Inhibicija GSK3 s fosforilacijo na Ser389 nadzoruje nevrovnetje
Oct 24, 2023
Povzetek: Zaviranje glikogen sintaze kinaze 3 (GSK3) s fosforilacijo Ser9 vpliva na številne fiziološke procese, vključno z imunskim odzivom. Vendar pa so posledice inhibicije GSK3 z alternativno fosforilacijo Ser389 še vedno slabo opisane. Tukaj smo pregledali nevrovnetje pri GSK3 Ser389 knock-in (KI) miših, pri katerih je oslabljena fosforilacija Ser389 GSK3. Število aktivirane mikroglije/infiltriranih makrofagov, astrocitov in infiltriranih nevtrofilcev je bilo pri teh živalih znatno večje v primerjavi s primerki C57BL/6J divjega tipa (WT), kar nakazuje, da neuspeh pri inaktivaciji GSK3 s fosforilacijo Ser389 povzroči trajno nizko stopnjo nevrovnetje. Poleg tega aktivacija glialnih celic in možganska infiltracija imunskih celic kot odziv na lipopolisaharid (LPS) ni uspela pri miših GSK3 Ser389 KI. Takšni učinki so bili specifični za možgane, saj periferna imunost ni bila podobno prizadeta. Poleg tega fosforilacija IkB kinaznega kompleksa (IKK) kot odziv na LPS ni uspela pri miših GSK3 Ser389 KI, medtem ko je bila fosforilacija STAT3 popolnoma ohranjena, kar kaže, da ta regulativna pot GSK3 posebej vpliva na signalno pot NF-κB. Naše ugotovitve na splošno kažejo, da inaktivacija GSK3 s fosforilacijo Ser389 nadzoruje vnetni odziv možganov, kar povečuje potrebo po oceni njegove vloge pri napredovanju nevroinflamatornih patologij.
cistanche tubulosa - protivnetno
Ključne besede: nevrovnetje; mikroglija; astrociti; nevtrofilci; signalizacija NF-κB; pretočna citometrija
Kaj naredi zelišče cistanche—Proti- vnetna
Kliknite tukaj za ogled izdelkov Cistanche
【Vprašajte za več】E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
1. Uvod
Glikogen sintaza kinaza 3 (GSK3) je serin-treonin kinaza s široko specifičnostjo. GSK3 uravnava tako različne procese, kot so vnetje, rast celic, diferenciacija celic in presnova energije, in je vpleten v bolezni, povezane s staranjem, kot so sladkorna bolezen, Alzheimerjeva bolezen in rak [1]. Obe izoformi GSK3, GSK3 in GSK3, sta vseprisotno izraženi, vendar se njuni funkciji ne prekrivata popolnoma [2]. GSK3 je konstitutivno aktiven, čeprav je njegovo aktivnost mogoče inhibirati s sekvestracijo v citosolne komplekse kot tudi s fosforilacijo na ostankih Ser9 in Ser389 [3]. Akt-inducirana fosforilacija GSK3 pri Ser9 je regulativna pot GSK3, ki je prisotna v večini tipov celic, in je privzeta pot za omejevanje aktivacije GSK3 in preprečevanje celične smrti. V nasprotju s tem smo ugotovili, da je fosforilacija Ser389, ki jo povzroča p38 MAPK, omejena na specifična tkiva, kot so možgani, timus in vranica [4] in da je možganska ekspresija fosfo-Ser389 GSK3 razvojno regulirana [5]. Fosforilacija GSK3 s Ser389 se sproži predvsem z odzivom na prekinitev dvojne verige DNA in ključnega pomena je omogočiti popravilo DNA [6,7]. Medtem ko je torej fosforilacija na Ser9 glavna pot za inaktivacijo citoplazemskega GSK3, se fosforilacija Ser389 uporablja za inaktivacijo jedrskega bazena GSK3 za povečanje preživetja med popravljanjem DNK DSB [8]. Neuspeh pri inaktivaciji GSK3 s fosforilacijo Ser389 kot odziv na DSB povzroči povečano celično smrt zaradi nekroptoze [6,7]. To je zelo pomembno, ker je nekroptotični tip smrti bolj vneten in so ga našli pri vnetnih boleznih [9]. Vendar pa za razliko od fosforilacije Ser9 posledice fosforilacije GSK3 na Ser389 ostajajo slabo opisane. Številne študije so podprle povezavo med GSK3 in vnetjem. Tako aktivacija GSK3 z vnetnimi dražljaji, kot so stres, okužba ali travma, spodbuja nastajanje protivnetnih citokinov, kot so IL-6, IL-1 in IFN, medtem ko inhibicija GSK3 zavira sintezo pro-vnetnih mediatorjev in poveča proizvodnjo IL-10 v imunskih celicah [10]. GSK3 lahko aktivira lipopolisaharid (LPS), eden glavnih imunostimulacijskih endotoksinov po Gramu negativnih bakterij [11,12]. Po vezavi bakterijskega LPS na Toll-like receptorje (TLR) GSK3 posreduje pri sproščanju vnetnih citokinov v celicah prirojenega imunskega sistema [13]. Poleg tega so poročali, da uporaba zaviralcev GSK3 pri miših, zdravljenih s smrtonosnim odmerkom LPS, bistveno poveča preživetje živali [14]. Kljub tem protivnetnim učinkom, povezanim z GSK3, so bili dokumentirani tudi protivnetni učinki [15,16]. Tako je regulacija GSK3 ključna za vzdrževanje ravnovesja med pro- in protivnetnimi citokini po aktivaciji TLR [17]. Jedrski faktor kB (NF-kB) posreduje pri nastajanju vnetnih citokinov in je eden glavnih transkripcijskih faktorjev, ki jih aktivirajo TLR. Več avtorjev je potrdilo, da lahko GSK3 aktivira signalizacijo NF-kB s fosforilacijo IkB kinaznega kompleksa (IKK), ki fosforilira IkB in sprosti aktivni NF-kB. Drugi transkripcijski faktor, ki ga fosforilira GSK3, je signalni pretvornik in aktivator transkripcije -3 (STAT3), ki posreduje pri nevrovnetju v kontekstu septičnega šoka [18]. Fosforilacija STAT3 z GSK3 povzroči jedrsko translokacijo in aktivacijo. Poleg tega GSK3 zavira protivnetne transkripcijske aktivnosti CREB in AP-1, s čimer poveča izražanje vnetnih citokinov [10,19]. Celice mikroglije so rezidenčni makrofagi v CNS. Skupaj z infiltriranimi levkociti ima aktivacija mikroglije ključno vlogo pri nevrovnetju. Astrociti so tudi glialne celice z nevroimunskimi funkcijami, saj preslušajo mikroglijo, levkocite in endotelne celice ter tako modulirajo tako prirojene kot