Prekomerna ekspresija GRP78 sproži PINK1-nevroprotektivno mitofagijo, posredovano z IP3R, 2. del

2.5. Western Blot

Podgane smo globoko anestezirali z Dolethalom (n=4) pri 7 dpi, da smo pridobili L4–L5 segmente hrbtenjače (5- mm dolžine) za Western blot analizo. Vzorce smo hitro zamrznili v tekočem dušiku.

V zadnjih letih je vedno več rezultatov raziskav pokazalo, da obstaja tesna povezava med blotingom beljakovin in spominom. Protein blotting je analitična tehnika za odkrivanje izražanja beljakovin, ki se pogosto uporablja v nevroznanstvenih raziskavah.

Povezava med nevroni je tesno povezana s shranjevanjem spomina. Beljakovinski blot lahko zazna status povezave med nevroni in izražanje pred- in postsinaptičnih proteinov, kar dodatno razkrije pomembno vlogo proteinov pri oblikovanju in shranjevanju spomina.

Študije so pokazale, da je izražanje presinaptičnih nevronskih proteinov tesno povezano s tvorbo in shranjevanjem spomina. Na primer, med procesom učenja in spomina nevroni spremenijo izražanje presinaptičnih proteinov, ta sprememba pa je povezana z nastajanjem in shranjevanjem novih spominov. Poleg tega so nekatere študije tudi ugotovile, da so spremembe v izražanju nekaterih beljakovin povezane z nevrodegenerativnimi boleznimi, kot je Alzheimerjeva bolezen.

Zato lahko blotiranje beljakovin zagotovi poglobljeno razumevanje statusa povezave med nevroni in sprememb v izražanju sorodnih proteinov, kar razkrije molekularni mehanizem nevronov. To je zelo pomembno za preučevanje mehanizma nastajanja spomina in nevrodegenerativnih bolezni.

Skratka, razmerje med blotiranjem beljakovin in spominom kaže vlogo beljakovin v povezavi med nevroni in shranjevanjem spomina. To daje nove ideje in usmeritve za preučevanje mehanizma nastajanja spomina in nevrodegenerativnih bolezni. Aktivno spodbujajmo nevroznanstvene raziskave in prispevajmo k zdravju in dolgoživosti! Vidimo lahko, da moramo izboljšati spomin, in Cistanche lahko bistveno izboljša spomin, ker ima antioksidativne, protivnetne učinke in učinke proti staranju, kar lahko pomaga zmanjšati oksidativne in vnetne odzive v možganih, s čimer ščiti zdravje živčnega sistem. Poleg tega lahko Cistanche spodbuja tudi rast in popravilo živčnih celic ter tako izboljša povezljivost in delovanje nevronskih mrež. Ti učinki lahko pomagajo izboljšati spomin, sposobnost učenja in hitrost razmišljanja ter lahko tudi preprečijo pojav kognitivnih motenj in nevrodegenerativnih bolezni.

Kliknite spoznajte načine za izboljšanje delovanja možganov

Vzorci so bili shranjeni ali nadalje obdelani s homogenizacijo v pufru za lizo (20 mM HEPES, pH 7,7, 251 mM saharoza, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA in mešanica zaviralcev proteaze (Sigma-Aldrich) in fosfataze (Roche, Basel, Švica) ) s Potterjevim homogenizatorjem na ledu.

Po centrifugiranju lizatov pri 800 × g 20 minut pri 4 ° C smo zbrali supernatant kot postnuklearno frakcijo in kvantificirali beljakovine z BCA testom (Pierce Chemical Co.).

Za western blot smo naložili 30 µg postnuklearnih frakcij segmentov L4–L5 iz vsake živali na 12 % SDS-poliakrilamidne gele, da smo izvedli elektroforetično ločevanje proteinov, čemur je sledil prenos na membrano PVDF v sistemu BioRadcuvette v 25 mM Tris, pH 8,4, 192 mM glicin, 20 % (v/v) metanol.

