Glukoza ima antimelanogeni učinek s posredno inaktivacijo tirozinaze v melanocitih in ekvivalentu človeške kože
Mar 22, 2023
Povzetek:
Sladkorji so vseprisotni v organizmih in so znane kozmetične sestavine za vlaženje kože z minimalnimi stranskimi učinki. Glukoza, preprost sladkor, ki ga žive celice uporabljajo kot vir energije, se pogosto uporablja v izdelkih za nego kože. Več poročil je pokazalo, da imajo sladkor in sladkorju sorodne spojine antimelanogene učinke na melanocite. Vendar osnovni molekularni mehanizem, s katerim glukoza zavira sintezo melanina, ni znan, čeprav se glukoza uporablja kot belilna in vlažilna sestavina v kozmetiki. Pri tem smo ugotovili, da je glukoza znatno zmanjšala vsebnost melanina v celicah B16, stimuliranih s hormonom, ki stimulira melanocite (MSH), in temno pigmentiranih normalnih človeških melanocitih brez znakov citotoksičnosti.
Poleg tega je lokalno zdravljenje z glukozo pokazalo svojo učinkovitost beljenja s fotografijo, obarvanjem po Fontana-Massonu (F&M) in večfotonsko mikroskopijo v pigmentiranem 3D modelu človeške kože MelanoDerm. Vendar pa glukoza ni spremenila izražanja genov ali ravni beljakovin glavnih melanogenih beljakovin v melanocitih. Medtem ko je glukoza močno zmanjšala znotrajcelično aktivnost tirozinaze v melanocitih, ni zmanjšala aktivnosti gobje tirozinaze v poskusnem sistemu brez celic. Vendar se je glukoza presnovila v mlečno kislino, ki lahko močno zavre aktivnost tirozinaze. Tako smo zaključili, da glukoza posredno zavira aktivnost tirozinaze s pretvorbo v mlečno kislino, kar pojasnjuje njene antimelanogene učinke v melanocitih.
Tirozinaza je encim, ki lahko razgradi tirozin v beljakovinah in ga pretvori v produkte oksidacije tirozina, kot je tirozin fenol in druge snovi. Ta encim je zelo prisoten v človeškem telesu, zlasti v prebavnem traktu, kjer sodeluje pri prebavi in absorpciji hrane. Hkrati so v raziskavi ugotovili, da lahko cistanča zmanjša aktivnost tirozinaze in tako pobeli kožo.
Ključne besede:
melanogeneza; sladkor; glukoza; tirozinaza; ekvivalent človeške kože
1. Uvod
Melanogeneza je proces proizvodnje melanina in je bistvenega pomena za zaščito kože. Melanin absorbira ultravijolično (UV) svetlobo in ščiti kožo pred škodljivimi učinki UV svetlobe in prostimi radikali [1]. Ker pa prekomerna proizvodnja melanina povzroča hiperpigmentacijo, kot so pege in lentigo, ki se lahko štejejo za neestetske, je bilo veliko raziskav posvečenih iskanju učinkovitih depigmentiranih sestavin za kozmetiko ali zdravila [2–4].
Sladkor je močan vlažilec za vlaženje kože in se uporablja kot kozmetična sestavina za vlaženje kože z minimalnimi stranskimi učinki. Poleg tega sladkorji in s sladkorjem sorodni agensi vplivajo na melanogenezo [5,6]. Glikozilacijo tirozinaze, ključnega encima, ki sodeluje pri sintezi melanina, je mogoče spremeniti, zavirati njeno katalitično aktivnost in pospešiti njeno razgradnjo [7]. Vloga sladkorjev pri melanogenezi je bila poudarjena s študijami, ki so preučevale učinek glikozilacije na pigmentacijski fenotip melanocitov in vlogo sladkornih ostankov na katalitično aktivnost tirozinaze [5–7]. Nekatere študije so poročale, da lahko derivati sladkorja zavirajo zorenje tirozinaze, kar vpliva na njeno glikozilacijo. Na primer, N-acetilglukozamin (NAG), aminoheksoza, proizvedena fiziološko z dodatkom amino skupine k glukozi, moti glikozilacijo tirozinaze, kar ima za posledico učinke depigmentacije na koži morskih prašičkov in človeški koži [8].
Poleg tega so nedavne študije pokazale, da spojine, povezane s sladkorjem, zavirajo izražanje ali aktivacijo tirozinaze ter spremenijo njeno glikozilacijo. Na primer, ocenili smo učinkovitost beljenja galakturonske kisline (GA), sladkorne kisline, ki je oksidirana oblika galaktoze in glavna sestavina pektina. Galakturonska kislina ima učinek beljenja z uravnavanjem aktivnosti in izražanja tirozinaze v celicah mišjega melanoma B16 in ekvivalentu človeške kože [9]. V drugem poročilu je nova vrsta cikličnega oligosaharida, znana kot ciklična nitrozil nigeroza (CNN), pokazala šibak, a pomemben neposredni zaviralni učinek na encimsko aktivnost tirozinaze, kar kaže na enega od možnih mehanizmov hipopigmentacije [10]. Podobno kot dozorevanje tirozinaze s pravilno glikozilacijo je lahko izražanje ali aktivnost CNN tarča antimelanogenih sredstev [11]. Vendar imajo številna antimelanogena sredstva resne stranske učinke, kot je vitiligo [12,13]. Zato obstaja veliko zanimanje za varnejše spojine za depigmentacijo.
