Presnova glutationa prispeva k indukciji trenirane imunosti

Povzetek:

Prirojeni imunski sistem kaže heterologne značilnosti spomina, za katere so značilni močnejši odzivi na sekundarni izziv. Ta pojav, imenovan natrenirana imunost, temelji na epigenetskem in presnovnem preoblikovanju prirojenih imunskih celic. Ker je bila proizvodnja reaktivnih kisikovih vrst (ROS) povezana s fenotipom usposobljene imunosti, smo domnevali, da imajo povečane ravni ROS in glavna znotrajcelična redoks molekula glutation vlogo pri indukciji usposobljene imunosti. Tukaj prikazujemo, da farmakološka inhibicija ROS v in vitro modelu trenirane imunosti ni vplivala na odzivnost celic; modulacija ravni glutationa je zmanjšala proizvodnjo vnetnih citokinov v človeških monocitih. Ugotovljeno je bilo, da so polimorfizmi posameznega nukleotida (SNP) v genih, ki sodelujejo pri presnovi glutationa, povezani s spremembami v zmožnosti proizvodnje proinflamatornih citokinov pri trenirani imunosti.

Poleg tega so bile koncentracije glutationa v plazmi pozitivno povezane s proizvodnjo ex vivo IL-1, biomarkerja trenirane imunosti, ki ga proizvajajo monociti posameznikov, cepljenih z BCG. Skratka, metabolizem glutationa je vključen v indukcijo usposobljene imunosti, prihodnje študije pa so upravičene za raziskovanje njegovih funkcionalnih posledic pri človeških boleznih.

Človeška imunost je zelo pomembna, saj nas ščiti pred boleznimi in okužbami. Imunski sistem je kompleksen sistem, sestavljen iz številnih različnih celic, tkiv in organov. Skupaj se ukvarjajo z različnimi patogeni znotraj in zunaj. V raziskavi smo ugotovili, da lahko polisaharid Cistanche deserticola in verbaskozid izboljšata delovanje encimov srčnega in možganskega tkiva ter okrepita trebušno votlino. Fagocitna funkcija celic in proliferacijski odziv limfocitov očitno vplivata na izboljšanje imunosti.

Kliknite dodatek cistanche deserticola

Ključne besede:

glutation; usposobljena imuniteta; makrofagi; metabolizem; prirojeni imunski spomin.

1. Uvod

Do nedavnega je veljalo, da je adaptivna imunost edina komponenta obrambe gostitelja, za katero je značilna sposobnost ohranjanja spomina, prilagajanje odzivov celic T in B na specifičen antigen.

Vse več nedavnih raziskav pa značilnosti heterolognega spomina pripisuje tudi prirojenemu imunskemu sistemu, procesu, imenovanemu usposobljena imunost [1]. Monociti, ki so bili za kratek čas izpostavljeni Candidi albicans, komponenti glivične celične stene -glukanu ali celo sterilnim dražljajem, kot je oksidirani lipoprotein nizke gostote (ox-LDL), kažejo povečano proizvodnjo protivnetnih citokinov po nepovezani sekundarni stimulaciji dolgo po začetni dražljaj je bil odstranjen [2,3].

Poleg tega so epidemiološke študije pokazale, da cepljenje proti tuberkulozi z Bacillus Calmette-Guérin (BCG) poveča protimikrobno delovanje prirojenih imunskih celic, posledično povzroči nespecifično zaščito pred nepovezanimi okužbami in zmanjša umrljivost zaradi vseh vzrokov [4].

Izurjena imunost je zakoreninjena v epigenetskih spremembah, ki modulirajo dostopnost genov provnetnega odziva za transkripcijske stroje celice. Epigenetsko preoblikovanje v usposobljenih prirojenih imunskih celicah spremljajo presnovne spremembe, ki spodbujajo poti, kot so glikoliza, oksidativna fosforilacija in biosinteza holesterola [5,6]. Metaboliti, ki izhajajo iz teh poti, so signalne molekule in kofaktorji, ki lahko nato modulirajo aktivnost encimov, ki spreminjajo kromatin. Glutation (GSH) je glavni antioksidant, ki ohranja intracelularno redoks ravnovesje in naj bi prispeval k epigenetskim spremembam [7].

Poleg tega dražljaji, ki inducirajo trenirano imunost, kot sta BCG in oxLDL, povečajo proizvodnjo reaktivnih kisikovih vrst (ROS) makrofagov po sekundarni stimulaciji [8–10]. Domnevali smo, da bi povečana presnovna aktivnost treniranih makrofagov povečala tudi ravni ROS in modulirala GSH, kar bi posledično vplivalo na moč treniranih imunskih odzivov.

2. Materiali in metode

2.1. Izolacija človeških mononuklearnih celic periferne krvi (PBMC) in monocitov

Buffy plašči zdravih darovalcev so bili pridobljeni po pisni informirani privolitvi (Sanquin Blood Bank, Nijmegen, Nizozemska). Etično odobritev je pridobil CMO Arnhem-Nijmegen (NL32 357.091.10). Izolacijo smo izvedli s centrifugiranjem z diferencialno gostoto na Ficoll-Paque (GE Healthcare, Chalfont St Giles, UK). Nato smo izvedli izolacijo monocitov s hiperosmotskim centrifugiranjem z gradientom gostote Percoll (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, ZDA) in jih enkrat sprali s hladno fiziološko raztopino s fosfatnim pufrom brez pirogenov (PBS). Celice smo resuspendirali in kasneje gojili v nizozemskem modificiranem mediju RPMI 1640 (Invitrogen, Waltham, MA, ZDA), dopolnjenem s 5 µg/mL gentamicina (Centraform, Etten-Leur, Nizozemska), 2 mM Glutamax (Gibco, Waltham, MA, ZDA). ) in 1 mM piruvata (Gibco). Da bi zagotovili največjo čistost, smo monocite, izolirane s Percollom, pustili, da se prilepijo na polistirenske plošče z ravnim dnom (Corning, Sigma-Aldrish, New York, NY, ZDA) 1 uro pri 37 °C 5 odstotkov CO2 in nato enkrat speremo s toplim PBS.