adaptivne imunske odzive [20]. Za aktivacijo mikroglije in astrocitov kot odziv na vnetne dražljaje (glioza) so značilne velike celične spremembe, ki vključujejo proliferacijo, hipertrofijo in sproščanje citokinov [21]. GSK3 je bil vključen v razvoj glioze kot odziv na LPS ali s prekomerno ekspresijo nevralnega GSK3 [22]. Obstajajo tudi dokazi, da lahko glialno reaktivnost in nevrovnetje, inducirano z GSK3, posredujeta aktivacija poti NF-kB v možganih [19, 23]. Nasprotno pa inaktivacija GSK3 zmanjša glialno reaktivnost, omeji nevroinflamatorni odziv in poveča protivnetno aktivnost CREB v živčnih celicah [24]. Posledično je bilo predlagano, da ima GSK3 temeljno vlogo pri napredovanju nevroinflamatornih motenj, kot sta Alzheimerjeva bolezen in multipla skleroza [25]. Fosforilacija je regulativni mehanizem aktivnosti GSK3 z velikimi posledicami za nadzor imunskega odziva. Tako inhibicija GSK3 s klasično fosforilacijo Ser9 poveča produkcijo protivnetnih mediatorjev in zmanjša sproščanje vnetnih citokinov [26], čeprav je vključena tudi v razrešitev vnetja v modelu eksperimentalnega kolitisa, ki ga povzroča trinitrobenzen sulfonska kislina. [27]. V možganih je bila pomanjkljiva inhibicija GSK3 s fosforilacijo Ser9 povezana z vnetnimi nevropatologijami, kot sta Parkinsonova bolezen [28] in shizofrenija [29]. Nasprotno pa kljub visokim nivojem fosfo-Ser389 GSK3 v možganih [4] ostaja neznano, ali ima ta pot za inaktivacijo GSK3 vlogo pri uravnavanju nevrovnetja. Tukaj raziskujemo možno vlogo inaktivacije GSK3, ki jo posreduje fosforilacija Ser389, pri nevroinflamaciji z uporabo miši GSK3 KI, pri katerih je bil GSK3 Ser389 nadomeščen z Ala, da se prepreči C-terminalna fosforilacija GSK3 [7,8]. Naši rezultati razkrivajo, da neuspeh pri neaktivnem GSK3 s fosforilacijo na Ser389 v fizioloških pogojih vodi do kroničnega nevroinflamacije nizke stopnje, pa tudi do pomanjkanja odziva na vnetne dražljaje, kot je LPS. Zdi se, da je to kronično vnetje specifično za možgane, saj periferni imunski sistem večinoma ni prizadet. Pokazali smo tudi, da odsotnost fosfo-Ser389 GSK3 v možganih miši GSK3 KI uravnava signalizacijo NF-kB, ki je osrednji dogodek pri nadzoru nevroinflamacije. Zato naše ugotovitve podpirajo vpletenost inaktivacije GSK3 s fosforilacijo Ser389 v vnetne nevropatologije.
2. Rezultati
2.1. Neuspeh pri inaktivaciji GSK3 s fosforilacijo Ser389 vodi do povečanega bazalnega nevrovnetja
Inaktivacija GSK3 s fosforilacijo na Ser9 je bila povezana s protivnetno stopnjo v možganih [30]. Čeprav je inaktivacija GSK3 s fosforilacijo na Ser389 pomembna za zmanjšanje nevronske smrti, ki jo povzročajo prelomi dvojne verige DNK v možganih, nobena študija ni raziskala, ali bi ta pot lahko uravnavala tudi nevroinflamatorni odziv. Zato smo uporabili prej opisane miši GSK3 Ser389 KI, v katerih je Ser389 nadomeščen z Ala, da preprečimo fosforilacijo Ser389. Pregledali smo rezidenčne in infiltrirane imunske celice v celih možganih (razen malih možganov in vohalnih čebulic) miši WT in GSK3 Ser389 KI z mehansko disociacijo tkiva in Percollovim gradientom, po predhodno optimiziranem protokolu, da dobimo uravnoteženo mešanico rezidenčnih in infiltriranih celic v možganih, vključno z mikroglijo/makrofagi, astrociti, infiltriranimi nevtrofilci in limfociti [31]. Celice smo nato analizirali s pretočno citometrijo z uporabo standardnih markerjev (slika S1 v dopolnilnih materialih) [31–33]. Aktivirane in mirujoče mikroglije/makrofage so identificirali kot CD11b+CD45high oziroma CD11b+CD45low, medtem ko je bila limfocitna populacija označena kot CD45+CD11b− [32,34]. Nevtrofilci so bili označeni kot celice CD45+Ly6G+; in astrocite smo definirali znotraj populacije CD45− z izražanjem antigena celične površine-2 (ACSA-2). Ta marker se uporablja za odkrivanje razvijajočih se in odraslih astrocitov [35]. Regulacijo ACSA-2 so opazili v reaktivnih astrocitih, povezanih z vnetnimi stanji, kot je avtoimunska demielinizacija [36]. Prej smo ugotovili, da se število astrocitov ACSA-2+ v možganih miši poveča po zdravljenju z LPS, kar nadalje kaže, da je raven izražanja ACSA-2 v korelaciji z aktivacijo astrocitov kot odgovor na vnetne dražljaje [31]. Čeprav se ACSA-2 lahko izraža tudi v majhni subpopulaciji mikroglije in makrofagov [35], so te celice znotraj populacije CD45+. Analiza pretočne citometrije izolatov možganskih celic iz miši v fizioloških pogojih je pokazala izrazito povečanje deleža aktivirane mikroglije/makrofagov pri miših GSK3 Ser389 KI v primerjavi z mišmi WT (slika 1a). V nasprotju s tem se je odstotek mikroglije v mirovanju zmanjšal v možganih miši GSK3 Ser389 KI (slika 1b). Poleg tega je prišlo do izrazitega povečanja prisotnosti astrocitov ACSA-2+ (tj. aktiviranih astrocitov) pri miših GSK3 Ser389 KI (slika 1c). Kar zadeva infiltracijo imunskih celic v možganih, je prišlo do očitnega kopičenja nevtrofilcev v možganih miši GSK3 Ser389 KI v primerjavi z mišmi WT (slika 1d), kar dodatno dokazuje prisotnost vnetnega odziva v možganih miši GSK3 Ser389 KI pod fiziološkim pogoji. Vendar pa pogostnost levkocitov CD45+CD11b− (pretežno limfocitnih celic) v možganih ni bila prizadeta pri miših GSK3 Ser389 KI (slika 1e). Ti rezultati skupaj kažejo, da neuspeh pri zaviranju GSK3 s fosforilacijo na Ser389 vodi do kroničnega prirojenega vnetnega odziva v možganih, ki povzroča reaktivnost med mikroglijo in astrociti.