Tu smo raziskali antimelanogene učinke glukoze na celice mišjega melanoma B16 in normalne človeške melanocite. Poleg tega smo pregledali barvo tkiva in epidermalni status z barvanjem odsekov tkiva ekvivalenta človeške kože. Na podlagi naših ugotovitev predlagamo, da je učinek beljenja glukoze odvisen od proizvodnje mlečne kisline, kar ima za posledico inaktivacijo tirozinaze.
2. Rezultati
2.1. Antimelanogena učinkovitost glukoze v B16 in NHM
Za raziskovanje antimelanogenega učinka glukoze smo uporabili dve vrsti melanocitov, celice melanoma B16 (celična linija mišjega melanoma) in normalne človeške melanocite (NHM). Najprej smo ugotovili, ali je glukoza strupena za celice B16. Glukoza ni pokazala nobene citotoksičnosti pri koncentracijah do 100 mM v celicah B16, kot je prikazano na sliki 1A. Na podlagi podatkov o citotoksičnosti smo celice B16 obdelovali z različnimi koncentracijami glukoze 72 ur v prisotnosti -melanocite stimulirajočega hormona (MSH), induktorja melanogeneze. Kot je prikazano na sliki 1B, je glukoza jasno in znatno znižala vsebnost znotrajceličnega melanina na način, ki je odvisen od odmerka. Kojična kislina (KA) je bila uporabljena kot referenčna spojina za preprečevanje melanogeneze, ker se pogosto uporablja kot kozmetična sestavina za posvetlitev kože [1,3,4]. Barva lizatov v celicah, obdelanih z glukozo, je bila svetlejša od barve kontrolnih celic (slika 1C).
Poleg tega smo potrdili, da se je količina melanina, izločenega v gojišča kulture, zmanjšala in da je barva gojišča svetlejša (slika 1D). Nato smo raziskali antimelanogeni učinek glukoze na temno pigmentirane NHM. Glukoza v koncentracijah do 100 mM ni bila citotoksična do štiri dni (slika 1E). Ko smo določili vsebnost melanina po zdravljenju NHM z glukozo 4 dni, smo ugotovili, da se je vsebnost melanina zmanjšala v odvisnosti od odmerka (slika 1F). Ti rezultati skupaj kažejo, da glukoza zavira sintezo melanina v melanocitih.
2.2. Belilni učinek glukoze na ekvivalent 3D človeške kože
Za nadaljnjo opredelitev antimelanogene sposobnosti glukoze smo uporabili pigmentiran 3D model človeške kože, MelanoDerm. Kot je opisano v razdelku Materiali in metode, je bila glukoza lokalno nanesena na MelanoDerm 18 dni, viabilnost celic pa je bila določena s testom CCK-8. Kot je prikazano na sliki 2A, po zdravljenju z glukozo 18 dni niso opazili tkivne citotoksičnosti. Spremembe barve tkiva so bile ocenjene s fotografijo. Kot je prikazano na sliki 2B, je bilo tkivo, obdelano z glukozo, svetlejše barve kot tkivo, obdelano s fosfatnim pufrom (PBS). Poleg tega je barvanje s hematoksilinom in eozinom (H&E) pokazalo, da glukoza ni povzročila kolapsa tkiva, medtem ko je barvanje s fontano-masson (F&M) pokazalo, da je glukoza zmanjšala število hiperpigmentiranih melanocitov (kot je prikazano s puščicami) v bazalni plasti (slika 2C). .
Za nadaljnje raziskovanje sprememb v vsebnosti melanina smo primerjali avtofluorescenčne signale melanina v melanocitnih plasteh tkiv, obdelanih s PBS in glukozo, z uporabo fluorescenčne mikroskopije z dvofotonskim vzbujanjem (TPEF), kot je prikazano na sliki 2D. Analiza teh slik je pokazala, da se je volumen melanina zmanjšal za približno 36 odstotkov in da se je intenzivnost signala TPEF za melanin v območju, bogatem z melanociti, zmanjšala za približno 38 odstotkov v tkivih, obdelanih z glukozo, v primerjavi s tkivi, obdelanimi s PBS.
Slika 2. Ekvivalent učinka glukoze na človeško kožo, MelanoDerm. (A) Sposobnost preživetja ekvivalentov človeške kože, obdelanih z glukozo. (B) Ekvivalenti človeške kože (MelanoDerm; n=3) so bili topikalno obdelani z glukozo 18 dni in nato fotografirani. Vrednost ∆L označuje stopnjo lahkotnosti v primerjavi s tkivom, obdelanim s PBS. (C) H&E in F&M barvanje delov tkiva. Predmetna stekelca smo fiksirali v raztopini formaldehida in vdelali v parafinski vosek za obarvanje (lestvica, 5{{10}} µm). Črne puščice označujejo pigmentirane melanocite. (D) Slikanje melanina (200 × 200 × 60 µm3) ekvivalentov človeške kože je bilo izvedeno z uporabo mikroskopije TPEF. Psevdoobarvani (rdeči) signali označujejo melanin (lestvica, 50 µm). Grafi prikazujejo kvantifikacijo volumna melanina in signalov TPEF. Podatki so izraženi kot povprečje ± SD vsaj treh neodvisnih meritev (*p < 0,05, ***p < 0,001).