Membrane smo blokirali s 5 % BSA v PBS plus 0.1 % Tween-20 za 1 uro pri sobni temperaturi in nato inkubirali pri 4 ◦C čez noč s primarnim protitelesom: mišjim anti- -aktinom ( 1:10000; SigmaAldrich), mišji anti-GRP78 (1:500, Sigma-Aldrich), mišji anti-CV (1:1000, Invitrogen), kunčji anti-HSP60 (1:500, protitelesa-online), mišji anti- NDUFA9 (1:1000, Invitrogen), mišji anti-OPA1 (1:1000, BD Biosciences), zajčji anti-Parkin (1:500, Abcam, Cambridge, UK), mišji anti-PINK1 (1:500, Abcam), kunčji anti-NRF2 (1:500, Abcam), anti-MNF2 (1:500, Abcam), kunčji anti-GRP75 (1:500, Abcam).

Po več izpiranjih smo membrane 2 uri inkubirali z ustreznim sekundarnim protitelesom, konjugiranim s hrenovo peroksidazo (1:5000, Vector). Membrano smo vizualizirali z uporabo kemiluminiscenčne mešanice 1:1 (0,5 M luminola, 79,2 mM p-kumarinske kisline, 1 M Tris-HCl, pH 8,5) in (8,8 M vodikovega peroksida, 1 M Tris-HCl; pH 8,5) in slike so bile posnete z aparatom Gene Genome in analizirane s programsko opremo Gene Snap in Gene Tools (Syngene).

2.6. In vitro model

Celice NSC34 smo gojili v modificirani Eagle's medium high-glucose (DMEM, Biochrom, Cambridge, UK) z dodatkom 10% fetalnega govejega seruma (Sigma-Aldrich), 100 enot/mL penicilina in 0,5 X raztopine penicilina/streptomicina (Sigma-Aldrich) in vzdržuje v navlaženem inkubatorju pri 37 ◦C pod 5% CO2, v bistvu kot je opisano prej [26].

Po 4 dneh celične kulture brez menjave medija so imele celice NSC34 diferenciran fenotip, za katerega je značilna prisotnost dolgih nevritov. 4. dan so celicam dodali zdravila. Raztopini Tun (Sigma-Aldrich, Missouri, ZDA) in EFV (Bristol-Myers Squibb, New York, ZDA) smo pripravili v koncentraciji 10X in raztopili v DMEM.

Po 24 urah smo ocenili viabilnost celic z inkubacijo celic s 4 mg/mL raztopine MTT 3 ure. Nastale modre kristale formazana smo raztopili v DMSO in izmerili absorbanco pri 570 nm z bralnikom mikroplošč (Elx800, Bio-tek, Winooski, VT, ZDA).

2.7. Nukleofekcija

Transfektirali smo milijon celic z 2 µg plazmidom za izražanje GFP, GRP78, HAPARK, mišjega sh-eGFP, mišjega sh-PINK1 (ID 68943, Tebu-bio), mišjega sh-Hspa5 (ID 14828, Tebu-bio) in /ali miško sh-IP3R (ID 16440, Tebu-bio) z uporabo Amaxa Nucleofector II TM (Lonza, Basel, Švica) in kompleta Nucleofactor V (Lonza) po priporočilih proizvajalca.

Za statično citometrično analizo smo celice zasejali v {{0}}plošče z vdolbinicami, prevlečene z 10 % kolagena. Po gojenju smo celice fiksirali s 4 % PFA, dvakrat splaknili s PBS in shranili ali nato dodali blokirni pufer, ki je vseboval PBS 0,3 % (v/v) Triton X-100 in 10 % fetalnega govejega seruma. Po 3 dneh celične kulture smo dodali zdravila, raztopljena v DMEM.

Za te poskuse smo uporabili 1 µM Tun (Sigma-Aldrich), 10 µMCCCP (Sigma-Aldrich), 5 µM CsA (Sigma-Aldrich) ali 10 µM BAPTA-AM (Sigma -Aldrich). Po 5 urah po zdravljenju smo bodisi fiksirali celice za imunocitokemijo s 4% PFA ali pa jih homogenizirali v modificiranem pufru RIPA (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA , 1 % NP-40, 0,5 % natrijev deoksiholat, 0,1 % SDS, koktajli proteaze in fosfataze) za imunobloting. Imunohistokemijo smo izvedli z dvakratnim izpiranjem vzorcev s PBS in inkubiranjem z blokirnim pufrom, ki je vseboval PBSplus 0,3 % (v/v) Triton X-100 in 10 % fetalnega govejega seruma.