2.2. In vitro trenirani imunski model

Adherentne monocite smo gojili, kot je opisano prej [11]. Na kratko, 105 monocitov je bilo posejanih na 96-plošče z vdolbinicami z ravnim dnom (Greiner, Kremsmünster, Avstrija) in inkubiranih z 1 µg/mL -glukana ali 5 µg/mL BCG cepiva (InterVax, Toronto, ON, Kanada) v RPMI z 10 odstotki združenega človeškega seruma. -1,3-(D)-glukan (-glucan) iz Candide albicans je prijazno zagotovil profesor David Williams (Medicinska fakulteta, Johnson City, TN, ZDA).

Ko je bilo indicirano, so bile celice predhodno inkubirane z {{0}}. 5 µM difenilenjodonijem (DPI), 50 µM a-tokoferola (AT) (Sigma-Aldrich), 0,5 µM askorbinske kisline (AA), 1 mM N-acetil cisteina (NAC) (Sigma-Aldrich) ali 100 µM DL-butionin sulfoksimina (BSO) (Sigma-Aldrich) 1 uro pred dodatkom -glukana. Po 24 urah celice enkrat speremo s toplim PBS in pustimo, da se diferencirajo v RPMI, dopolnjenem z 10 odstotki združenega človeškega seruma 5 dni. Gojišče je bilo osveženo na 3. dan kulture. Na 6. dan smo makrofage ponovno stimulirali z 10 ng/mL lipopolisaharida Escherichia coli (LPS; serotip 055: B5, Sigma-Aldrich) dodatnih 24 ur.

2.3. Kvantifikacija reaktivnih kisikovih vrst (ROS).

Monocite/makrofage smo gojili 2 h, 24 h ali 6 dni, jih sprali, ločili s hladnim PBS in inkubirali s 5 µM H2DCFDA (Life Technologies, Waltham, MA, ZDA) v PBS 30 min pri 37 ◦C. Celice smo analizirali s pretočno citometrijo (CytoFlex, Beckman Coulter, Brea, CA, ZDA). Analiza podatkov je bila izvedena s programsko opremo Kaluza 2.1. Celične agregate smo izločili na podlagi krivulje višine naprej razpršene (FSC) v primerjavi s površino FSC, populacijo monocitov/makrofagov pa izločili glede na FSC in stransko razpršeno (SSC). Podatki so predstavljeni kot povprečje ± SEM in analizirani s Friedmanovim testom, ki mu sledi Dunnov test večkratne primerjave. P-vrednost pod 0.05 je veljala za statistično pomembno, kot je označeno z zvezdicami (* p < 0,05).

2.4. Podatki o sekvenciranju RNA človeških monocitov, stimuliranih in vitro

Analiza genske ekspresije monocitov, izpostavljenih in vitro -glukanu, je bila izvedena z uporabo predhodno objavljenih podatkov RNA-seq [12]. Na kratko, PBMC so izolirali s centrifugiranjem v Ficoll-Paque (GE Healthcare). Monocite smo očistili z negativno selekcijo s kroglicami za pozitivne celice CD3 plus (celice T), CD19 plus (celice B) in CD56 plus (celice NK) (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Nemčija). Celice smo gojili po opisanem in vitro treniranem imunskem modelu in jih izpostavili 5 µg/mL -glukana. Monocite smo zbrali 4 ure in 24 ur po izpostavitvi. Geni, povezani z antioksidativnim odzivom in presnovo glutationa, so bili ekstrahirani s seznama značilno dinamičnih genov (p < 0.05, FC > 2,5, RPKM > 1) v in vitro modelu imunosti, ki je treniran od monocitov do makrofagov. Podatki so predstavljeni kot log10 razmerja med monociti, zdravljenimi z -glukanom, in nestimuliranimi monociti.

2.5. Kvantifikacija glutationa

Kvantitativno analizo intracelularnega reduciranega (GSH) in oksidiranega (GSSG) glutationa smo izvedli z uporabo spektroskopije jedrske magnetne resonance (NMR), kot je opisano prej [13].

Na kratko, rastni medij smo odstranili in kultivirane celice sprali s toplim PBS (37 °C) in pogasili s tekočim dušikom, da bi zaustavili presnovo. Celice smo nato postrgali s plošč in jih ekstrahirali s hladno (–80 ◦C) raztopino metanola/kloroforma/vode, 8,1:0.9:1 (vol/vol/vol) . Ekstrakti so bili zamrznjeni na suhem ledu vsaj 30 min in nato centrifugirani 20 min pri 18,{{1{{30}}}}× g pri –4 ◦C. Beljakovinsko peleto smo hranili za kvantifikacijo beljakovin, medtem ko smo supernatante, ki so vsebovali znotrajcelične presnovke, sušili pod blagim tokom dušika, vzorce NMR pa smo pripravili z raztapljanjem posušenega materiala z 0,22 ml 0,15 M fosfatnega pufra (pH 7,4) v devterirani vodi, ki je vsebovala 0,05 mM trimetilsilil propion-d{21}}natrijeva sol kot interni standard za referenco in kvantifikacijo NMR. 1D 1H NMR spekter je bil zbran za vsak vzorec na 14,1 T (600 MHz za 1H) Bruker Avance II NMR z uporabo impulznega zaporedja noesygppr1d (Topspin v3.0, Bruker Biospin Ltd, Karlsruhe, Nemčija). Vsi spektri so bili obdelani in uvoženi v Chenomx NMR suite 8.4 (Chenomx NMR suite, v8.0, Edmonton, AB, Kanada) za kvantifikacijo glutationa.

Vse koncentracije so bile normalizirane na skupno maso beljakovin vsakega vzorca. Slednje je bilo kvantificirano z raztapljanjem beljakovinske pelete v pufru (1:1, 1 odstotek SDS: 8M Urea (0.25M Tris pH:8)) z ultrazvočno obdelavo. Koncentracijo beljakovin smo nato izmerili s kompletom za testiranje beljakovin PierceTM BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA) v skladu z njegovim priročnikom.