2.3. Vpliv glukoze na izražanje melanogenih proteinov v melanocitih
Da bi razjasnili mehanizem depigmentacije glukoze v melanocitih, smo nato ocenili njen učinek na izražanje melanogenih encimov, kot sta tirozinaza in Tyrp-1, v celicah B16 in NHM. Celice B16 smo obdelali z glukozo za navedene čase v prisotnosti -MSH. Nato smo z Western blot analizo določili beljakovinske ravni tirozinaze in Tyrp-1 (slika 3A). Ravni izražanja tirozinaze in Tyrp-1 niso bile znižane z glukozo v nobenem trenutku. Poleg tega glukoza v celicah B16, stimuliranih z -MSH, ni vplivala na ravni transkripta tirozinaze (slika 3B). Podobno kot pri celicah B16 glukoza ni inhibirala ravni beljakovin tirozinaze, Tyrp-1 in MITF (slika 3C) v celicah NHM, zdravljenih z glukozo, ravni mRNA tirozinaze in Tyrp-1 pa tudi niso bile zavrte. znižala, vendar nekoliko povečala z glukozo (slika 3D).
Slika 3. Učinek glukoze na izražanje melanogenih proteinov v celicah B16 in NHM. (A, B) Celice B16 smo tretirali z -MSH za navedeni čas v prisotnosti ali odsotnosti 20 mM glukoze. Nato sta bila izvedena testa Western blot (A) in qRT-PCR (B). (C) NHM so bili 48 ur obdelani z navedenimi koncentracijami glukoze. Nato je bil izveden Western blot test. (D) NHM smo obdelali z navedenim časom v prisotnosti 50 mM glukoze. Nato so bili izvedeni testi qRT-PCR. Podatki so izraženi kot povprečje ± SD vsaj treh neodvisnih meritev.
2.4. Vpliv glukoze na aktivnost tirozinaze
Za nadaljnjo opredelitev mehanizma delovanja glukoze smo testirali, ali ima zaviralni učinek na aktivnost gobove tirozinaze. Kot je prikazano na sliki 4A, smo ugotovili, da glukoza nima zaviralnega učinka na aktivnost tirozinaze gob, kar kaže, da glukoza ne vpliva neposredno na aktivnost tirozinaze. Nato smo izvedli test celotne intracelularne aktivnosti tirozinaze z uporabo celičnih lizatov, obdelanih z glukozo, iz celic B16 in NHM. Zanimivo je, da je bila aktivnost znotrajcelične tirozinaze v prisotnosti -MSH inhibirana na način, ki je odvisen od odmerka, v celicah B16, obdelanih z glukozo (slika 4B). V NHM je glukoza zavirala tudi znotrajcelično aktivnost tirozinaze (slika 4C). Ti podatki podpirajo možnost, da glukoza posredno inaktivira tirozinazo v melanocitih.
Slika 4. Vpliv glukoze na aktivnost tirozinaze. (A) Vpliv glukoze na aktivnost gobove tirozinaze v brezceličnem sistemu. (B, C) Test aktivnosti celične tirozinaze. (B) Celice B16 so bile 24 ur obdelane z navedenimi koncentracijami glukoze. Nato je bil izveden test aktivnosti celične tirozinaze, kot je opisano v razdelku o metodah. (C) NHM smo obdelali s 5 0 mM glukoze za navedeni čas. Nato je bil izveden test aktivnosti celične tirozinaze, kot je opisano v razdelku o metodah. Aktivnost celične tirozinaze je bila normalizirana s skupno vsebnostjo beljakovin. Podatki so izraženi kot povprečje ± SD vsaj treh neodvisnih meritev (*p < 0.05, **p < 0,01, ***p < 0,001).
2.5. Inaktivacija tirozinaze s proizvodnjo mlečne kisline v melanocitih, obdelanih z glukozo
Glukoza se pretvori v celični presnovek laktat, ki je mlečna kislina v raztopini in za katerega so poročali, da je učinkovit pri zdravljenju pigmentnih lezij [14,15]. Zato smo domnevali, da se glukoza v melanocitih pretvori v mlečno kislino in da povečane ravni mlečne kisline zavirajo melanogenezo z inaktivacijo tirozinaze. Za ovrednotenje te hipoteze smo najprej ocenili proizvodnjo mlečne kisline v medijih iz melanocitov, obdelanih z glukozo. Kot je bilo pričakovano, je glukoza bistveno dvignila vsebnost mlečne kisline v gojiščih celic B16 (slika 5A). Poleg tega, ker je znano, da mlečna kislina neposredno zavira aktivnost tirozinaze [15], smo ocenili, ali mlečna kislina zavira aktivnost tirozinaze gob. Kot je prikazano na sliki 5B, je mlečna kislina v nasprotju z glukozo močno zavirala aktivnost gobje tirozinaze. Ti rezultati kažejo, da ima pretvorba glukoze v mlečno kislino antimelanogeni učinek prek inaktivacije tirozinaze z mlečno kislino.