Inkubirali smo z naslednjimi primarnimi protitelesi: zajčji anti-IP3R (1:200, Abcam), mišji anti-HA (1:2000, Abcam), mišji anti-GRP78 (1:200, Sigma-Aldrich) in zajčji anti-HSP60 (1:500, Antibodies-online). Za oceno sposobnosti preživetja z MTT, kot je opisano zgoraj, smo zdravljenje pustili 24 ur.

2.8. Merjenje mitohondrijske proizvodnje superoksida in ∆ψM

Celice smo inkubirali z 2,5 µM MitoSOX za analizo superoksida ali z 2,5 µMTMRM za analizo ∆ψM, oboje iz Molecular Probes in Invitrogen v zadnjih 30 minutah zdravljenja. Fluorescenca je bila zaznana z mikroskopom IX81 Olympus in kvantificirana s programsko opremo za statično citometrijo.

2.9. Elektrokemijsko merjenje porabe kisika

Celice (1 × 106 na 1 ml v HBSS) so bile premešane v plinotesni komori pri 37 ◦C. Meritve so bile opravljene z O2 elektrodo tipa Clark (Rank Brothers, Cambridge, UK) in zabeležene s podatki Dup.18 naprava za zajemanje (WPI) takoj po 5-hobdelavi z vehiklom ali Tun.

2.10. Mitohondrijska in citosolna frakcionacija

Celice smo homogenizirali v pufru za lizo (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM EGTA, 250 mM saharoze in mešanico proteaz (Sigma-Aldrich) in inhibitorjev fosfataze (Roche)) s Potterjevim homogenizatorjem na ledu.

Po centrifugiranju lizatov pri 2000× g 5 minut smo supernatant centrifugirali pri 10.000 × g 12 minut. Supernatant je bil obravnavan kot topna frakcija (S2) in vsebuje citosolne proteine ​​in mikrosome.

Peleta (P2) je bila obogatena mitohondrijska frakcija, ki je bila resuspendirana v modificiranem pufru RIPA (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1 % NP{{8 }}, 0,5 % natrijevega deoksiholata, 0,1 % SDS, koktajli proteaze in fosfataze) in koncentracija beljakovin je bila določena z BCA testom. Vzorci so bili nato obdelani za Western blot.

2.11. Transmisijska elektronska mikroskopija

Segmente hrbtenjače L{{0}}L5 (1-mm rezine) smo potopili v raztopino za fiksiranje 2 % (m/v) PFA in 2,5 % (v/v) glutaraldehida (razred EM) v 0,1 M PBS, pH 7,4 in jih postavili na zibalno ploščad za 2 uri, nato fiksirali v 1 % (m/v) PFA in nato naknadno fiksirali z 1 % (m/v) osmijevega tetroksida (TAAB Lab ), ki vsebuje 0,08 % (m/v) kalijevega heksacianoferata (Sigma-Aldrich) v PBS 2 uri.

Izvedli smo štiri izpiranja z deionizirano vodo in zaporedno dehidracijo v acetonu. Vsi postopki so bili izvedeni pri 4 ◦C, kot je opisano prej [33]. Vzorce smo vdelali v EPON smolo in polimerizirali pri 60 ◦C 48 ur.

Vzorci so bili obdelani za pridobitev poltankih rezov (1 µm) z mikrotomom Leicaultracut UCT, obarvani z 1 % (m/v) vodno raztopino toluidin modrega in pregledani s svetlobnim mikroskopom za identifikacijo ventralnih rogov, obogatenih z MN.

Ultratanke rezine (70 nm) so izrezali z diamantnim nožem, jih položili na prevlečene mreže in jih primerjali z običajnimi raztopinami uranil acetata in Reynoldsovega svinčevega citrata.

Na koncu smo odseke opazovali s transmisijskim elektronskim mikroskopom (Jeol 1400), opremljenim s kamero GatanUltrascan ES1000CCD. Izbrali smo tri rezine na stanje, analizirali tri MN na odsek in izmerili površine jeder v primerjavi s celotno površino MN z orodji ImageJ.

