Mouawad F, Tsui H, Takano T. Vloga Rho-GTPaz in njihovih regulativnih proteinov pri delovanju glomerulnih podocitov. Can J Physiol Pharmacol. 2013; 91: 773–782.

19. Brown EJ, Schlöndorff JS, Becker DJ, et al. Mutacije v formin genu INF2 povzročajo žariščno segmentno glomerulosklerozo. Nat Genet. 2010; 42: 72–76.

20. Akilesh S, Suleiman H, Yu H, et al. Arhgap24 inaktivira Rac1 v mišjih podocitih, mutantna oblika pa je povezana z družinsko žariščno segmentno glomerulosklerozo. J Clin Invest. 2011; 121: 4127–4137.

21. Choi M, Scholl I, Ji W, et al. Genetska diagnoza z zajemanjem celotnega eksoma in masivnim vzporednim sekvenciranjem DNK. Proc Natl Acad Sci US A. 2009; 106: 19096–19101.

22. Choi M, Scholl UI, Yue P, et al. Mutacije kanala Kþ v adrenalnih adenomih, ki proizvajajo aldosteron, in dedni hipertenziji. Znanost. 2011; 331: 768–772.

23. Bamshad MJ, Shendure JA, Valle D, et al. Centri za mendelsko genomiko: nova obsežna pobuda za identifikacijo genov, na katerih temeljijo redka mendelska stanja. Am J Med Gen. 2012; 158A: 1523–1525.

24. Li H, Durbin R. Hitra in natančna poravnava kratkega branja s transformacijo Burrows-Wheeler. Bioinformatika. 2009; 25: 1754–1760.

25. McKenna A, Hanna M, Banks E, et al. Komplet orodij za analizo genoma: ogrodje MapReduce za analizo podatkov o zaporedju DNK naslednje generacije. Genome Res. 2010; 20: 1297–1303.

26. Yang H, Wang K. Genomska variantna označba in prednostna naloga z ANNOVAR in wANNOVAR. Nat Protoc. 2015; 10: 1556–1566.

27. Dong C, Wei P, Jian X, et al. Primerjava in integracija metod napovedovanja škodljivosti za nesinonimne SNV v študijah sekvenciranja celotnega eksoma. Hum Mol Genet. 2015; 24: 2125–2137.

28. Sim NL, Kumar P, Hu J, et al. Spletni strežnik SIFT: napovedovanje učinkov aminokislinskih substitucij na beljakovine. Nucleic Acids Res. 2012; 40: W452–W457.

29. Rentzsch P, Witten D, Cooper GM, et al. CADD: napovedovanje škodljivosti variant v človeškem genomu. Nucleic Acids Res. 2019; 47: D886–D894.

30. Yang H, Wang H, Jaenisch R. Ustvarjanje gensko spremenjenih miši z uporabo CRISPR/Cas-posredovanega genomskega inženiringa. Nat Protoc. 2014; 9: 1956–1968.

31. Veron D, Bertuccio CA, Marlier A, et al. Prekomerna ekspresija vaskularnega endotelnega rastnega faktorja podocitov (Vegf₁₆₄) povzroča hudo nodularno glomerulosklerozo pri mišjem modelu sladkorne bolezni tipa 1. Diabetologija. 2011; 54: 1227–1241.

32. Veron D, Reidy K, Marlier A, et al. Indukcija čezmerne ekspresije podocitov VEGF164 na različnih stopnjah razvoja povzroči prirojeno nefrozo ali na steroide odporen nefrotski sindrom. Am J Pathol. 2010; 177: 2225–2233.

33. Zou Z, Chung B, Nguyen T, et al. Povezovanje receptorsko posredovane endocitoze in celične signalizacije: dokazi za regulirano intramembransko proteolizo megalina v proksimalnem tubulu. J Biol Chem. 2004; 279: 34302–34310.

34. Bertuccio C, Veron D, Aggarwal PK, et al. Neposredna interakcija receptorja vaskularnega endotelnega rastnega faktorja 2 z nefrinom povezuje signale VEGF-A z aktinom v ledvičnih podocitih. J Biol Chem. 2011; 286: 39933–39944.

35. Veron D, Aggarwal PK, Velazquez H, et al. Povečanje funkcije VEGF-a, specifično za podocite, povzroči nodularno glomerulosklerozo pri ničelnih miših eNOS. J Am Soc Nephrol. 2014; 25: 1814–1824.

36. Reidy KJ, Aggarwal PK, Jimenez JJ, et al. Presežek podocitnega semaforina-3A povzroči glomerularno bolezen, ki vključuje interakcijo pleksinaA1-nefrina. Am J Pathol. 2013; 183: 1156–1168.

37. Tian X, Kim JJ, Monkley SM, et al. Talin1, povezan s podociti, je kritičen za vzdrževanje pregrade glomerularne filtracije. J Clin Invest. 2014; 124: 1098–1113.