Slika 1. Inaktivacija GSK3 s fosforilacijo Ser389 vpliva na populacije možganskih celic, ki so vpletene v nevrovnetje. Možgane miši WT in miši GSK3 Ser389 KI smo odstranili in obdelali za analizo s pretočno citometrijo (a) CD11b++CD45 visoko aktivirane mikroglije/makrofagov, (b) CD11b++CD45 mikroglije v nizkem mirovanju, (c) ACSA -2+ astrociti, (d) nevtrofilci Ly6G+ in (e) limfociti CD11b−. Histogrami predstavljajo število celic, izraženo kot odstotek celic CD45− (astrocitov) ali celic CD45+ (vse druge populacije). Podatki so prikazani kot povprečje ± SEM (n=7–9). Za primerjavo genotipov smo uporabili Studentov t-test. *, p < {{20}}.05; **, p < 0,01. WT, divji tip; KI in GSK3 Ser389 trka.
2.2. Pomanjkanje učinka fosforilacije GSK3 pri Ser389 na celice vranice
Da bi raziskali, ali je spremenjeno vnetno stanje, odkrito pri miših GSK3 Ser389 KI, omejeno na možgane ali je učinek tudi sistemski, smo izvedli analizo pretočne citometrije za različne celične populacije v vranici. Nevtrofilci so bili identificirani kot celice Ly6G+. Ekspresija Ly6G je bila zelo spremenljiva, saj je odvisna od stopnje zorenja celic, kot je bilo prikazano prej [37]. Poleg tega so bile monocitne mieloidne celice označene kot celice Ly6G–CD38+CD11b+. Ti monociti/makrofagi so predstavljali dve jasno različni populaciji na podlagi ravni izražanja CD38, kot je bilo že poročano [38]. Ocenjene so bile tudi celice CD8+, celice CD4+ in celice B220+ (celice B) (slika S2 v dodatnem materialu).
Slika 2. Analiza pretočne citometrije kaže podobne populacije vraničnih celic pri miših WT in GSK3 Ser389 KI. Po disociaciji celic vranice smo s pretočno citometrijo ocenili število (a) Ly6G+ nevtrofilcev, (b) CD38+CD11b+ monocitov/makrofagov, (c) CD4+ celic, (d) celice CD8+ in (e) celice B220+. Histogrami prikazujejo število celic, izraženo kot odstotek vseh celic. Podatki ustrezajo povprečju ± SEM (n=5–7). Za primerjavo genotipov smo uporabili Studentov t-test. WT, divji tip; KI, trkanje GSK3 Ser389.
2.3. LPS ne more povečati nevrovnetja pri miših GSK3 Ser389 KI
Nato smo raziskali, ali lahko odprava fosforilacije Ser389 poleg povzročanja bazalnega toničnega vnetja vpliva tudi na vnetni odziv, ki ga sproži LPS. Miši WT in GSK3 Ser389 KI so intraperitonealno injicirali subletalni odmerek (0,5 mg/kg) bakterijskega lipopolisaharida (LPS). Vnetni odziv možganov je bil raziskan tri dni pozneje, saj je bilo prej dokazano, da takšno zdravljenje povzroča vnetje nizke stopnje v možganih miši [39, 40]. Ta odziv LPS spominja tudi na kronično vnetno stanje, opaženo pri številnih nevroloških boleznih, vključno z depresijo, anksioznostjo in Parkinsonovo boleznijo [41, 42]. Kot je bilo pričakovano, je LPS povzročil glialno reaktivnost pri miših WT, kar je bilo ugotovljeno s povečanjem pogostnosti aktivirane mikroglije/makrofagov (slika 3a) in zmanjšano pogostnostjo mikroglije v mirovanju (slika 3b). Nasprotno pa LPS ni uspel sprožiti nadaljnjega vnetnega odziva pri miših GSK3 Ser389 KI (slika 3a, b). Tabela 1 neposredno primerja obseg odzivov LPS med obema genotipoma. Poleg tega je to zdravljenje z LPS povečalo odstotek astrocitov ACSA-2+ pri miših WT, kot je bilo že poročano [31], vendar ne pri miših GSK3 Ser389 KI (slika 3c). Kar zadeva možgansko infiltracijo imunskih celic, je LPS povzročil kopičenje nevtrofilcev pri miših WT, vendar ni imel učinka pri miših GSK3 Ser389 KI (slika 3d). Nazadnje, dajanje LPS ni spodbudilo kopičenja limfocitov v možganih niti pri miših WT niti GSK3 Ser389 KI (slika 3e). Ta opažanja skupaj kažejo, da je inaktivacija GSK3 s fosforilacijo Ser389 bistvena za preprečevanje toničnega vnetnega stanja v možganih, vendar prispeva k akutnemu vnetju možganov kot odziv na dražljaje, kot je LPS.
Tabela 1. Razlike v učinkih LPS med mišmi WT in GSK3 Ser389 KI. Vrednosti predstavljajo število celic po zdravljenju z LPS v vsakem genotipu in so izražene kot povečanje glede na kontrole, zdravljene z vehiklom (povprečje ± SEM). Zvezdice označujejo statistično pomembne razlike med učinki LPS pri živalih WT in GSK3 Ser389 KI. WT, divji tip; KI, GSK3 Ser389 udarec; LPS, lipopolisaharid. *, p < 0.05; **, p < 0,01.
Slika 3. Nevroimunske celice miši GSK3 Ser389 KI se ne odzovejo na LPS. Odraslim mišim WT in GSK3 Ser389 KI smo intraperitonealno injicirali LPS (0,5 mg/kg). Tri dni pozneje so bile možganske populacije (a) CD11b++CD45 visoko aktivirane mikroglije/makrofagov, (b) CD11b+CD45 nizko mirujoče mikroglije, (c) astrocitov ACSA-2+, (d) nevtrofilcev Ly6G+ in ( e) CD11b- limfocite so ocenili s pretočno citometrijo. Histogrami kažejo učinke LPS na število celic pri obeh genotipih. Podatki so predstavljeni kot odstotki celic CD45− (astrocitov) ali celic CD45+ (vse druge populacije), vrednosti pa ustrezajo povprečju ± SEM (n=7–9). Študentov t-test je bil uporabljen za oceno pomembnosti sprememb, ki jih povzroči LPS v vsakem genotipu. ** p < 0.01. WT, divji tip; KI, GSK3 Ser389 udarec; LPS, lipopolisaharid.
Nato smo preučili možen vpliv hipokampalne fosforilacije GSK3 Ser389 na bazalno glialno aktivacijo in glialni odziv na vnetne dražljaje. Za ta namen je bilo označevanje Iba-1 ovrednoteno z mikroskopom v zobatem girusu (slika 4a). Najprej so ocenili WT miši. Mikrografi razkrivajo nizko bazalno glialno aktivacijo, vendar močno povečanje glialne imunoreaktivnosti kot odziv na injekcijo LPS (0,5 mg/kg, 3 dni) (slika 4b). Kvantifikacija integrirane gostote za imunsko barvanje Iba-1 je pokazala vrednosti, ki so bile 53 % višje pri miših WT po zdravljenju (slika 4d). Te spremembe so bile statistično značilne in so skladne z izrazito celično hipertrofijo, ki jo povzroča LPS v mišjem hipokampusu, o kateri so že poročali [43, 44].