2.12. Bioinformatika in statistika

Uporabili smo analizo variance (ANOVA) za primerjavo vrednosti med različnimi eksperimentalnimi skupinami za podatke, ki so ustrezali predpostavki o normalnosti. Razlike med skupinami so bile analizirane z enosmerno ANOVA, ki ji je sledil Tukeyjev post hoc test več razponov ali z uporabo Studentovega t-testa. Vse statistične analize so bile narejene s programsko opremo GraphPad Prism5 (n=3–5; p < 0.05 za pomembnost).

3. Rezultati

3.1. Besedilo

3.1.1. Proteomska analiza prekomerne ekspresije GRP78 je razkrila mitohondrije kot glavno tarčo

Da bi identificirali molekularne mehanizme, ki vodijo do nevroprotekcije, ki jo posreduje prekomerna ekspresija GRP78, smo izvedli primerjalno proteomsko analizo brez oznak, da bi ugotovili kvantitativne in kvalitativne razlike med živalmi, poškodovanimi z RA, okuženimi z adenovirusi za prekomerno ekspresijo GRP78 (Ad-GRP78), za katero je bilo prej ugotovljeno, da deluje nevroprotektivno MN ali beta-galaktozidazo (Ad-ß-Gal) kot kontrolo [20].

Sedem dni po poškodbi (dpi) je bila izbrana časovna točka za analizo glede na prejšnje študije, izvedene v našem laboratoriju [20, 25]. V prejšnji primerjavi med modelom regeneracije po distalni aksotomiji in šivu ishiadičnega živca v primerjavi z našim modelom degenerativnega RA smo opazili, da so bili signalni dogodki podobni do 7 dpi, ko so se po RA pojavili divergentni pro-degenerativni dogodki [20,25].

Analiza postnuklearnih frakcij iz L4-L5 segmentov hrbtenjače LC-MS/MS brez oznak je privedla do identifikacije 1420 proteinov z vsaj dvema peptidoma na protein, kot je bilo prej navedeno za druge vzorce in študije [25] .

Skupaj 566 oziroma 732 beljakovin ali peptidov je bilo znatno spremenjenih zaradi prekomerne ekspresije Ad-GRP78 oziroma Ad-ß-Gal pri živalih, poškodovanih z RA, v primerjavi z živalmi, poškodovanimi z RA, ki niso okužene z virusom (p < 0 .05) (tabeli S1 in S2).

Primerjali smo oba seznama in ugotovili, da je bilo 220 edinstveno spremenjenih zaradi čezmerne ekspresije Ad-GRP78 (tabela S3). Funkcionalna označba teh proteinov z uporabo orodja Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery (DAVID) nam je omogočila identifikacijo najpomembnejše biološke funkcije v nizu podatkov (FDR < 0,05) [34,35].

Prekomerna ekspresija GRP78 je povzročila razlike v ravneh beljakovin, vključenih v mitohondrijske procese, delovanje in komponente (tabela S4A–C, slika S1A–C). Izrazi genske ontologije (GO) in analiza obogatitve poti KEGG s temi podatki je pokazala, da je pri živalih, okuženih z Ad-GRP78, prišlo do znatnega znižanja ravni številnih proteinov z mitohondrijskimi funkcijami, vključno z proteini iz zunanjega in notranjega obraza mitohondrijev, proteini dihalnega kompleksa, in matrične beljakovine.

Potrdili smo razlike v ravneh beljakovin, razkritih na proteomskem seznamu, kot je GRP75, ki je bil reguliran navzgor (p < 0.05), in podenota kompleksa V (CV), znižana (p=0.03) v skupinah GRP78, kot je bilo pričakovano (slika 1A).

Na celotnem seznamu so bili najbolj znižani 2-oksoglutarat/malat nosilec proteina OGC (SCL25A11), MT-ND3 (supresor tumorja, ki sodeluje pri preklopu themalate-aspartata in regenerira bazen NADH v mitohondrijskem matriksu, da omogoči kompleks I funkcijo), podenoto NADH dehidrogenaze 3 kompleksa I, aminotransferazo gamaaminomaslene kisline ABAT in podenoto ubikinol-citokrom C reduktaze kompleksa III. Nasprotno pa je bilo zelo malo beljakovin reguliranih (slika 1B).