2.6. In vitro in in vivo usposobljeni modeli imunosti za genetsko in presnovno analizo

V modelu in vitro so adherentne monocite inkubirali bodisi z gojiščem samo kot negativno kontrolo, 2 µg/mL -1,3-(D)-glukana ali 5 µg/mL BCG (kohorta 300BCG : sev BCG-Bulgaria, Intervax, Kanada), 24 ur pri 37 ◦C v prisotnosti 10 odstotkov združenega človeškega seruma. 6. dan so bile celice ponovno stimulirane 24 ur z 200 µL RPMI ali LPS 10 ng/mL (serotip 055: B5; Sigma-Aldrich).

V modelu in vivo so bili zdravi odrasli cepljeni s standardnim odmerkom 0.1 ml BCG intradermalno v levo nadlaket, kri pa je bila zbrana pred in 14 ter 90 dni po cepljenju. Pri vsakem obisku je bilo 5 × 105 PBMC stimuliranih s toplotno uničenim Staphylococcus aureusom (106 CFU/mL) ali puščenih nestimuliranih pri 37 ◦C s 5 odstotki CO2. Izločene citokine so izmerili v obeh modelih po 24 urah stimulacije, kratno povečanje odzivnosti citokinov, ki ga povzročijo dražljaji za usposabljanje, pa je bilo uporabljeno kot merilo za usposobljeno imunost [14].

2.7. Genetska analiza

Genetska analiza je bila izvedena z uporabo kohorte zdravih posameznikov zahodnoevropskega porekla iz projekta Human Functional Genomics Project [15]. Kohorto 300BCG sestavlja 325 odraslih z Nizozemske (44 odstotkov moških in 56 odstotkov žensk, starostni razpon 18–71 let). Študijo je odobril lokalni etični odbor CMO regije Arnhem-Nijmegen, NL58553.091.16. Vzorci DNK posameznikov (n=325) so bili genotipizirani z uporabo komercialno dostopnega čipa SNP, Infinium Global Screening Array MD v1.0 podjetja Illumina. Za priklic genotipa je bil uporabljen optični 0.7.0 s privzetimi nastavitvami [16]. Vzorci s stopnjo klica Manjšim ali enakim 0.99 so bili izključeni, kot tudi različice s Hardy-Weinbergovim ravnovesjem (HWE) Manjšim ali enakim 0,0001, in manjšo frekvenco alelov (MAF) Manjšim ali enakim na 0,001. Prameni variant so bili poravnani in identificirani glede na referenčno ploščo 1000 genomov z uporabo Genotype Harmonizer [17]. Vzorce smo nato imputirali na michiganskem imputacijskem strežniku z uporabo človeškega referenčnega konzorcija (HRC r1.1 2016) kot referenčne plošče in izločili genetske različice z R2 < 0,3 za imputacijsko kakovost in MAF < 5 odstotkov [18], kar je povzročilo približno 4 milijone enonukleotidnih polimorfizmov (SNP) za nadaljnje kartiranje QTL. Podatki o genotipih in citokinih o in vitro treniranih imunskih odzivih so bili pridobljeni za skupno 267 posameznikov iz kohorte 300 BCG. Trije vzorci so bili izključeni zaradi uporabe zdravil (od tega je bil eden identificiran kot genetski odstopanje), en vzorec pa zaradi pojava sladkorne bolezni tipa 1 med študijo.

Najprej je bila kratna sprememba proizvodnje citokinov med treniranimi in netreniranimi celicami vzeta kot merilo za obseg treniranega imunskega odziva. Po preverjanju kakovosti za porazdelitev citokinov in po izključitvi genetskih odstopanj smo preslikali logaritmično transformirane kratne spremembe proizvodnje citokinov v podatke o genotipih z uporabo linearnega regresijskega modela s starostjo in spolom kot sospremenljivkama, da bi popravili porazdelitve kratne spremembe proizvodnje citokinov. Uporabili smo mejno vrednost p <9,99 × 10-3 za identifikacijo sugestivnih asociacij lokusa kvantitativnih lastnosti (QTL), ki vplivajo na odzive usposobljene imunosti. Z uporabo in vivo treniranega modela imunosti so bili pridobljeni podatki o genotipih in citokinih za skupno 296 posameznikov.

Poleg izstopajočih vrednosti, opisanih za kartiranje QTL in vitro, je bilo izključenih 18 posameznikov, cepljenih zvečer, kar je povzročilo 278 vzorcev pred kartiranjem QTL. Najprej so bile ravni neobdelanih citokinov logaritmično transformirane in razmerja proizvodnje citokinov med obiski so bila vzeta kot kratna sprememba proizvodnje citokinov. Kratna sprememba proizvodnje citokinov je bila preslikana v podatke genotipa z uporabo linearnega regresijskega modela s starostjo in spolom kot sospremenljivkama. Uporabili smo mejno vrednost p <9,99 × 10-3 za identifikacijo sugestivnih povezav QTL, ki vplivajo na usposobljene imunske odzive. R-paket Matrix-eQTL je bil uporabljen za kartiranje QTL citokinov [19].

2.8. Metabolomska analiza

Ravni presnovkov pri posameznikih iz kohorte 300 BCG so bile izmerjene pred cepljenjem z BCG. Presnovne lastnosti je izmeril in označil General Metabolics (Zürich, Švica) z uporabo spektrometrije s pretočno injekcijo in časom letenja (tokovno vbrizgavanje TOF-M) [20]. Neciljni presnovki so bili označeni v skladu z bazo podatkov o človeških presnovkih (HMDB). Vse metabolomske meritve so bile izvedene v dvojnikih, povprečna vrednost pa je bila izračunana za vsak vzorec na metabolit. Spearmanova korelacijska analiza je bila izvedena na presnovkih in ex vivo spremembah citokinske gube glede odzivov pred cepljenjem. Za testiranje razmerja med ravnmi glutationa in zanimivimi SNP-ji, identificiranimi v genetski analizi, je bila za vsak SNP izvedena linearna regresijska analiza s starostjo in spolom, ki sta bila vključena kot sospremenljivki.