Slika 4. Glioza kot odziv na LPS je spremenjena pri miših GSK3 Ser389 KI. Odraslim mišim WT in GSK3 Ser389 KI smo intraperitonealno injicirali LPS ali vehikel (C). Po 3 dneh so bili možgani obdelani za fluorescentno mikroskopijo. (a) Koronalni odsek hipokampusa, prilagojen iz atlasa mišjih možganov [45], kaže na lokalizacijo slik, ki vključujejo dentat gyrus. (b) Odseki možganov so bili imunsko označeni za markerje mikroglije/makrofagov Iba-1. Grafi prikazujejo integrirano gostoto imunoreaktivnosti Iba-1, ki je meritev glialne reaktivnosti, ki odraža tako intenzivnost kot razširjenost glialnega obarvanja. (c) Primerjava kontrolnih živali WT in KI. ( d ) odziv LPS v vsakem genotipu miši. Vse vrednosti so izražene s povečanjem glede na kontrole WT, obdelane z vehiklom (povprečje ± SEM, n=4–5). Uporabljen je bil Studentov t-test. *, p < 0.05. Lestvica, 100 µm. WT, divji tip; KI, GSK3 Ser389 udarec; C, vozilo; LPS, lipopolisaharid.
Analiza hipokampusa miši Ser389 KI je pokazala razlike v bazalni mikroglialni aktivaciji glede na miši WT. Čeprav je torej vizualni pregled mikrografov pokazal zmerno glialno aktivacijo pri mutiranih živalih (slika 4b), so integrirane meritve gostote pokazale, da je bilo povečanje glialne imunoreaktivnosti statistično pomembno (slika 4c). Zanimivo je, da miši Ser389 KI po zdravljenju z LPS niso pokazale nobenih znakov nadaljnje aktivacije (slika 4b), kvantitativna analiza pa je potrdila, da LPS ni mogel povečati imunskega obarvanja Iba-1 v hipokampusu (slika 4d), kar kaže, da je aktivacija glialnih celic z LPS je oslabljen v odsotnosti fosforilacije GSK3 Ser389.
koristi dodatka cistanche—protivnetna
2.5. Periferni imunski odziv na LPS ni bil prizadet pri miših GSK3 Ser389 KI
Naši prejšnji poskusi razkrivajo globoke posledice inaktivacije GSK3 s fosforilacijo Ser389 na odziv možganov na LPS. Nato smo obravnavali, ali so podobni učinki prisotni v sistemski imunosti. Ker je znano, da LPS povzroča aktivacijo prirojenih imunskih celic vranice [46], so bile populacije vraničnih celic miši WT in GSK3 Ser389 KI ocenjene 3 dni po injiciranju LPS (0,5 mg/kg). število nevtrofilcev Ly6G+ (slika 5a) in monocitov/makrofagov CD38++CD11b++Ly6G− (slika 5b) se je znatno povečalo pri miših WT kot odziv na zdravljenje z LPS. Te učinke LPS, pričakovane pri miših WT, so opazili tudi pri miših GSK3 Ser389 KI (slika 5a, b). Tudi pri analizi populacij limfocitov iz vranice niso ugotovili razlik med genotipi, saj je odstotek celic CD4+ vranice (slika 5c) in celic CD8+ (slika 5d) zmanjšal LPS tudi v oba mišja niza (zmanjšanje pri mutantnih miših je bilo statistično značilno samo za celice CD4+); in celice B 220+ LPS ni vplival neodvisno od genotipa (slika 5e). Ta opažanja so v nasprotju z različnimi učinki LPS, ki jih najdemo v možganih obeh genotipov. Medtem ko so miši GSK3 Ser389 KI odporne na nevrovnetje, ki ga sproži LPS, te miši niso sistemsko desenzibilizirane na LPS. Zato se zdi, da so učinki fosforilacije GSK3 Ser389 selektivni za možgane.
Slika 5. Podoben periferni imunski odziv na LPS pri miših GSK3 Ser389 KI in WT. Odrasle miši WT in GSK3 Ser389 KI so bile ip injicirane z LPS. Po 3 dneh smo celice vranice ekstrahirali in obdelali, da smo s pretočno citometrijo ocenili število (a) Ly6G+ nevtrofilcev, (b) CD38+CD11b+ monocitov/makrofagov, (c) CD8+, (d) CD4+ in (e) B220+ celice. Histogrami prikazujejo učinke LPS na število celic, vključno z mišmi WT in KI. Študentov t-test je bil uporabljen za oceno pomembnosti sprememb, ki jih povzroči LPS v vsakem genotipu. Prikazano je povprečje ± SEM (n=5–7). *, p < 0.05; **, p < 0,01. WT, divji tip; KI, GSK3 Ser389 udarec; ip, intraperitonealno; C, vozilo; LPS, lipopolisaharid.
2.6. LPS-inducirana aktivacija poti NF-κB v hipokampusu je odpravljena pri miših GSK3 Ser389 KI
NF-κB je transkripcijski faktor, ki je bistven za LPS, da povzroči vnetje [47]. Poleg tega se je pokazalo, da NF-κB uravnava GSK3 v možganih [2,19,23]. Zato smo preučili aktivacijo NF-κB v možganih kot odziv na LPS z analizo fosforilacije IKK, zgodnjega koraka v poti aktivacije NF-kB. Miši WT in GSK3 Ser389 KI smo ip dajali LPS (0,5 mg/kg) in po 4 urah pobrali hipokampus. Celocelični izvlečki so bili uporabljeni za preučevanje fosfo-IKK / in celotnega IKK / z Western blottingom. Kot je bilo pričakovano, je LPS povečal fosforilacijo IKK v hipokampusu pri miših WT (slika 6a, b). Nasprotno pa LPS ni uspel inducirati fosforilacije IKK pri miših GSK3 Ser389 KI (slika 6a, b). Aktivacija STAT3 je bila povezana tudi z vnetjem, ki ga povzroči LPS [48]. Zato smo preučili fosforilacijo STAT3 z Western blot analizo. V nasprotju z aktivacijo NF-kB je bila fosforilacija STAT3 močno inducirana v hipokampusu miši WT in GSK3 Ser389 KI kot odziv na LPS (slika 6a, c). Tako preprečevanje inaktivacije GSK3 s fosforilacijo Ser389 selektivno poslabša signalizacijo NF-κB, kar je skladno z vlogo GSK3 kot zgornjega regulatorja poti NF-κB v hipokampusu. Ti rezultati kažejo, da pot GSK3 vpliva na nevroinflamacijo z nadzorom ključnih vnetnih mediatorjev, kot je NF-κB.