Slika 5. Proizvodnja laktata z glukozo in učinek mlečne kisline na aktivnost tirozinaze. (A) Proizvodnja laktata v celicah B16, obdelanih z glukozo. (A) Celice B16 smo 3 dni obdelali z navedenimi koncentracijami glukoze. Nato je bil izveden test laktata z uporabo gojišča, kot je opisano v razdelku o metodah. (B) Vpliv mlečne kisline na aktivnost gobove tirozinaze v brezceličnem sistemu. Podatki so izraženi kot povprečje ± SD vsaj treh neodvisnih meritev (*p < 0.05, **p < 0,01, ***p < 0,001) .
3. Razprava
Sladkorji ali snovi, pridobljene iz sladkorja, se pogosto uporabljajo kot kozmetične sestavine za zaščito kože in fiziološki nadzor. Na primer, rafinoza poveča od mTOR neodvisno avtofagijo in zmanjša celično smrt v z UVB obsevanimi keratinociti, kar kaže, da ima naravno sredstvo rafinoza potencialno vrednost pri omejevanju fotopoškodbe [16]. Trehaloza in saharoza sta nova aktivatorja avtofagije v človeških keratinocitih po od mTOR neodvisni poti [17]. Te ugotovitve zagotavljajo nov vpogled v s sladkorjem posredovano regulacijo avtofagije v keratinocitih. V primeru glukoze se je pokazalo, da lokalna glukoza inducira izražanje klavdina-1 in filagrina v mišjem modelu atopijskega dermatitisa in kulture keratinocitov, kar kaže, da ima protivnetni učinek s popravljanjem funkcije kožne pregrade [18]. Poleg tega glukoza zavira proliferacijo in poveča diferenciacijo kožnih keratinocitov [19]. Zato glukoza uravnava različne vidike epidermalne fiziologije, kot so funkcije kožne pregrade in ravni hidracije keratinocitov.
Sladkorji lahko delujejo kot sredstva za depigmentacijo prek več različnih mehanizmov, ki vključujejo tirozinazo. Na primer, nekatera sredstva zavirajo zorenje tirozinaze, medtem ko druga sredstva inducirajo zaviranje izražanja ali aktivnosti gena tirozinaze [5,8–10]. Vendar pa je nekaj študij raziskalo mehanizme, na katerih temeljijo učinki glukoze na depigmentacijo.
Da bi ugotovili učinek glukoze na melanogenezo, smo se predhodno osredotočili na jetrne X receptorje (LXR), ki so z ligandom aktivirani jedrski receptorji, ki igrajo ključno vlogo pri presnovi lipidov in homeostazi holesterola [20]. Ugotovili smo, da aktivacija jetrnega X receptorja zavira melanogenezo s pospeševanjem razgradnje transkripcijskega faktorja, povezanega z mikroftalmijo (MITF), ki ga posreduje zunajcelični signal regulirana kinaza (ERK) [21]. Poleg tega je glukoza endogeni ligand LXR [22]. Tako smo domnevali, da ima glukoza antimelanogene učinke zaradi aktivacije od LXR odvisne poti. Vendar, kot je prikazano na sliki 3C, glukoza ni spremenila ravni izražanja tirozinaze ali MITF, čeprav je aktivacija LXR zmanjšala ravni izražanja teh proteinov v melanocitih.
Zato smo zaključili, da ima glukoza depigmentacijske učinke na melanocite neodvisno od aktivacije LXR.
Glukoza je glavni substrat za proizvodnjo energije in se hidrolizira prek serijskih reakcij več encimov, znanih kot glikoliza. Številne študije so pokazale, da ima glikoliza le en končni produkt, mlečno kislino, bodisi v aerobnih ali anaerobnih pogojih. V aerobnih pogojih (O2) se laktat uporablja kot substrat mitohondrijske laktat dehidrogenaze (MLD). LDH ga pretvorijo v piruvat, ki vstopi v cikel trikarboksilne kisline (TCA). V anaerobnih pogojih (N2) se laktat kopiči v citosolu. Zato se pot glikolize začne z glukozo kot substratom in konča s proizvodnjo laktata kot glavnega končnega produkta [23]. Poleg tega David et al. izmeril delež glukoze, ki se je pretvoril v mlečno kislino ali piruvat v normalnem človeškem melanocitu [24]. Večina metabolitov glukoze je bila mlečna kislina in ne piruvat.