2.9. Kvantifikacija in analiza citokinov

Proizvodnja citokinov je bila določena s komercialnimi kompleti ELISA za IL{{0}}, IL-6 in TNF (R&D Systems, Minneapolis, MN, ZDA) po navodilih proizvajalca. Podatki so predstavljeni kot povprečje ± SEM in analizirani z dvosmerno ponovljeno meritvijo ANOVA, ki ji sledi Sidakov test večkratne primerjave. P-vrednost pod 0.05 je veljala za statistično pomembno, kot je označeno z zvezdicami (* p < 0,05).

3. Rezultati

3.1. - Izurjena imunost, ki jo povzroči glukan in BCG, sproži trajno proizvodnjo reaktivnih kisikovih vrst

Povečano sproščanje ROS je bilo prej opisano kot značilnost fenotipa trenirane imunosti [21]. Monociti, izpostavljeni -glukanu ali BCG 2 h in 24 h, kažejo povečan ROS. Zanimivo je, da je bilo to povečanje trajno in prisotno po 5 dneh mirovanja v gojišču (slika 1A). Povečane ravni ROS spremljajo transkripcijske spremembe različnih antioksidativnih genov v monocitih, ki so bili 24 ur izpostavljeni -glukanu (slika 1B). Mitohondrijska superoksid dismutaza SOD2 in različne molekule, ki vsebujejo tiol, so regulirane navzgor, in sicer od tioredoksina odvisne peroksidne reduktaze 1-6 (PRDX 1-6) in sulfiredoksin 1 (SRXN1). Povečana je tudi ekspresija tioredoksina (TXN) in tioredoksin reduktaze (TXNRD), pomembnih čistilcev ROS, ki vsebujejo tiole.

Slika 1. Povečane ravni ROS treniranih monocitov ne prispevajo k njihovi povečani produkciji vnetnih citokinov. (A) Ravni ROS po 2 urah, 24 urah in 6 dneh po izpostavitvi monocitov -glukanu in BCG (n=6/9 darovalcev, združenih iz 2/3 neodvisnih poskusov. Fridmanov test Dunnov test večkratnih primerjav) . (B) Stopnje ekspresije genov, vključenih v antioksidativno obrambo v monocitih, izpostavljenih -glukanu 24 ur v primerjavi z nestimuliranimi celicami. Izraz je predstavljen kot log10(razmerje). TNF in IL-6, ki jih proizvajajo makrofagi, usposobljeni za -glukan, po 1-urnem predhodnem zdravljenju z (C) 0.5 µM DPI (n=6 darovalcev, združenih iz 2 neodvisnih poskusov) in (D ) 1 mM NAC, 50 µM AT ali 0,5 µM AA (n=6 darovalcev, združenih iz dveh neodvisnih poskusov, dvosmerna ANOVA, Sidakov test večkratnih primerjav). (povprečje ± SEM, * p < 0,05).

Vendar pa niti inhibicija glavnega proizvajalca ROS NADPH oksidaze z difenilenjodonijem (DPI) niti dodatek antioksidantnih molekul -tokoferola (AT) in askorbinske kisline (AA) pred inkubacijo z -glukanom ni modulirala povečane odzivnosti makrofagov. V makrofagih, izpostavljenih -glukanu, se izločanje TNF in IL-6 24 ur po restimulaciji LPS s tem farmakološkim pristopom ni spremenilo (slika 1C, D).

Vendar je izpostavljenost samo DPI povečala proizvodnjo IL-6 po stimulaciji LPS. (Slika 1C). Predhodna obdelava s splošnim čistilcem ROS N-acetil cisteinom (NAC) je povzročila zmanjšanje proizvodnje TNF in IL-6 v primerjavi s celicami, ki so bile izpostavljene samo glukanu (slika 1D). Skupaj smo pokazali, da ima povečana proizvodnja ROS manjšo vlogo pri povečani proizvodnji citokinov trenirane imunosti, ki jo povzroča -glukan. Poleg tega bi lahko bila usposobljena imunost, ki vzdržuje povečane ravni ROS, povezana z modulacijo celičnega antioksidanta glutationa, saj NAC ni le čistilec ROS, ampak lahko deluje tudi kot predhodnik za sintezo glutationa.

3.2. Presnova glutationa vpliva na izurjene imunske odzive

Monociti, izpostavljeni -glukanu 24 ur, kažejo višje ravni oksidirane oblike glutationa (GSSG), kar je posledica višjih ravni ROS, ugotovljenih v tem času (slika 2A). Po obdobju počitka se reducirana oblika glutationa (GSH) poveča v treniranih makrofagih, brez sprememb koncentracije oksidirane oblike.

Slika 2. Ravni glutationa se spreminjajo ob izpostavljenosti -glukanu. (A) Zmanjšane in oksidirane znotrajcelične ravni glutationa v monocitih po 24-urni izpostavljenosti z 1 µg/mL -glukana in 5 dneh po obdobju mirovanja (n=4 darovalcev, združenih iz dveh neodvisnih poskusov). (B) Izražanje genov, vključenih v presnovo glutationa v monocitih, izpostavljenih -glukanu 4 ure in 24 ur. Izraz je predstavljen kot log10(razmerje). (C) TNF in IL-6, ki ju proizvajajo makrofagi, trenirani z -glukanom, po 1-urni predhodni obdelavi s 100 µM BSO (n=9 darovalci, združeni iz treh neodvisnih poskusov, * p < 0,05 dvosmerna ANOVA , Sidakovi testi večkratne primerjave) (srednja vrednost ± SEM).