Slika 6. Nezmožnost inaktivacije GSK3 s fosforilacijo Ser389 različno vpliva na signalizacijo NF-κB in STAT3 pri miših, zdravljenih z LPS. Aktivacijo poti NF-κB in STAT3 so pregledali v lizatih celih celic iz hipokampusa 4 ure po ip injekciji LPS ({{10}},5 mg/kg) ali nosilca (C) v obeh WT in GSK3 Ser389 KI miši. Bloti ponazarjajo Western blot analizo fosforja-IKK / , skupnega IKK / , fosforja-STAT3 in skupnega STAT3. (a) -detekcija tubulina je bila vključena kot kontrola obremenitve. Povezani grafi ustrezajo razmerjem (b) fosfo-IKK / /IKK / in (c) razmerjem fosfo-STAT3/STAT3, dobljenima z denzitometrično analizo pasov Western blot. Studentov t-test je bil uporabljen za primerjavo nezdravljenih kontrol (C) in živali, zdravljenih z LPS, v vsakem genotipu (povprečje ± SEM, n=5–6). *, p < 0.05; ***, p < 0,001. Podatki so reprezentativni za štiri neodvisne poskuse za pIKK/IKK in tri neodvisne poskuse za pSTAT3/STAT3. WT, divji tip; KI, GSK3 Ser389 udarec; ip, intraperitonealno; C, vozilo; LPS, lipopolisaharid.
3. Razprava
V možganih je disregulacija aktivnosti GSK3 povezana z več nevropatologijami, pri katerih je kronično vnetje pogost znak [25]. Ker obsežna literatura podpira, da inhibicija GSK3 s fosforilacijo Ser9 poveča protivnetne mediatorje in zniža provnetne citokine [23,28,30], je mehanizem, ki se običajno predlaga za razlago okvarjene inaktivacije GSK3 pri nevroinflamatornih patologijah, neuspeh pri fosforilaciji Ser9 [3]. Vendar so bile v možganih odkrite nenavadno visoke ravni fosfo-Ser389 GSK3 [4], kar kaže na to, da lahko ta alternativna pot za inaktivacijo GSK3 prav tako igra vidno vlogo v možganih. Tukaj predstavljeni poskusi razkrivajo vpliv fosforilacije GSK3 Ser389 na nevrovnetje, kar dopolnjuje prejšnje dokaze, ki kažejo na vpletenost te poti v popravljanje možganske DNK in preživetje nevronov [6,7]. Ena od ključnih ugotovitev v tem delu je, da možgani miši GSK3 Ser389 KI kažejo trajno gliozo in povečano infiltracijo imunskih celic, kar je skladno z idejo, da preprečevanje inaktivacije GSK3 s fosforilacijo Ser389 vodi do nevroinflamacije. Podatki iz naših eksperimentov s pretočno citometrijo jasno kažejo na povečano nevroinflamacijo pri teh živalih, saj je bilo število aktiviranih mikroglije/makrofagov, astrocitov ACSA 2+ in infiltriranih nevtrofilcev v možganih miši Ser389 GSK3 KI znatno večje. Kljub temu, da je mikroastroglioza jasno opažena s pretočno citometrijo, je analiza mikrografov hipokampusa iz možganskih odsekov miši Ser389 GSK3 KI pokazala, da je bila hipertrofija mikroglije/makrofagov le blaga. Podobne rezultate so opazili, ko so analizirali druga področja možganov, da bi ocenili obseg in intenzivnost glioze (ni prikazano). Zato sklepamo, da v odsotnosti pro-vnetnih dražljajev pomanjkanje fosforilacije GSK3 Ser389 vodi do stopnje nevrovnetja, ki bi ga bilo treba razvrstiti kot nizko stopnjo. Številne študije podpirajo povezavo med hiperaktivnostjo GSK3 in nevrodegeneracijo pri nevroloških motnjah [25]. V tem kontekstu bi lahko bil vnetni odziv, ki smo ga opazili pri miših Ser389 GSK3 KI, posledica nevrodegeneracije, saj so prejšnje študije odkrile smrt nevronov v skorji in hipokampusu teh živali [6]. To je v skladu z ugotovitvijo, da poškodba DNK inaktivira GSK3 prek fosforilacije Ser389 kot mehanizma za preprečevanje celične smrti in spodbuja popravilo DSB [7,8]. Posledično možgani miši KI, pri katerih je fosforilacija Ser389 preprečena, niso zaščiteni pred nevronsko smrtjo, ki jo povzroči DSB. Povezava med izražanjem fosforja-Ser389 GSK3 in celičnim preživetjem je bila prvič predlagana v limfocitih kot mehanizem, vpleten v adaptivni imunski odziv. Tako je bilo ugotovljeno, da odsotnost fosforilacije GSK3 Ser389 pri miših KI inducira nekroptozo v celicah B med poznim zorenjem, kar je zelo vnetna vrsta celične smrti, povezana z več patologijami [9]. Zanimivo je tudi omeniti, da se lahko sproži ne samo fosforilacija Ser389, ampak tudi fosforilacija Ser9, da inaktivira GSK3 kot odgovor na poškodbo DNA. Vendar pa imajo miši Ser389 GSK3 KI nevrodegenerativni fenotip [6], ki ni prisoten pri miših Ser9 GSK3 KI [49, 50], kar kaže, da ima fosforilacija Ser389 specifične vloge pri nadzoru aktivnosti GSK3 in da obstajajo scenariji, v katerih fosforilacija Ser9 ne more kompenzirati za izgubo fosforilacije Ser389. V skladu s tem je treba nadalje raziskati zanimivo povezavo med deregulacijo Ser389 GSK3, nevrovnetjem in nevrodegeneracijo, ki je predstavljena tukaj, da bi pojasnili, ali je spremenjena fosforilacija GSK3 na Ser389 lahko ključni dejavnik pri nevropatologijah, pri katerih je značilno kronično vnetje, kot je Alzheimerjeva bolezen. Poleg tega je blaga, a vztrajna aktivacija nevroimunskih celic, opažena pri miših GSK3 Ser389 KI, skladna s hipotezo, da je neuspeh pri fosforiliranju Ser389 lahko povezan z imunosescenco. To je s starostjo povezan proces, za katerega je značilen upad imunskih funkcij skupaj s povečanim izražanjem vnetnih mediatorjev; kar vodi v kronično vnetje nizke stopnje [1,51]. Več avtorjev je opozorilo na vpletenost deregulacije GSK3 v vnetje, povezano s starostjo [1, 52]. Predlagano je bilo tudi, da lahko nenormalno delovanje mikroglije, opaženo v kontekstu možganske imunosescence, sčasoma povzroči nevrodegeneracijo [53]. Tako bi lahko pospešena imunosescenca pri miših Ser389 GSK3 KI prispevala k izgubi nevronov, o kateri so prej poročali pri teh živalih [6]. LPS se je v veliki meri uporabljal za induciranje vnetja v modelih "in vivo" in "in vitro". Vendar pa obstajajo dokazi, da aplicirani odmerek LPS v veliki meri določa vrsto povzročenega vnetnega odziva [54–56]. Visoki odmerki LPS povzročijo septičnemu šoku podobne odzive; medtem ko zmerni odmerki LPS sprožijo vztrajno vnetje nizke stopnje, ki je bližje tistemu, ki ga opazimo pri številnih kroničnih boleznih [42]. V tem kontekstu je pomembno poudariti, da je odmerek LPS, izbran za naše poskuse (0,5 mg/kg, ip), zmeren in daleč od LD50, poročanega za LPS pri miših (10–25 mg/kg) [57,58]. ]. V skladu s prejšnjimi poročili [40, 59] smo ugotovili, da tak odmerek LPS ni smrtonosen in zadostuje za povečanje glioze in možganske infiltracije nevtrofilcev pri živalih WT, medtem ko infiltracija limfocitov ni prizadeta. Zanimivo je, da je bil tak zmeren (vendar pomemben) odziv LPS odpravljen v možganih miši KI z oslabljeno inaktivacijo GSK3 s fosforilacijo Ser389. Glede na to opazovanje lahko razširjena hiperaktivacija GSK3 v možganih sčasoma zmanjša občutljivost na pro-vnetne insulte. Omeniti velja, da je okvarjen odziv na LPS pri mutiranih miših združljiv z mehanizmom imunotolerance ali odpornosti, pogostim procesom v CŽS, katerega cilj je zmanjšati aktivacijo glialnih celic in omejiti poškodbe možganov zaradi prekomernega vnetja [60,61]. V skladu s to zamislijo je prejšnja študija pokazala, da lahko aktivacija GSK3 pri miših inducira imunotoleranco in zavre odzive LPS [62].