Mlečna kislina je alfa hidroksi kislina (AHA); te kisline se v veliki meri uporabljajo v kozmetičnih formulacijah kot sredstva za površinsko luščenje [25]. Poleg tega mlečna kislina zavira tvorbo melanina z neposrednim zaviranjem aktivnosti tirozinaze, kar je učinek neodvisen od njene kisle narave, kar pomeni, da učinki mlečne kisline na pigmentne lezije niso le posledica pospeševanja presnove epidermalnih celic, temveč tudi neposrednega zaviranja tvorbe melanina v melanociti [15]. Tako smo sklepali, da lahko glukoza izvaja svoj antimelanogeni učinek s proizvodnjo mlečne kisline, ker se glukoza lahko pretvori v mlečno kislino. Kot je bilo pričakovano, smo ugotovili, da je zdravljenje z glukozo povzročilo proizvodnjo mlečne kisline v melanocitih (slika 5A).
Poleg tega smo potrdili, da mlečna kislina močno in neposredno zavira aktivnost tirozinaze (slika 5B). Usuki et al. odkrili tudi, da mlečna kislina zmanjša znotrajcelično aktivnost tirozinaze v celicah B16 in človeških celicah HM3KO [15]. V poročilu mlečna kislina ni vplivala na ravni mRNA in beljakovin tirozinaze in Tyrp-1. Ti podatki skupaj kažejo, da glukoza poveča proizvodnjo mlečne kisline in da ta mlečna kislina neposredno zavira aktivnost tirozinaze, ne da bi vplivala na ravni izražanja genov, kar kaže, da ima glukoza antimelanogeni učinek v melanocitih preko posredne inaktivacije tirozinaze, ki je odvisna od proizvodnje mlečne kisline. Vendar so potrebni nadaljnji poskusi za potrditev vloge mlečne kisline in glukoze pri depigmentaciji.
Skupni podatki iz te študije zagotavljajo predhodne dokaze, ki podpirajo uporabnost topikalne glukoze kot učinkovitega beljenja in vlažilnega reagenta, ki se lahko varno uporablja v kozmetičnih in medicinskih pripravkih.
4. Materiali in metode
4.1. Materiali
D-glukoza, -MSH, kojična kislina (KA), L-tirozin, L-DOPA in mlečna kislina so bili kupljeni pri Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ZDA). Protitelesa proti tirozinazi in aktinu so bila kupljena pri Abcam (Cambridge, UK). Protitelesa proti Tyrp-1 so bila kupljena pri Santa Cruz Biotechnology (CA, ZDA). Protitelesa proti MITF so bila kupljena pri Proteintech (mesto, IL, ZDA).
4.2. Celična kultura in test sposobnosti preživetja
Kupili smo celice mišjega melanoma B16, Dulbeccov modificiran Eagleov medij (DMEM) in fetalni goveji serum (FBS) iz ameriške zbirke tipskih kultur (ATCC, Manassas, VA, ZDA). Celice B16 smo gojili v DMEM, ki je vseboval 4500 mg/l visoke glukoze (ATCC 30-2002), kot priporoča proizvajalec (ATCC), dopolnjen s 5 odstotki FBS, in inkubirali pri 37 °C v vlažni atmosferi, ki je vsebovala 95 odstotkov zraka in 10 odstotkov CO2. Temno pigmentirani primarni NHM so bili kupljeni pri Thermo Fisher Scientific (# C2025C; Waltham, MA, ZDA). Celice smo gojili v mediju 254 (#M254500), dopolnjenem z dodatkom za rast človeških melanocitov (#S0025) in inkubirali pri 37 ◦C pod 5-odstotno atmosfero CO2. Za poskuse so bili uporabljeni primarni NHM med prehodi 4 in 7. Sposobnost preživetja gojenih celic je bila ocenjena s kompletom za štetje celic-8 (CCK-8), kot je opisal proizvajalec (DOJINDO, Tokio, Japonska).
4.3. Merjenje vsebnosti melanina
Vsebnost melanina je bila določena, kot je opisano v prejšnjih poročilih [2–4]. Na kratko, celice B16 smo 72 ur obdelali z navedenimi koncentracijami glukoze v prisotnosti -MSH (200 nM). NHM smo obdelali z navedenimi koncentracijami glukoze 4 dni. Nato smo vse celice sprali s fosfatno pufrano slanico (PBS) in raztopili v 1 N NaOH pri 60 °C 1 uro. Celične lizate smo prenesli na 96-ploščo z vdolbinicami in izmerili absorbanco pri 405 nm. Vrednosti so bile normalizirane na podlagi koncentracij beljakovin v vsaki vdolbinici vzorca.
4.4. Test aktivnosti gobove tirozinaze
Raziskovali smo neposredne učinke navedenih koncentracij glukoze na aktivnost gobje tirozinaze. Na kratko, 100 µL fosfatnega pufra, ki je vseboval glukozo, smo zmešali z gobjo tirozinazo (10 enot/jamico) in združili s 50 µL 0,03-odstotnega L-tirozina ali L-DOPA v destilirani vodi. Nato smo zmes skupaj inkubirali pri 37 ◦C 10 minut in izmerili absorbanco pri 405 nm. Kojična kislina (KA), dobro znano sredstvo proti tirozinazi, je bila uporabljena kot referenčna spojina.