Geni, ki kodirajo podenote encima glutamat cistein ligaze (GCLC in GCLM), ki omejuje hitrost, kažejo povečano izražanje 4 ure po stimulaciji -glukana v primerjavi s kontrolnimi monociti. Glutation reduktaza (GSR), glutation peroksidaza 7 (GPX7) in encimi iz družine glutaredoksinov (GLRX, 2, 5) so prav tako regulirani na 24-urni časovni točki (slika 2B), kar kaže ne le na povečanje sinteze, ampak tudi na višjo hitrost recikliranja glutationa. Farmakološko zaviranje aktivnosti GCL z butionin sulfoksiminom (BSO) pred izpostavljenostjo -glukanu povzroči zmanjšanje proizvodnje IL-6 po ponovni stimulaciji LPS (slika 2C). Tako je eksogena modulacija ravni glutationa, bodisi dopolnitev z dodatkom prekurzorja NAC ali njegovo zmanjšanje z blokiranjem encima GCL z BSO, zmanjšala povečano odzivnost -glukana na sekundarno stimulacijo.

Da bi dodatno raziskali, ali genetske variacije v genih, ki sodelujejo pri presnovi glutationa, vplivajo na usposobljeno imunost, je bilo kartiranje QTL izvedeno z uporabo skupine 325 zdravih posameznikov. Preizkusili smo, ali so pogosti SNP-ji z ​​manjšo frekvenco alelov (MAF) > 0.05 v genih, pomembnih za presnovo glutationa, povezani s spremembami v zmožnosti proizvodnje proinflamatornih citokinov monocitov po -glukanu in BCG in vitro treningu (slika 3A, C).

Podobno smo ocenili tudi vpliv teh genetskih variant na in vivo usposobljeno imunost, ki jo je povzročilo cepljenje proti BCG 278 zdravih posameznikov (slika 3B, C). Več SNP-jev znotraj okna 250 kb genov, vključenih v presnovo glutationa, je bilo domnevno povezanih (p-vrednost < 9,99 × 10-3) z uravnavanjem izločanja IL-1, TNF in IL-6 po treningu (Slika 3A, B).

V isti kohorti smo pred cepljenjem z BCG izmerili presnovke v plazmi, ki sodelujejo pri presnovi glutationa. SNP-ji, identificirani v analizah in vitro in in vivo, so bili pomembno povezani s koncentracijami glutationa v obtoku (vrednost p < 0.05) (slika 3D). Poleg tega smo ugotovili pozitivno povezavo med koncentracijo glutationa v plazmi in proizvodnjo ex vivo IL-1 90 dni po cepljenju z BCG po izpostavljenosti in vitro heterolognemu dražljaju Staphylococcus aureus (slika 3E). Povečana regulacija proizvodnje IL-1 s cepljenjem z BCG je tudi pozitivno povezana s krožečo koncentracijo drugih presnovkov, ki sodelujejo pri presnovi glutationa, kot so metionin, cistein, glutamat in glicin (slika 3E). Na splošno geni, vključeni v presnovo glutationa, ki vsebujejo QTL za prirojene heterologne odzive, na LPS (slika 3A) ali na S. aureus (slika 3B), in korelacija med serumskimi nivoji glutationa in proizvodnjo ex vivo IL-1, oba kažeta na vlogo te poti pri vzpostavljanju usposobljene imunosti.

Slika 3. Glutation je povezan z lastnostmi usposobljene imunosti. Toplotni zemljevid p-vrednosti asociacije (p < 9,99 × 10−3) med SNP-ji, preslikanimi na gene, ki sodelujejo pri presnovi glutationa, in obsegom proizvodne zmogljivosti citokinov z monociti, treniranimi in vitro z (A)-glukanom in BCG (n=251 zdravih prostovoljcev za IL-6 in n=238 zdravih prostovoljcev za TNF) in (B) in vivo odzivi na usposabljanje BCG (n {{10}} zdravi prostovoljci). (C) Škatla najnižje p-vrednosti SNP na analizo (rs7768134, rs35568915). (D) Škatlice, ki prikazujejo ravni glutationa v plazmi (popravljene glede na starost in spol), stratificirane glede na genotip za rs2233294 (GPX3) in rs10136944 (GLRX5, n=302). P-vrednost za vsako SNP je izpeljana iz linearnega regresijskega modela z SNP, ki nas zanima, kot neodvisno spremenljivko in glutationom (popravljenim glede na starost in spol) kot odvisno spremenljivko. (E) Spearmanove korelacije med presnovki v obtoku na izhodišču, ki so vključeni v presnovo glutationa, v primerjavi s kratnimi spremembami odzivov IL-6, IL-1 in TNF, ki izvirajo iz PBMC, induciranega s S. aureus, in TNF, izmerjenih 14 ali 90 dni po Cepljenje BCG v primerjavi z izhodiščem (n=297 zdravih prostovoljcev). Tabela predstavlja Spearmanovo rho za vsako korelacijo, korelacije v rdeči barvi pa označujejo pomembne pozitivne korelacije (* p < 0,05, ** p < 0,01). Korelacija med koncentracijo glutationa in kratno spremembo proizvodnje IL-1 pri 90 dneh v primerjavi z dnevom 0 je podana kot primer na diagramu razprševanja.

4. Razprava

Makrofagi so plastične celice, ki svoj fenotip prilagajajo različnim okoljskim dražljajem. Izurjeni makrofagi se zanašajo na visoko energijsko presnovo s povečano glikolizo, ciklom TCA in oksidativno fosforilacijo, da vzpostavijo odziv z okrepljeno proizvodnjo protivnetnih citokinov [6, 22].

Poleg proizvodnje citokinov se v ponovno stimuliranih makrofagih, treniranih z BCG, poveča oksidativni izbruh s hitro proizvodnjo ROS [8]. Vranični nevtrofilci, izolirani iz miši, zdravljenih z BCG, prav tako kažejo povečano proizvodnjo ROS [23]. V skladu s povečano hitrostjo presnove in povečano zmožnostjo sprožitve oksidativnega izbruha smo opazili, da monociti in makrofagi, izpostavljeni -glukanu ali BCG, kažejo povečanje bazalne proizvodnje ROS. O podobnem povečanju sproščanja ROS so že poročali pri monocitih, treniranih z oxLDL [9]. ROS ima efektorske funkcije pri očistku patogenov, lahko pa posreduje tudi pri prenosu signala [24]. Farmakološka inhibicija encima NOX, ki proizvaja ROS, ali zdravljenje z antioksidantnimi molekulami - tokoferolom in askorbinsko kislino ni ablatiralo -glukana, ki je povečal proizvodnjo citokinov. Vendar pa je čistilec ROS NAC zaviral proizvodnjo TNF, povečanega z -glukanom, kar kaže na možno vlogo ROS pri trenirani imunosti.