En zvišano reguliran protein je bil GRP78, kot je bilo pričakovano, drugi zvišano regulirani proteini pa sta bila prenašalec aminokislin EAAT2, ki se primarno nahaja v plazemski membrani in včasih v mitohondrijih pri ekscitatornih sinapsah, in hidroksiacil-CoA dehidrogenaza HADHA, ki katalizira zadnje tri korake mitohondrijske beta -oksidacija dolgoverižnih maščobnih kislin.

Analizo smo razširili, da bi raziskali, ali so bili drugi proteini v mitohondrijih ali proteini, povezani s funkcijo mitohondrijev, spremenjeni s proteomskega seznama, da bi potrdili funkcionalno prizadetost mitohondrijev (slika 1C).

Opazili smo, da je bila mitohondrijsko ohranjena z dinaminom povezana optična atrofija 1 GTPase (OPA1), ki je vključena v fuzijo [36], zmanjšana (p < 0.1); LONP1, od ATP-odvisne proteaze, ki posreduje pri selektivni razgradnji napačno zvitih polipeptidov, je pokazala težnjo k povečanju, vendar niso opazili nobenih razlik v ravneh ubikinona NDUFA9, transkripcijskega faktorja NRF2, ki uravnava gene, ki vsebujejo antioksidativne odzivne elemente, ali drugih dinamikov z GTP-azo, ki je vključena v infuzijo, kot je mitofuzin 2 (MFN2) [36].

Obsežen povzetek sprememb, odkritih v mitohondrijih, je prikazan v shemi na sliki 1D. Mitohondrijska dinamika je pomembna za odzive na stres, saj se lahko poškodovani mitohondriji združijo za izmenjavo materiala, mitohondrijska fisija pa omogoča ločevanje poškodovanih mitohondrijev in kasnejšo mitofagijo [37].

Glede na to, da se večje število znižano reguliranih proteinov lokalizira v mitohondrijih in da z analizo MFN2 in razmerja med oblikami L/S OPA1 (slika 1C) niso opazili nobenih očitnih sprememb v zvezi z aktivnostjo fuzije mitohondrijev (slika 1C), smo raziskali markerje, povezane z mitofagijo.

Klasično se od avtofagije odvisna razgradnja mitohondrijev pojavi po depolarizaciji in jo običajno sproži povečano kopičenje domnevne kinaze 1 (PINK1), ki jo povzroči fosfataza in tensinhomolog (PTEN) v polni dolžini na zunanji mitohondrijski membrani.

Nato se ubikvitin-proteinska ligaza Parkin vmesnega obroča E3 rekrutira za označevanje proteina mitohondrijske zunanje membrane depolariziranih mitohondrijev z ubikvitilacijo [38–41]. Zgornji del slike 2A ne prikazuje sprememb ravni Parkin, ampak znatno zmanjšanje PINK1 v celotni dolžini, ki ga povzroči poškodba RA v ipsilateralnem L4-L5 segmentu hrbtenjače glede na kontrolo pri 7 dpi. Nasprotno pa je čezmerna ekspresija GRP78 zmanjšala Parkin, vendar je podvojila ravni PINK1 po RA v primerjavi s kontrolno ekspresijo nesorodnega proteina -Gal (slika 2A, spodaj).

Povečana regulacija PINK1 celotne dolžine je skladna z indukcijo mitofagije [42], zmanjšanje parkina pa bi lahko bilo povezano z napredovalim stanjem razgradnje organelov, kot opažajo preostali mitohondrijski proteini.

Nadalje raziskujemo so-lokalizacijo mitohondrijev in z mikrotubulom povezanih proteinov 1A/1B lahke verige 3 (LC3)-pozitivne punkte, ključne sestavine osrednjega stroja za makroavtofagijo in potrebne za proces mitofagije [43].

S konfokalno mikroskopijo smo opazili znatno povečanje ko-lokalizacije mitohondrijev, označenih z anti-COX IV, s LC3-pozitivnimi punktami po RA samo v poškodovanih MN, ki prekomerno izražajo GRP78 pri 7 dpi (slika 2B).