38. Ni L, Saleem M, Mathieson PW. Kultura podocitov: triki trgovine. Nefrologija (Carlton). 2012; 17: 525–531.

39. Ren XD, Kiosses WB, Schwartz MA. Regulacija majhnega GTP-vezavnega proteina Rho s celično adhezijo in citoskeletom. EMBO J. 1999; 18: 578–585.

40. Duvall L, Rashmi P, Lopez-Rivera E, et al. Proteasomska razgradnja Nck1, vendar ne Nck2, uravnava aktivacijo RhoA in dinamiko aktina. Nat Commun. 2013; 4: 2863.

41. Kopp JB, Winkler CA, Zhao X, et al. Klinične značilnosti in histologija nefropatije, povezane z apolipoproteinom l1-, v kliničnem preskušanju FSGS. J Am Soc Nephrol. 2015; 26: 1443–1448.

42. Kurosaki T, Maquat LE. Nesmiselno posredovan razpad mRNA pri ljudeh na prvi pogled. J Cell Sci. 2016; 129: 461–467.

43. MacArthur DG, Manolio TA, Dimmock DP, et al. Smernice za raziskovanje vzročnosti variant zaporedja pri človeških boleznih. Narava. 2014; 508: 469–476.

44. Richards S, Aziz N, Bale S, et al. Standardi in smernice za razlago variant zaporedja: skupno soglasno priporočilo Ameriškega kolidža za medicinsko genetiko in genomiko ter Združenja za molekularno patologijo. Genet Med. 2015; 17: 405–424.

45. Wang M, Chun J, Genovese G, et al. Prispevki redkih genskih različic k družinskemu in občasnemu FSGS. J Am Soc Nephrol. 2019; 30: 1625–1640.

46. ​​Karczewski KJ, Francioli LC, Tiao G, et al. Spekter mutacijskih omejitev je bil kvantificiran iz variacij pri 141.456 ljudeh. Narava. 2020; 581: 434–443.

47. Maddirevula S, Alzahrani F, Al-Owain M, et al. Avtozigoma in visoko zmogljiva potrditev kandidature genov bolezni. Genet Med. 2019; 21: 736–742.

48. O'Connor E, Phan V, Cordts I, et al. Pomanjkanje MYO9A v motoričnih nevronih je povezano z zmanjšanim nevromuskularnim izločanjem agrina. Hum Mol Genet. 2018; 27: 1434–1446.

49. Sárközy M, Zvara A, Gyémánt N, et al. Metabolični sindrom vpliva na vzorec ekspresije srčnega gena na ravni transkripta pri samcih ZDF podgan. Cardiovasc Diabetol. 2013; 12:16.

50. Lepori N, Zand L, Sethi S, et al. Klinični in patološki fenotip genetskih vzrokov žariščne segmentne glomeruloskleroze pri odraslih. Clin Kidney J. 2018; 11: 179–190.

51. Eshbach ML, Weisz OA. Receptorsko posredovana endocitoza v proksimalnem tubulu. Annu Rev Physiol. 2017; 79: 425–448.

52. Bouligand J, Delmer B, Heart AC, et al. Haploinsuficienca družinskega glukokortikoidnega receptorja zaradi nesmiselnega razpada mRNA, nadledvične hiperplazije in očitnega presežka mineralokortikoidov. PLoS One. 2010;5. e13563.

53. Yi F, Kong R, Ren J, et al. Nekanonski Myo9b-RhoGAP pospeši hidrolizo RhoA GTP z mehanizmom dvojnega prsta arginina. J Mol Biol. 2016; 428: 3043–3057.

54. Tian D, Jacobo SM, Billing D, et al. Antagonistična regulacija dinamike aktina in gibljivosti celic s kanali TRPC5 in TRPC6. Sci Signal. 2010;26:3. ra77.

55. Wang L, Ellis MJ, Gomez JA, et al. Mehanizmi proteinurije, ki jo povzročajo Rho GTPaze. Kidney Int. 2012; 81: 1075–1085.

56. Kistler AD, Altintas MM, Reiser J. Podocitne GTPaze uravnavajo dinamiko ledvičnega filtra. Kidney Int. 2012; 81: 1053–1055.

57. Cory G. Preizkus prask in ran. Metode Mol Biol. 2011; 769: 25–30.

Kidney International (2021) 99, 1102–1117; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2020.12.022

Avtorska pravica ª 2021, Mednarodno združenje za nefrologijo. Izdalo Elsevier Inc. To je članek z odprtim dostopom pod licenco CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Korespondenca: Alda Tufro, Oddelek za pediatrijo/nefrologijo, Medicinska fakulteta Univerze Yale, 333 Cedar Street, New Haven, Connecticut 06520, ZDA. E-pošta: alda.tufro@yale.edu 6 Trenutna povezanost: Nefrologija, Otroška nacionalna bolnišnica, Washington, DC, ZDA. 7 Trenutna pripadnost: Nefrologija, Bolnišnica za bolne otroke, Univerza v Torontu, Toronto, Ontario, Kanada. Prejeto 21. maja 2020; revidirano 4. decembra 2020; sprejet 10. decembra 2020; objavljeno na spletu 4. januarja 2021