Zanimivo je, da NAC ni samo antioksidantna molekula, ampak deluje tudi kot prekurzor glutationa, glavne endogene antioksidativne molekule. Obstajata dva glavna celična redoks sistema, piridinski nukleotidi, kot je NAD plus /NADH, in tiolni sistemi, ki vključujejo glutation in tioredoksine. Razmerje NAD plus /NADH se poveča v monocitih, izpostavljenih glukanu, na trajen način po obdobju diferenciacije v treniranih makrofagih [22], podobno kot poročamo za ravni ROS. Tukaj prikazujemo, da so koncentracije GSH modulirane tudi pri trenirani imunosti.

Najbolj presenetljivo je, da je koncentracija GSH-reducirane oblike povečana samo v diferencirano usposobljenih makrofagih, medtem ko so ravni oksidiranega GSSG stabilne. To nakazuje, da imajo usposobljeni makrofagi povečane zaloge GSH, ki v nasprotju z NAD plus /NADH ne sodelujejo pri trajni proizvodnji ROS. Prispevek metabolizma glutationa k usposobljeni imunosti je dodatno okrepljen z genetsko in presnovno analizo kohorte zdravih posameznikov (300BCG). Ugotovljeno je bilo, da običajni genetski polimorfizmi znotraj genov, povezanih z GSH, vplivajo na obseg proizvodnje citokinov na in vitro in in vivo trenirano imunost (p <9,99 × 10-3). Poleg tega je bilo ugotovljeno, da sta dva od teh QTL lokusov, GPX3 pri chr5 in GLRX5 pri chr14, povezana s plazemskimi koncentracijami GSH (p <0,05).

GSH je antioksidantna molekula, znano pa je tudi, da uravnava izražanje genov prek različnih epigenetskih mehanizmov. GSH sodeluje pri posttranslacijskih modifikacijah, kot je opaženo pri S-glutationilaciji nukleosomskega proteina histona H3, in ga poganja metioninska pot, ki na koncu vodi do proizvodnje s-adenozil metionina (SAM). SAM pa je glavni darovalec metila, ki se uporablja za metilacijo DNK in histona [7]. Fumarat presnovka cikla TCA se kopiči v treniranih makrofagih, njegov derivat monometil fumarat pa inducira fenotip trenirane imunosti [5]. V astrocitih akutna izpostavljenost derivatu dimetilfumaratu izčrpa znotrajcelični GSH, vendar poveča skupni GSH v kasnejših časovnih točkah [25]. Izurjena imunost je zasidrana z epigenetskimi spremembami, ki zagotavljajo dolgoročni spomin [26]. Tu opažena povečana vsebnost GSH v treniranih makrofagih bi lahko olajšala epigenetsko ponovno ožičenje, potrebno za vzpostavitev prirojenega imunskega spomina.

Tukaj prikazujemo, da farmakološka modulacija glutationa in redoks status celice zmanjšata heterologni odziv makrofagov, kot je razvidno iz učinka BSO ali NAC na proizvodnjo citokinov, povečano z -glukanom. Poleg tega je v kohorti zdravih posameznikov metabolizem GSH povezan z lastnostmi usposobljene imunosti. Usposobljene imunske mehanizme, ki jih oblikuje metabolizem GSH, je treba še naprej raziskati, vendar je zaradi potencialne vpletenosti presnovnih in epigenetskih pokrajin to presnovno središče vznemirljiva pot za raziskovanje v prihodnjih študijah. Ti vpogledi prispevajo k razkritju presnovnega in epigenetskega ožičenja usposobljene imunosti, kar omogoča boljše razumevanje vpliva prirojenega imunskega sistema na zdravje in bolezen. Navsezadnje bo boljše razumevanje pomagalo prepoznati nove tarče terapije pri boleznih, za katere je značilna disregulacija prirojenih imunskih procesov.

Avtorski prispevki:

Konceptualizacija: AVF in JD-A.; metodologija: AVF, VACMK, VM in JCA-B., MAG; formalna analiza: AVF, VACMK, VM in JCA-B.; preiskava AVF, JCA-B., SK, LCJdB, SJCFMM, VPM in BN; urejanje podatkov: AVF, VACMK, VM in BN; pisanje—priprava izvirnega osnutka, AVF; pisanje—recenzija in redakcija: vsi soavtorji; nadzor: MAG, MGN in JD-A.; pridobitev sredstev: MAG in MGN Vsi avtorji so prebrali in se z objavljeno različico rokopisa strinjajo.

Financiranje:

JD-A. podpira Nizozemska organizacija za znanstvene raziskave (štipendija VENI 09150161910024). MGN. podpira ERC Advanced Grant (833247) in Spinoza Grant Nizozemske organizacije za znanstvene raziskave. AVF podpira Fundação para a Ciência ea Tecnologia (FCT, doktorska štipendija PD/BD/135449/2017). JCAB je podprt z donacijo upravnega oddelka za znanost, tehnologijo in inovacije, COLCIENCIAS, v Kolumbiji (razpis 756/2016). BN podpira štipendija raziskovalca NHMRC (Avstralija) (APP1173314).

Izjava institucionalnega revizijskega odbora:

Študijo 300BCG je odobril lokalni etični odbor CMO regije Arnhem-Nijmegen, NL58553.091.16.

Izjava o informirani privolitvi:

Informirano soglasje je bilo pridobljeno od vseh subjektov, vključenih v študijo, v skladu z odobritvijo etičnega odbora Arnhem-Nijmegen (št. 2010-104).

Izjava o razpoložljivosti podatkov:

Podatki o zaporedju RNA, predstavljeni v tej študiji, so na voljo v NCBI Gene Expression Omnibus pod pristopno številko GSE85243.

Zahvala:

Avtorji bi se radi zahvalili vsem prostovoljcem za sodelovanje v študiji 300BCG.