4.5. Test znotrajcelične aktivnosti tirozinaze
Na kratko, celice B16 ali NHM so bile obdelane z navedenimi koncentracijami glukoze za navedene čase. Nato smo celice sprali s PBS in jih lizirali z inkubacijo v 50 mM fosfatnem pufru (pH 6,8), ki je vseboval 1 odstotek Tritona X-100 in 0,1 mM fenilmetil-sulfonil fluorida. Celične lizate smo nato centrifugirali pri 12,000 obratih na minuto pri 4 ◦C 20 minut. Zbrali smo supernatant, ki je vseboval celično tirozinazo, in določili vsebnost beljakovin za normalizacijo. Celični ekstrakt smo inkubirali z L-DOPA v fosfatnem pufru in spremljali tvorbo dopakroma z merjenjem absorbance pri 405 nm v 30 minutah.
4.6. Izolacija RNA in kvantitativna reverzna transkripcija-verižna reakcija s polimerazo v realnem času (qRT-PCR)
Za določitev relativne ekspresije mRNA izbranih genov smo celotno RNA izolirali s TRIzolom (Invitrogen, CA, ZDA) v skladu z navodili proizvajalca in 4 µg RNA reverzno prepisali v cDNA z uporabo RT-premix (Bioneer, Seul, Južna Koreja). Kvantitativni PCR je bil izveden s sistemom ABI 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, ZDA). Kompleti primerjev qRT-PCR za tirozinazo in Tyrp-1 so bili kupljeni pri Applied Biosystems, kompleti TaqMan Gene Expression Assay (Applied Biosystems) pa so bili uporabljeni za pomnoževanje. Ekspresija ciljnega gena je bila normalizirana na ekspresijo gena za gospodinjstvo, ki kodira podenoto stranskega stebla ribosomskega proteina P0 (RPLP0). Relativno kvantizacijo smo izvedli s primerjalno ∆∆Ct metodo po navodilih proizvajalca.
4.7. Western Blotting
Celice smo dvakrat sprali s hladnim PBS in nato lizirali v ledeno mrzlem modificiranem pufru RIPA (Cell Signaling Technology, MA, ZDA), ki je vseboval zaviralce proteaz (Calbiochem, La Jolla, CA, ZDA). Določena je bila skupna koncentracija beljakovin in beljakovine so bile ločene s SDS-PAGE na 4–12-odstotnem gradientu Bis-Tris gelov (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA), prenesene na nitrocelulozne membrane (Thermo Fisher Scientific). Po prenosu so bile membrane blokirane v 5-odstotni raztopini za blokiranje. Membrane smo inkubirali s primarnimi protitelesi pri 4 ◦C 24 ur, sprali s tris-pufrano fiziološko raztopino, ki je vsebovala 0.1 odstotkov Tween-20 (TBST), in izpostavili sekundarnim protitelesom, konjugiranim s peroksidazo, za 1 uro pri sobni temperaturi. Membrane smo trikrat splaknili s TBST. Kemiluminiscenčni signal je bil razvit z uporabo Western blotting ECL reagenta (GE Healthcare, Hatfield, UK).
4.8. Tridimenzionalni (3D) ekvivalent človeške kože
Kot model tkiva človeške kože smo uporabili MelanoDerm (MEL-300-B; MatTek Corp., Ashland, MA, ZDA). Ta sposobni, rekonstituirani 3D ekvivalent človeške kože je bil pridobljen iz črnih darovalcev in vsebuje normalne melanocite in keratinocite. MelanoDerm je bil gojen na vmesniku zrak-tekočina v mediju EPI-100-NMM-113 (MatTek Corp, Ashland, MA, ZDA). Pred obdelavo z glukozo smo tkiva sprali z 1 ml PBS, da smo odstranili ostanke spojin. Glukozo smo raztopili v PBS. Končna koncentracija glukoze je bila 2 odstotka. Kontrolni vzorec smo obdelali samo s PBS. Glukozo smo nanesli na MelanoDerm 1., 4., 6., 8., 11., 13. in 15. dan. Po 18 dneh so bila tkiva MelanoDerm fiksirana v 4-odstotnem puferskem formaldehidu, vdelana v parafin, razrezana na debelino 3 µm in izpostavljena na barvanje H&E in F&M. Sposobnost preživetja vzorcev tkiv je bila ocenjena s kompletom za štetje celic-8 (CCK-8), kot je opisal proizvajalec (DOJINDO, Tokio, Japonska). Pigmentacijo MelanoDerma so ocenili s primerjavo spremembe vrednosti L*.
4.9. Dvofotonsko vzbujevalno fluorescenčno slikanje (TPEF).
Za vizualizacijo porazdelitve melanina v 3D ekvivalentu človeške kože smo izvedli slikanje TPEF, kot je opisano v naših prejšnjih poročilih [3,4]. Na kratko, vsak pripravek MelanoDerm je bil fiksiran v 4-odstotnem formalinu 24 ur pri 4 ◦C in nato sprani s PBS/0.1 odstotki BSA (goveji serumski albumin, Merck, Branchburg, NJ, ZDA). Slike TPEF so bile pridobljene iz bazalne plasti za merjenje znotrajceličnega melanina v plasti melanocitov. Relativne intenzivnosti signala TPEF za melanin v volumnu meritev so bile kvantificirane s programsko opremo Image-Pro Premier 3D (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, ZDA).