Prednosti cistanche tubulosa- okrepiti imunski sistem
Zanimivo je tudi upoštevati, da učinki na možgane, opisani v tej študiji, kažejo visoko specifičnost. Tako je v nasprotju z možgani večina populacij vraničnih celic, ocenjenih pri živalih WT in Ser389 GSK3 KI, predstavila enak profil v nestimuliranih pogojih, pa tudi podoben odziv na LPS. To nakazuje, da ima pot inaktivacije GSK3, ki je odvisna od fosforilacije Ser389, posebne vloge pri regulaciji nevroinflamacije. V skladu s to hipotezo možganske celice kažejo visoko ekspresijo fosfo-Ser389 GSK3 v primerjavi z drugimi tkivi in ta ekspresija je med razvojem možganov strogo regulirana [5]. Nazadnje, po naših ugotovitvah je regulacija GSK3 s fosforilacijo na Ser389 posebej posredovana s signalno potjo NF-kB, saj aktivacija STAT3 ni bila prizadeta v Ser389 GSK3 KI. Številne nižje vnetne mediatorje uravnava aktivacija NF-kB, vključno s citokini, receptorji, transkripcijskimi faktorji in encimi. Prepoznavanje, na katere od teh tarč NF-kB vpliva fosforilacija Ser389 GSK3, je izven obsega našega dela, vendar bo to vznemirljiv cilj za prihodnje študije, katerih cilj je razjasniti mehanizme nevroinflamacije.
4. Materiali in metode
4.1. Živali
C57BL/6J miši divjega tipa (WT) so bile kupljene pri Jackson Laboratories. C57BL/6 GSK3 Ser389 KI miši, pri katerih je bil Ser389 ostanek GSK3 nadomeščen z Ala, da se prepreči fosforilacija, so bile ustvarjene, kot je opisano prej [8]. Vse miši so bile nameščene v objektu za živali, povezanem z Medicinsko šolo Albacete, v 12-ciklu svetlo/tema. Hrana in voda sta bili zagotovljeni ad libitum. Za poskuse so uporabili štiri do šest mesecev stare odrasle miši.
4.2. Uprava LPS
Da bi sprožili vnetni odziv, so miši prejele eno intraperitonealno (ip) injekcijo {{0}}.5 mg/kg LPS. Salmonella enterica LPS (serotip typhimurium, L7261 Sigma Aldrich, Madrid, Španija) smo raztopili v sterilni 0.9% fiziološki raztopini brez endotoksina pri 10 mg/mL. Tri dni po zdravljenju so miši evtanazirali, možgane in vranico pa odstranili za imunohistokemijo ali analizo pretočne citometrije glialnih celic in infiltriranih imunskih celic. Za Western blotting analizo so bile živali evtanazirane 4 ure po ip injekciji 0,5 mg/kg LPS, saj so prej poročali, da LPS povečuje vnetne proteine v možganih miši in podgan 2–4 ure po ip dajanju [63,64].
4.3. Pretočna citometrija
Za analizo možganskega tkiva in celic vranice s pretočno citometrijo so živali anestezirali z ip injekcijo tribromoetanola, ki je bil priporočen za študije akutnega terminala. Uporabljen nizek odmerek tribromoetanola (200 mg/kg) zagotavlja lahkotno anestezijo brez resnih neželenih učinkov ali vpliva na izražanje vnetnih citokinov [65]. Postopki na živalih so bili izvedeni po preverjanju odsotnosti refleksov.
4.3.1. Disociacija možganskega tkiva in Percollova gradientna izolacija živčnih celic
Miši smo pred zbiranjem tkiva intrakardialno perfundirali s 50 ml 0,9 % NaCl, da bi odstranili krožeče celice iz možganskih krvnih žil. Po perfuziji so možgane odstranili, možganske ovojnice in horoidni pleksus skrbno ločili, male možgane in vohalne čebulice pa zavrgli. Preostalo tkivo smo dali v hladno Hankovo uravnoteženo raztopino soli, ki ne vsebuje kalcijevega klorida in magnezijevega klorida (HBSS [-]CaCl2/[-]MgCl2: Gibco, Madrid, Španija, 14175). Vzorce tkiv so nato pred prebavo na drobno sesekljali s skalpelom. Narezano tkivo smo nato dali v epruvete MACS C (Miltenyi Biotec, Pozuelo de Alarcón, Španija, 130-093-237) v skupni prostornini 5 ml in obdelali z mehanskim disociatorjem pri 6 obratih na minuto 30 minut. Encimsko disociacijo smo izvedli po lastnem protokolu [31] z uporabo papaina (100 U; Worthington, LK003178) in dispaze II (6 U; Sigma-Aldrich, Madrid, Španija, D4963) v Earlovi uravnoteženi raztopini soli (EBSS [+]CaCl2 /[+]MgSO4; Gibco, Madrid, Španija, 24010). Raztopini smo dodali DNAse I (100 U; Sigma-Aldrich, Madrid, Španija, DN25), da odstranimo sluz DNA, ki negativno vpliva na sposobnost preživetja celic [66]. Pred uporabo smo papain aktivirali 30 minut pri 37 ◦C v 5 % CO2. Da bi zaustavili prebavo, smo vzorce razredčili s hladnim HBSS in položili na led. To raztopino smo nato 10-krat pipetirali s 5 ml pipetami in filtrirali skozi celično cedilo 70 µm (BD, 352350). Nastalo enocelično suspenzijo centrifugiramo pri 300 × g 10 minut pri sobni temperaturi. 30-odstotni gradient PercollTM (GE Healthcare, Madrid, Španija, 17-0891-01) je bil uporabljen za odstranitev mielina in obogatitev homogenata v žive celice glije. V ta namen smo pripravili osnovno raztopino izotoničnega Percolla (SIP) (9:1 Percoll v 10 × HBSS [-]CaCl2/[-]MgCl2; Gibco, 14185) in celične pelete resuspendirali v 30 % (v/v). v) SIP (v 1× HBSS). 30-odstotni Percollov gradient smo izvedli z dodajanjem 3 mL SIP k 7 mL 1 × HBSS, ki vsebuje celično suspenzijo v 14 mL polipropilenski epruveti. Vsak gradient je bil centrifugiran brez zavore pri 300 × g 30 minut pri 18 ◦C. Po centrifugiranju smo celice iz spodnje plasti zbrali, sprali z 1 × HBSS, centrifugirali 10 minut pri 300 × g in resuspendirali v 10 ml 1 × pufra za lizo rdečih krvnih celic pri 4 °C. Po lizi smo celično suspenzijo centrifugirali pri 300 × g 10 minut in nastalo celično peleto končno resuspendirali v 50 µL blokirnega pufra pred barvanjem za pretočno citometrijo.