Z analizo vzorca z uporabo transmisijske elektronske mikroskopije smo potrdili obstoj mitofagije pri avulziranih MN le pri čezmerni ekspresiji GRP78.

Opazili smo obilo vakuol z zajetimi mitohondriji, značilnost mitofagije [37], ki spominjajo na mitofagosome, in več ERcistern v tesni povezavi z mitohondriji znotraj MN pri živalih Ad-GRP78, vendar jih nismo odkrili pri Ad- -Gal RA poškodovanih vzorci podgan pri 5 dpi (slika 2C).

Slika 1. Prekomerna ekspresija GRP78 pri živalih, poškodovanih z RA, cilja na mitohondrijske beljakovine. (A) Imunoblot in stolpčni grafi, ki prikazujejo povprečne kratne spremembe (± SEM) ravni GRP78, GRP75 in CV beljakovin v L4-L5 segmentih hrbtenjače v GRP78 v primerjavi s.

-Gal, ki prekomerno izraža podgane, poškodovane z RA, za 7 dpi. Ravni so bile normalizirane na vrednosti aktina (n=4; * p < 0.05 v primerjavi z Ad- -Gal, Studentov t-test). (B) Histogram sprememb gube mitohondrijskih beljakovin, pridobljen s proteomsko analizo L4-L5 segmentov hrbtenjače pri živalih, poškodovanih z RA, ki čezmerno izražajo GRP78 v primerjavi s skupino Ad- -Gal za 7 dpi. (C) Imunoblot in stolpčni grafi, ki prikazujejo povprečne kratne spremembe (± SEM) NDUFA9, LONP1, NRF2, MFN2, OPA-1, normaliziranih na aktin. (Med skupinami ni pomembnih razlik. Studentov t-test). (D) Shematski mitohondriji z beljakovinami, spremenjenimi s prekomerno ekspresijo GRP78 v segmentih hrbtenjače L4-L5 pri živalih, poškodovanih z RA, označeni z rumeno (zmanjšano) ali modro (povečano) pri 7dpi.

Slika 2. Mitofagija je modulirana in vivo po RA pri podganah, ki prekomerno izražajo GRP78. (A) Imunobloti in ustrezni stolpčni grafikoni za PINK1 in PARK analizo kratne spremembe ravni beljakovin (srednje vrednosti ± SEM), normalizirane na ravni aktina, v L4-L5 segmentih hrbtenjače podgan, poškodovanih z RA v primerjavi s.

nadzor (zgoraj) ali iz skupin Ad{{0}}Gal in Ad-GRP78 (spodaj) za 7 dpi. (n=4; * p < 0,05, Studentov t-test). (B) Levo, mikrofotografije reprezentativnih MN na ipsilateralnem mestu živali, poškodovanih z RA, ki so prejele intratekalno injekcijo AAVrh10-GFP ali AAVrh10-GRP78 skupin pri 7 dpi. Vzorci so bili obarvani na COX IV (rdeče) in LC3 (zeleno) ter kontrastno obarvani s fluorescentnim Nisslom (modro).

Merilna vrstica=10 µm in digitalni zoom v vstavkih 10X.

Upoštevajte, da je lokalizacija opažena samo v skupini AAVrh10-GRP78. Desno, stolpčni graf, ki prikazuje analizo % točk solokalizacije COX IV in LC3. Povprečje ± SEM ko-lokalizacije COX IV in LC3 (n=4; ** p < 0.01, Studentov t-test). (C) Reprezentativne slike transmisijske elektronske mikroskopije, kjer se mitohondrije razlikujejo znotraj MN hrbtenjače: a, slika citoplazme MN, ki prikazuje mitohondrije v kontrolni živali; b, slika citoplazme MN iz podgane, poškodovane z RA, iz skupine Ad- -gal; c, slika citoplazme MN iz RA-poškodovane podgane iz skupine Ad-GRP78 z nekaj zajetimi mitohondriji, označenimi z rdečimi zvezdicami; d, slika z večjo povečavo je prikazana na (C), ki kaže na velike mitohondrije in stik z ER. Na slikah so prikazane lestvice.