4.10. Test L-laktata
Celice B16 so bile zasejane pri 1.0 × 105 celic na vdolbinico v 12-ploščo z vdolbinicami. Po 3-dnevnem zdravljenju z glukozo so bile ravni zunajceličnega laktata kvantificirane z uporabo kompleta za kolorimetrično analizo L-laktata (Abcam, ab65331, Cambridge, UK) v skladu s protokolom proizvajalca.
4.11. Statistična analiza
Podatki so izraženi kot srednje vrednosti ± SD (standardni odkloni), statistična značilnost pa je bila določena s Studentovim t-testom. P-vrednost < 0.05 je veljala za statistično pomembno.
Avtorski prispevki:
Konceptualizacija, H.-JK, JL in CSL; Urejanje podatkov, SHL; Preiskava, SHL; Metodologija, SHL, I.-HB in E.-SL; Supervision, JL in CSL; Pisanje—izvirni osnutek, SHL in CSL; Pisanje – pregled in urejanje, JL Vsi avtorji so prebrali in se strinjali z objavljeno različico rokopisa.
Financiranje:
To raziskavo je financiral Program za temeljne znanstvene raziskave prek Nacionalne raziskovalne fundacije Koreje (NRF), ki jo financira Ministrstvo za izobraževanje (Številka dotacije: 2018R1D1A1B07049402).
Nasprotja interesov:
Avtorji izjavljajo, da ni navzkrižja interesov.
Okrajšave
-MSH - melanocite stimulirajoči hormon
Tyrp-1 beljakovina 1, sorodna tirozinazi
Transkripcijski faktor, povezan z mikroftalmijo MITF
NHM so normalni človeški melanociti
Dvofotonska vzbujevalna fluorescenca TPEF
LXR jetrni X receptor
AHA alfa hidroksi kisline
H&E hematoksilin in eozin
F&M Fontana-Masson
Reference
1. Swalwell, H.; Latimer, J.; Haywood, RM; Birch-Machin, MA Raziskovanje vloge melanina pri UVA/UVB in z vodikovim peroksidom povzročeni celični in mitohondrijski ROS in poškodbi mitohondrijske DNK v celicah človeškega melanoma. Free Radic. Biol. med. 2012, 52, 626–634. [CrossRef]
2. Lee, CS; Jang, WH; Park, M.; Jung, K.; Baek, HS; Joo, YH; Park, YH; Lim, KM Nov derivat adamantil benzilbenzamida, AP736, zavira melanogenezo z inhibicijo cAMP-PKA-CREB-aktiviranega transkripcijskega faktorja, povezanega z mikroftalmijo, in izražanja tirozinaze. Exp. Dermatol. 2013, 22, 762–764. [CrossRef] [PubMed]
3. Lee, JH; Lee, ES; Bae, IH; Hwang, JA; Kim, SH; Kim, DY; Park, NH; Rho, HS; Kim, YJ; Oh, SG; et al. Antimelanogena učinkovitost zdravila Melasolv (3,4,5-trimetoksicinamat timol ester) v melanocitih in tridimenzionalnem ekvivalentu človeške kože. Skin Pharmacol. Physiol. 2017, 30, 190–196. [CrossRef] [PubMed]
4. Bae, IH; Lee, ES; Yoo, JW; Lee, SH; Ko, JY; Kim, YJ; Lee, TR; Kim, DY; Lee, CS Manozileritritolni lipidi zavirajo melanogenezo z zaviranjem signalizacije ERK-CREB-MITF-tirozinaze v normalnih človeških melanocitih in tridimenzionalnem ekvivalentu človeške kože. Exp. Dermatol. 2019, 28, 738–741. [CrossRef] [PubMed]
5. Bin, BH; Kim, ST; Bhin, J.; Lee, TR; Cho, EG Razvoj antimelanogenih sredstev na osnovi sladkorja. Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 583. [CrossRef]
6. Kumari, S.; Tien Guan Thng, S.; Kumar Verma, N.; Gautam, HK Zaviralci melanogeneze. Acta. Derm. Venereol. 2018, 98, 924–931. [CrossRef]
7. Ando, H.; Kondoh, H.; Ichihashi, M.; Sluh, VJ Pristopi za identifikacijo inhibitorjev biosinteze melanina s pomočjo nadzora kakovosti tirozinaze. J. Invest Dermatol. 2007, 127, 751–761. [CrossRef]
8. Hwang, JS; Lee, HY; Lim, TY; Kim, MY; Yoon, TJ. Prekinitev glikozilacije tirozinaze z N-acetilglukozaminom in njeni depigmentacijski učinki na koži morskega prašička in človeški koži. J. Dermatol. Sci. 2011, 63, 199–201. [CrossRef]
9. Lee, CS; Baek, HS; Bae, IH; Choi, SJ; Kim, YJ; Lee, JH; Kim, JW Učinkovitost depigmentacije galakturonske kisline z regulacijo tirozinaze v celicah mišjega melanoma B16 in tridimenzionalni ekvivalent človeške kože. Clin. Exp. Dermatol. 2018, 43, 708–712. [CrossRef]