4.3.2. Disociacija vraničnih celic
Vranice smo položili na petrijevko, ki je vsebovala RPMI 1640, in jih narezali na majhne koščke. Nastalo tkivo smo prenesli v 70 µm celično cedilo (BD, 352350) in ga s krožnimi gibi razdrobili z rebrastim vrhom bata brizge. RPMI 1640 smo nato spustili skozi cedilo. Razpadlo tkivo smo prenesli v 50 ml epruvete (Sarstedt, Barcelona, Španija, 62.547.254) in centrifugirali pri 100 g 10 minut. Supernatant, ki je vseboval celično suspenzijo, smo nato zbrali in ponovno centrifugirali pri 300 g 10 minut. Nastali supernatant smo odstranili in pelet resuspendirali v 10 ml fiziološke raztopine s fosfatnim pufrom (PBS) z 1% FBS, da smo prešteli število celic pod mikroskopom, nato pa ponovno centrifugirali pri 300 g 5 minut. Uporabljenih je bilo samo 500000 celic na vzorec. Vsak vzorec smo nato resuspendirali v 50 µL pufra za blokiranje pred barvanjem za pretočno citometrijo.
4.3.3. Barvanje z zunajcelično pretočno citometrijo
Tabela 2. Protitelesa in reagenti, uporabljeni za analizo s pretočno citometrijo.
4.4. Imunohistokemija
Miši so bile globoko anestezirane in intrakardialno perfundirane s fiziološko raztopino {{0}}.9 % (w/v). Njihove možgane so zbrali in 24 ur fiksirali s 4% paraformaldehidom. Po naknadni fiksaciji so bili kriozaščiteni s 30% saharozo in zamrznjeni pri –20 ◦C do reza. Tkivne odseke (20 µm) smo izrezali s kriostatom (ThermoFisher, Microm™ HM550), odmrznili na objektna stekelca Superfrost Plus (ThermoFisher, J1800AMNZ) in nazadnje shranili pri –20 ◦C do obarvanja. Imunohistokemično obarvanje delov tkiva je bilo izvedeno, kot je opisano prej [67]. Primarne in sekundarne raztopine protiteles smo razredčili v 1 × PBS z 1 % BSA. Odseke smo inkubirali s primarnim protitelesom proti kuncu Iba-1 (razredčitev 1:500; Wako Chemicals, Barcelona, Španija, 019-19741). Alexa Fluor 488-konjugirani kozji anti-kunčji IgG (razredčitev 1:2000; ThermoFisher, Madrid, Španija, A11031) je bil uporabljen kot sekundarno protitelo. Vključeno je bilo ustrezno pozitivno kontrolno tkivo, pa tudi primarne in sekundarne negativne kontrole. Fluorescentne slike za označevanje so bile pridobljene z uporabo ZEISS Apotome. 2 mikroskop z mono digitalno kamero axiom 503 in nadzorno programsko opremo Zen Blue različice 2.3 (Carl Zeiss). Za vizualizacijo hipokampusa je bil uporabljen 10× objektiv (Plan-APOCHROMAT, V10×, NA 0,45, AIR). Integrirana gostota znotraj interesnih regij je bila izračunana s programsko opremo ImageJ. Ta parameter ustreza vsoti vrednosti intenzivnosti za vsako slikovno piko v izbranem območju. Zato se uporablja za kvantificiranje števila obarvanih celic v kombinaciji z intenzivnostjo obarvanja vsake celice.
cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema
4.5. Western blot analiza
Možgane miši so hitro odstranili, hipokampuse pa takoj razrezali in zamrznili. Tkivo smo pripravili z uporabo hipertoničnega liznega pufra, ki je vseboval zaviralce proteaze, kot je opisano prej [68]. Primarna uporabljena protitelesa so bila anti-kunčji fosfor-IKK / (razredčenje 1:1000; Cell Signaling, Alcobendas, Španija, 2861), anti-kunčje IKK / (razredčenje 1:1000; Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Nemčija, sc{{ 9}}), anti-kunčji fosfor-STAT3 (razredčitev 1:1000; Cell Signaling, 9145) in anti-mišji STAT3 (razredčitev 1:1000; Santa Cruz Biotechnology, sc-8019). Protimišji -tubulin (razredčitev 1:2000; Santa Cruz Biotechnology, sc-32293) je bil uporabljen kot kontrola obremenitve. Kot sekundarna protitelesa so bila uporabljena anti-kunčja HRP (razredčitev 1:5000; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Baltimore, ZDA, 111-035-144) in anti-mišja HRP (razredčina 1:5000; Jackson ImmunoResearch Laboratories, 115-035-003). . Kvantifikacija proteinskih pasov je bila izvedena z analizo pasovne denzitometrije s programsko opremo NIH ImageJ (različica 1.50i, https://imagej.nih.gov/ij/, dostopno 1. marca 2022). Da bi zagotovili enake obremenitve, je bila integrirana gostota, dobljena za vsak pas, izražena kot relativna vrednost glede na ustrezno kontrolo gospodinjske obremenitve.
4.6. Statistična analiza
Rezultati so bili statistično analizirani s programsko opremo GraphPad Prism (San Diego, CA, ZDA). Podatki so predstavljeni kot povprečje ± standardna napaka povprečja (SEM) običajno štirih neodvisnih poskusov (n {{0}}–9). Po potrditvi normalne porazdelitve podatkov s Shapiro-Wilkovim testom je bila statistična značilnost med obema skupinama določena s Studentovim t-testom za parametrične podatke. Razlike so veljale za statistično pomembne, ko so bile vrednosti verjetnosti (p) manjše od 0.05 (*), 0,01 (**) ali 0,001 (***). Slike prikazujejo reprezentativne poskuse.