Skupaj so ti rezultati pokazali, da lahko čezmerna ekspresija GRP78 inducira mitofaginsko nepovezane MN po RA in bi lahko spodbujala nevroprotekcijo.

3.1.2. Prekomerna ekspresija GRP78 obnovi poškodovano mitohondrijsko funkcijo

Nato smo dodatno raziskali učinek prekomerne ekspresije GRP78 na mitohondrije z in vitro modelom ER stresa, saj se ta napad pojavi zgodaj po poškodbi RA in vivoas, o kateri smo že poročali [20, 26], in je zanesljiva metoda za pregledovanje novih nevroprotektivnih učinkovin [2, 44]. ].

Ta model uporablja tunikamicin (Tun), ki je induktor ER-stresa, ki povzroči nastanek N-acetilglukozamin-lipidnih intermediatov, s čimer preprečuje glikozilacijo na novo sintetiziranih proteinov in povzroči napačno zvijanje proteinov. To smo uporabili, ker so poročali tudi, da je zaustavljena sekrecijska pot ključna v nevrodegenerativnem procesu po RA [26].

Najprej smo preverili, da je nukleofekcija celic, podobnih motonevronu NSC34, z ustreznim vektorjem povzročila proizvodnjo GRP78 (slika 3A). V teh celicah je izražanje GRP78 znatno povečalo preživetje v mediju, ki je vseboval Tun (slika 3B).

Čeprav zdravljenje s Tunom običajno sproži sam GRP78, je ta endogena prekomerna ekspresija precej pozna (za 24 ur) (slika S2). Spraševali smo se tudi, ali bi lahko ugotovili, ali ima čezmerna ekspresija GRP78 nevroprotektivne učinke v drugem modelu in vitro, za katerega smo prej poročali, da reproducira več značilnosti MN smrti po poškodbi RA [26].

Ta model temelji na poškodbi citoskeleta, ki jo povzroči nokodazol, ki moti polimerizacijo mikrotubulov. Ekspresija GRP78 je povečala sposobnost preživetja celic, gojenih tudi v prisotnosti nokodazola (slika 3B).

Nato smo ocenili delovanje mitohondrijev z merjenjem nastajanja reaktivnih kisikovih vrst (ROS) v mitohondrijih z uporabo MitoSOX, potenciala mitohondrijske membrane (∆ψm) z uporabo tetrametilrodamin metil estra (TMRM) in stopnje porabe O2 v naših celicah NSC34, izpostavljenih stresu ER. z ali brez prekomerne ekspresije GRP78.

Kot pozitivno kontrolo smo uporabili efavirenz (EFV), mitotoksično sredstvo, ki spremeni vse tri parametre [45]. Opazili smo, da so se ravni MitoSOX po dodatku Tun progresivno povečale in dosegle statistično značilnost za 24 ur in da se je proizvodnja ROS znatno povečala v celicah, zdravljenih z EFV, od prve ure po zdravljenju glede na kontrole, zdravljene z vehiklom (slika S3A).

Prekomerna ekspresija GRP78 je povzročila znatno nižje ravni ROS v mitohondrijih glede na celice, ki izražajo GFP, 24 ur po zdravljenju s Tun ali EFV (slika 3C). ∆ψm se je zrušil po 5 in 24 urah zdravljenja s Tun in po 24 urah zdravljenja z EFV (slika S3B). Obnovitev tega parametra je bila dosežena s prekomerno ekspresijo GRP78 v celicah, zdravljenih s Tun ali EFV (slika 3D).

Stopnja porabe O2 se je zmanjšala med 80 min analize po dodatku Tun v celicah, ki izražajo GFP (naklon −0.063,R2=0.98), vendar je bila poraba O2 stabilen v celicah s prekomerno ekspresijo GRP78- kljub prisotnosti Tun (naklon −0,221, R2=0.99) (slika 3E, levo).

Po 5 urah je bilo dihanje normalno v celicah s prekomerno ekspresijo GRP78- in resno ogroženo v celicah z ekspresijo GFP (slika 3E, desno). Ti rezultati skupaj kažejo, da GRP78 oslabi mitohondrijsko disfunkcijo, ki jo povzroča ER stres ali mitotoksičnost.

For more information:1950477648nn@gmail.com