Nasprotja interesov:

MGN je znanstveni ustanovitelj TTxD. Preostali avtorji izjavljajo, da ni navzkrižja interesov. Financerji niso imeli nobene vloge pri načrtovanju študije; pri zbiranju, analizah ali interpretaciji podatkov; pri pisanju rokopisa ali pri odločitvi o objavi rezultatov.

Reference

1. Netea, MG; Domínguez-Andrés, J.; Barreiro, LB; Chavakis, T.; Divangahi, M.; Fuchs, E.; Joosten, LAB; van der Meer, JWM; Mhlanga, MM; Mulder, WJM; et al. Opredelitev trenirane imunosti in njene vloge pri zdravju in bolezni. Nat. Rev. Immunol. 2020, 20, 375–388. [CrossRef]

2. Quintin, J.; Saeed, S.; Martens, PNZ; Giamarellos-Bourboulis, EJ; Ifrim, DC; Logie, C.; Jacobs, L.; Jansen, T.; Kullberg, BJ; Wijmenga, C.; et al. Okužba s Candido albicans nudi zaščito pred ponovno okužbo s funkcionalnim reprogramiranjem monocitov. Cell Host Microbe 2012, 12, 223–232. [CrossRef]

3. Bekkering, S.; Quintin, J.; Joosten, LA; Van Der Meer, JW; Netea, MG; Riksen, NP Oksidirani lipoprotein nizke gostote inducira dolgotrajno provnetno produkcijo citokinov in tvorbo penastih celic z epigenetskim reprogramiranjem monocitov. Arter. Thromb. Vasc. Biol. 2014, 34, 1731–1738. [CrossRef] [PubMed]

4. Benn, CS; Netea, MG; Selin, LK; Aaby, P. Majhen vbod - velik učinek: nespecifična imunomodulacija s cepivi. Trendi Immunol. 2013, 34, 431–439. [CrossRef]

5. Umetnost, RJW; Novakovič, B.; ter Horst, R.; Carvalho, A.; Bekkering, S.; Lachmandas, E.; Rodrigues, F.; Silvestre, R.; Cheng, SC; Wang, SY; et al. Glutaminoliza in kopičenje fumarata vključujeta imunometabolične in epigenetske programe v trenirano imunost. Cell Metab. 2016, 24, 807–819. [CrossRef] [PubMed]

6. Keating, S.; Groh, L.; van der Heijden, C.; Rodriguez, H.; Dos Santos, J.; Fanucchi, S.; Okabe, J.; Kn, H.; van Puffelen, J.; Helder, L.; et al. Set7 lizin metiltransferaza uravnava plastičnost pri oksidativni fosforilaciji, ki je potrebna za trenirano imunost, ki jo povzroča beta-glukan. Cell Rep. 2020, 31, 107548. [CrossRef] [PubMed]

7. García-Giménez, JL; Romá-Mateo, C.; Pérez-Machado, G.; Peiró-Chova, L.; Pallardó, FV Vloga glutationa pri regulaciji epigenetskih mehanizmov pri boleznih. Free Radic. Biol. Med. 2017, 112, 36–48. [CrossRef] [PubMed]

8. Bekkering, S.; Blok, dipl. Joosten, LAB; Riksen, NP; Van Crevel, R.; Netea, MG In vitro eksperimentalni model usposobljene prirojene imunosti pri ljudeh. Clin. Cepivo Immunol. 2016, 23, 926–933. [CrossRef]

9. Sohrabi, Y.; Lagache, SMM; Schnack, L.; Godfrey, R.; Kahles, F.; Bruemmer, D.; Waltenberger, J.; Findeisen, HM mTOR odvisen oksidativni stres uravnava z oxLDL inducirano usposobljeno prirojeno imunost v človeških monocitih. Spredaj. Immunol. 2019, 9, 3155. [CrossRef] [PubMed]

10. Van Der Heijden, CDCC; Keating, ST; Groh, L.; Joosten, LAB; Netea, MG; Riksen, NP Aldosteron inducira usposobljeno imunost: vloga sinteze maščobnih kislin. Cardiovasc. Res. 2020, 116, 317–328. [CrossRef]

11. Domínguez-Andrés, J.; Umetnost, RJW; Bekkering, S.; Bahrar, H.; Blok, dipl. de Bree, LCJ; Bruno, M.; Bulut, Ö.; Debisarun, PA; Dijkstra, H.; et al. In vitro indukcija usposobljene imunosti v adherentnih človeških monocitih. STAR Protoc. 2021, 2, 100365. [CrossRef] [PubMed]

12. Novakovič, B.; Habibi, E.; Wang, S.-Y.; Umetnost, RJW; Davar, R.; Megchelenbrink, W.; Kim, B.; Kuznecova, T.; Kox, M.; Zwaag, J.; et al. -Glukan obrne epigenetsko stanje imunološke tolerance, ki jo povzroči LPS. Cell 2016, 167, 1354–1368.e14. [CrossRef]

13. Kostidis, S.; Addie, RD; Morreau, H.; Mayboroda, OA; Giera, M. Kvantitativna NMR analiza intra- in zunajceličnega metabolizma celic sesalcev: Vadnica. Analno Chim. Acta 2017, 980, 1–24. [CrossRef]

14. Koeken, VACM; de Bree, LCJ; Mourits, podpredsednik; Moorlag, SJCFM; Walk, J.; Ćirovič, B.; Umetnost, RJW; Jaeger, M.; Dijkstra, H.; Lemmers, H.; et al. Cepljenje proti BCG pri ljudeh zavira sistemsko vnetje na način, ki je odvisen od spola. J. Clin. Raziskati. 2020, 130, 5591–5602. [CrossRef]

15. Projekt človeške funkcionalne genomike. Dostopno na spletu: http://www.humanfunctionalgenomics.org/site/ (dostopano 19. aprila 2021).