10. Nakamura, S.; Kunikata, T.; Matsumoto, Y.; Hanaya, T.; Harashima, A.; Nishimoto, T.; Ushio, S. Učinki ne-ciklodekstrinskega cikličnega ogljikovega hidrata na celice mišjega melanoma: Karakterizacija nove vrste hipopigmentiranega sladkorja. PLoS ONE 2017, 12, e0186640. [CrossRef]
11. Khan, MT Novi inhibitorji tirozinaze iz naravnih virov – njihove računalniške študije. Curr. med. Chem. 2012, 19, 2262–2272. [CrossRef] [PubMed]
12. Solano, F.; Briganti, S.; Picardo, M.; Ghanem, G. Hypopigmentingagents: posodobljen pregled bioloških, kemičnih in kliničnih vidikov. Pigment. Celica. Res. 2006, 19, 550–571. [CrossRef] [PubMed]
13. Lee, CS; Joo, YH; Baek, HS; Park, M.; Kim, JH; Shin, HJ; Park, NH; Lee, JH; Park, YH; Shin, SS; et al. Različni učinki petih depigmentnih spojin, rododendrona, malinovega ketona, monobenzona, rucinola in AP736 na melanogenezo in sposobnost preživetja človeških epidermalnih melanocitov. Exp. Dermatol. 2016, 25, 44–49. [CrossRef] [PubMed]
14. Mulukutla, BC; Khan, S.; Lange, A.; Hu, WS Presnova glukoze v celični kulturi sesalcev: Nova spoznanja za prilagajanje starih poti. Trendi. Biotehnologija. 2010, 28, 476–484. [CrossRef]
15. Usuki, A.; Ohashi, A.; Sato, H.; Ochiai, Y.; Ichihashi, M.; Funasaka, Y. Zaviralni učinek glikolne kisline in mlečne kisline na sintezo melanina v celicah melanoma. Exp. Dermatol. 2003, 12, 43–50. [CrossRef]
16. Lin, S.; Li, L.; Li, M.; Gu, H.; Chen, X. Rafinoza poveča avtofagijo in zmanjša celično smrt v UVB-obsevanih keratinocitih. J. Photochem. Photobiol. B 2019, 201, 111653. [CrossRef]
17. Chen, X.; Li, M.; Li, L.; Xu, S.; Huang, D.; Ju, M.; Huang, J.; Chen, K.; Gu, H. Trehaloza, saharoza in rafinoza so novi aktivatorji avtofagije v človeških keratinocitih po mTOR-neodvisni poti. Sci. Rep. 2016, 6, 28423. [CrossRef]
18. Yamada, K.; Matsushita, K.; Wang, J.; Kanekura, T. Lokalna glukoza inducira ekspresijo klaudina-1 in filagrina v mišjem modelu atopičnega dermatitisa in v kulturi keratinocitov, ki ima protivnetni učinek s popravljanjem funkcije kožne pregrade. Acta. Derm. Venereol. 2018, 98, 19–25. [CrossRef]
19. Spravčikov, N.; Sizyakov, G.; Gartsbein, M.; Accili, D.; Tennenbaum, T.; Wertheimer, E. Učinki glukoze na kožne keratinocite: Posledice za kožne zaplete sladkorne bolezni. Diabetes 2001, 50, 1627–1635. [CrossRef]
20. Castrillo, A.; Tontonoz, P. Jedrski receptorji v biologiji makrofagov: na razpotju metabolizma lipidov in vnetja. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 2004, 20, 455–480. [CrossRef]
21. Lee, CS; Park, M.; Han, J.; Lee, JH; Bae, IH; Choi, H.; Sin, ED; Park, YH; Lim, KM Aktivacija jetrnega X receptorja zavira melanogenezo s pospeševanjem razgradnje MITF, ki jo posreduje ERK. J. Invest. Dermatol. 2013, 133, 1063–1071. [CrossRef] [PubMed]
22. Mitro, N.; Mak, PA; Vargas, L.; Godio, C.; Hampton, E.; Molteni, V.; Kreusch, A.; Saez, E. Jedrski receptor LXR je senzor glukoze. Narava 2007, 445, 219–223. [CrossRef] [PubMed]
23. Schurr, A. Ogljikovi hidrati; IntechOpen: London, Združeno kraljestvo, 2017; strani 21–35.
24. Scott, D.; Richardson, A.; Filipp, F.; Knutzen, C.; Chiang, G.; Ronai, Z.; Osterman, A.; Smith, J. Primerjalno profiliranje presnovnega toka celičnih linij melanoma: Onkraj Warburgovega učinka. J. Biol. Chem. 2011, 286, 42626–42634. [CrossRef] [PubMed]
25. Tang, SC; Yang, JH Dvojni učinki alfa-hidroksi kislin na kožo. Molecules 2018, 23, 863. [CrossRef]
For more information:1950477648nn@gmail.com