16. Shah, TS; Liu, JZ; Floyd, JAB; Morris, JA; Wirth, N.; Barrett, JC; Anderson, CA OptiCall: robusten algoritem za klicanje genotipov za redke, nizkofrekvenčne in običajne različice. Bioinformatika 2012, 28, 1598–1603. [CrossRef]

17. Deelen, P.; Bonder, MJ; Van Der Velde, KJ; Westra, HJ; Winder, E.; Hendriksen, D.; Franke, L.; Swertz, MA Usklajevalnik genotipov: Samodejna poravnava pramenov in pretvorba formata za integracijo podatkov o genotipih. BMC Res. Notes 2014, 7. [CrossRef]

18. McCarthy, S.; Das, S.; Kretzschmar, W.; Delaneau, O.; Wood, AR; Teumer, A.; Kang, HM; Fuchsberger, C.; Daneček, P.; Sharp, K.; et al. Referenčna plošča 64.976 haplotipov za imputacijo genotipa. Nat. Genet. 2016, 48, 1279–1283. [CrossRef]

19. Shabalin, AA Matrix eQTL: Ultra hitra analiza eQTL prek velikih matričnih operacij. Bioinformatika 2012, 28, 1353–1358. [CrossRef]

20. Fuhrer, T.; Heer, D.; Begemann, B.; Zamboni, N. Visoko zmogljivo, natančno profiliranje masnega metaboloma celičnih ekstraktov s pretočno injekcijsko masno spektrometrijo časa leta. Analno Chem. 2011, 83, 7074–7080. [CrossRef]

21. Kalafati, L.; Kourtzelis, I.; Schulte-schrepping, J.; Verginis, P.; Mitroulis, I. Prirojeni imunski trening granulopoeze spodbuja protitumorsko aktivnost. Celica 2020, 183, 771–785.e12. [CrossRef]

22. Cheng, SC; Quintin, J.; Cramer, RA; Shepardson, KM; Saeed, S.; Kumar, V.; Giamarellos-Bourboulis, EJ; Martens, PNZ; Rao, NA; Aghajanirefah, A.; et al. MTOR- in HIF-1 -posredovana aerobna glikoliza kot presnovna osnova za trenirano imunost. Science 2014, 345, 1250684. [CrossRef]

23. Moorlag, SJCFM; Rodriguez-Rosales, YA; Gillard, J.; Fanucchi, S.; Theunissen, K.; Novakovič, B.; de Bont, CM; Negishi, Y.; Fok, ET; Kalafati, L.; et al. BCG cepljenje povzroči dolgoročno funkcionalno reprogramiranje človeških nevtrofilcev. Cell Rep. 2020, 33. [CrossRef]

24. Forrester, SJ; Kikuchi, DS; Hernandes, MS; Xu, Q.; Griendling, KK Reaktivne kisikove vrste pri presnovni in vnetni signalizaciji. Circ. Res. 2018, 122, 877–902. [CrossRef]

25. Brennan, MS; Matoš, MF; Li, B.; Hronowski, X.; Gao, B.; Juhasz, P.; Rhodes, KJ; Scannevin, RH dimetil fumarat in monoetil fumarat kažejo različne učinke na KEAP1, aktivacijo NRF2 in izločanje glutationa in vitro. PLoS ONE 2015, 10, e0120254. [CrossRef]

26. Kaufmann, E.; Sanz, J.; Dunn, JL; Khan, N.; Mendonça, LE; Pacis, A.; Tzelepis, F.; Pernet, E.; Dumaine, A.; Grenier, J.-C.; et al. BCG vzgaja hematopoetske izvorne celice za ustvarjanje zaščitne prirojene imunosti proti tuberkulozi. Celica 2018, 172, 176–190.e19. [CrossRef]

Anaisa V. Ferreira 1,2,* , Valerie ACM Koeken 1,3,4 , Vasiliki Matzaraki 1 , Sarantos Kostidis 5 , Juan Carlos Alarcon-Barrera 5 , L. Charlotte J. de Bree 1 , Simone JCFM Moorlag 1 , Vera P Mourits 1, Boris Novaković 6,7, Martin A. Giera 5, Mihai G. Netea 1,8 in Jorge Domínguez-Andrés.

1 Oddelek za interno medicino in Radboud Center za nalezljive bolezni (RCI), Radboud University Nijmegen Medical Center, 6500 HB Nijmegen, Nizozemska;

Valerie.Koeken@radboudumc.nl (VACMK); Vasiliki.Matzaraki@radboudumc.nl (VM);

Charlotte.deBree@radboudumc.nl (LCJdB); Simone.Moorlag@radboudumc.nl (SJCFMM);

Vera.Mourits@radboudumc.nl (VPM); Mihai.Netea@radboudumc.nl (MGN).

2 Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar (ICBAS), Universidade do Porto, 4050-313 Porto, Portugalska.

3 TWINCORE, skupno podjetje Helmholtz-Centre for Infection Research (HZI) in Hannover Medical School (MHH), 30625 Hannover, Nemčija.

4 Center za individualizirano infekcijsko medicino (CiiM), Oddelek za računalniško biologijo za individualizirano infekcijsko medicino, skupno podjetje med Helmholtz-Centrom za raziskave okužb (HZI) in Hannover Medical School (MHH), 30625 Hannover, Nemčija.

5 Center za proteomiko in metabolomiko, Leiden University Medical Center (LUMC), 2333 ZA Leiden, Nizozemska; s.kostidis@lumc.nl (SK); jcalarcon_barrera@lumc.nl (JCA-B.);m.a.giera@lumc.nl (MAG)

6 Epigenetske raziskave, Murdoch Children's Research Institute, Parkville, VIC 3052, Avstralija;boris.novakovic@mcri.edu.au.

7 Oddelek za pediatrijo, Univerza v Melbournu, Melbourne, VIC 3052, Avstralija.

8 Oddelek za genomiko in imunoregulacijo, Inštitut za življenje in medicinske vede (LIMES), Univerza v Bonnu, 53115 Bonn, Nemčija.

* Korespondenca: anaisa.validoferreira@radboudumc.nl (AVF); Jorge.dominguezandres@radboudumc.nl (JD-A.); Tel.: plus 31-2436-16636 (JD-A.).

For more information:1950477648nn@gmail.com