5. Sklepi
Če povzamemo, naše ugotovitve kažejo, da neuspeh pri inaktivaciji GSK3 s fosforilacijo Ser389 vodi do kroničnega vnetja in tolerance na endotoksin in da ima inhibicija GSK3 s fosforilacijo Ser9 in Ser389 komplementarno in ne odvečno vlogo pri nevroimunskem odzivu. Zato je treba raziskati specifične posledice fosforilacije GSK3 Ser389 za nevropatologijo in staranje možganov.
Reference
1. Souder, DC; Anderson, RM Razširjeno omrežje GSK3: posledice za raziskave staranja. Geroscience 2019, 41, 369–382. [CrossRef] [PubMed]
2. Hoeflich, KP; Luo, J.; Rubie, EA; Tsao, M.; Jin, O.; Woodgett, JR Zahteva za kinazo glikogen sintaze-3 pri preživetju celic in aktivaciji NF-κB. Nature 2000, 406, 86–90. [CrossRef] [PubMed]
3. Jope, RS; Johnson, GV Glamur in mračnost glikogen sintaze kinaze-3. Trends Biochem. Sci. 2004, 29, 95–102. [CrossRef]
4. Thornton, TM; Pedraza-Alva, G.; Deng, B.; Les, CD; Aronštam, A.; Clements, JL; Sabio, G.; Davis, RJ; Matthews, DE; Doble, B.; et al. Fosforilacija s p38 MAPK kot alternativna pot za inaktivacijo GSK3beta. Znanost 2008, 320, 667–670. [CrossRef]
5. Calvo, B.; Thornton, TM; Rincon, M.; Tranque, P.; Fernandez, M. Regulacija GSK3 s fosforilacijo Ser 389 med nevronskim razvojem. Mol. Neurobiol. 2020, 58, 809–820. [CrossRef] [PubMed]
6. Thornton, TM; Hare, B.; Colié, S.; Pendlebury, WW; Nebreda, AR; Falls, W.; Jaworski, DM; Rincon, M. Nezmožnost inaktivacije jedrskega GSK3 s fosforilacijo Ser 389- vodi do žariščne nevronske smrti in podaljšanega odziva na strah. Nevropsihofarmakologija 2018, 43, 393–405. [CrossRef] [PubMed]
7. Hare, BD; Thornton, TM; Rincon, M.; Golijanin, B.; Kralj, SB; Jaworski, DM; Falls, WA Dva tedna spremenljivega stresa poveča nivoje gama-H2AX v jedru mišje posteljice stria terminalis. Nevroznanost 2018, 373, 137–144. [CrossRef]
8. Thornton, TM; Delgado, P.; Chen, L.; Salas, B.; Kremencov, D.; Fernandez, M.; Vernia, S.; Davis, RJ; Heimann, R.; Teuscher, C.; et al. Inaktivacija jedrnega GSK3beta s fosforilacijo Ser (389) spodbuja sposobnost limfocitov med odzivom na prekinitev dvojne verige DNA. Nat. Komun. 2016, 7, 10553. [CrossRef]
9. Pasparakis, M.; Vandenabeele, P. Nekroptoza in njena vloga pri vnetju. Narava 2015, 517, 311–320. [CrossRef]
10. Jope, RS; Cheng, Y.; Lowell, JA; Worthen, RJ; Sitbon, YH; Beurel, E. V stresu in vnetju, ali je mogoče kriviti GSK3? Trends Biochem. Sci. 2017, 42, 180–192. [CrossRef]
11. Beutler, B.; Rietschel, ET Prirojeno imunsko zaznavanje in njegove korenine: zgodba o endotoksinu. Nat. Rev. Immunol. 2003, 3, 169–176. [CrossRef] [PubMed]
12. Morris, MC; Gilliam, EA; Button, J.; Li, L. Dinamična modulacija prirojenega imunskega odziva z različnimi odmerki lipopolisaharida (LPS) v človeških monocitnih celicah. J. Biol. Chem. 2014, 289, 21584–21590. [CrossRef]
13. Lu, YC; Ja, WC; Ohashi, PS Pot prenosa signala LPS/TLR4. Cytokine 2008, 42, 145–151. [CrossRef] [PubMed]
14. Ko, R.; Jang, HD; Lee, SY Peptid inhibitorja GSK3 ščiti miši pred endotoksinskim šokom, ki ga povzroči LPS. Imunska mreža 2010, 10, 99. [CrossRef] [PubMed]
15. Piazzi, M.; Bavelloni, A.; Cenni, V.; Faenza, I.; Blalock, WL Ponovno pregledovanje vloge GSK3, modulatorja prirojene imunosti, pri idiopatskem inkluzijskem miozitisu. Celice 2021, 10, 3255. [CrossRef] [PubMed]
16. Vines, A.; Cahoon, S.; Goldberg, I.; Saxena, U.; Pillarisetti, S. Nova protivnetna vloga glikogen sintaze kinaze-3beta pri zaviranju ekspresije vnetnega gena, ki jo povzroča faktor tumorske nekroze alfa in interlevkin-1beta. J. Biol. Chem. 2006, 281, 16985–16990. [CrossRef]
17. Hoffmeister, L.; Diekmann, M.; Brand, K.; Huber, R. GSK3: Spodbujanje uravnoteženja kinaze in razrešitev vnetja. Celice 2020, 9, 820. [CrossRef]
18. Beurel, E.; Jope, RS Z lipopolisaharidom povzročeno proizvodnjo interlevkina-6 nadzirata glikogen sintaza kinaza-3 in STAT3 v možganih. J. Neuroinflamm. 2009, 6, 9. [CrossRef]
19. Wang, M.; Huang, H.; Chen, W.; Chang, H.; Kuo, J. Inaktivacija glikogen sintaze kinaze-3 zavira nastajanje faktorja tumorske nekroze v mikrogliji z modulacijo signalnih kaskad jedrskega faktorja κB in MLK3/JNK. J. Neuroinflamm. 2010, 7, 99. [CrossRef]
20. Priego, N.; Valiente, M. Potencial astrocitov kot imunskih modulatorjev pri možganskih tumorjih. Spredaj. Immunol. 2019, 10, 1314. [CrossRef]
21. Vandenbark, AA; Offner, H.; Matejuk, S.; Matejuk, A. Vpletenost mikroglije in astrocitov v nevrodegeneracijo in možganski rak. J. Neuroinflamm. 2021, 18, 298. [CrossRef] [PubMed]
22. Lucas, JJ; Hernandez, F.; Gomez-Ramos, P.; Moran, MA; Hen, R.; Avila, J. Zmanjšan jedrski beta-katenin, tau hiperfosforilacija in nevrodegeneracija pri pogojnih transgenih miših GSK-3beta. EMBO J. 2001, 20, 27–39. [CrossRef] [PubMed]
23. Jorge-Torres, OC; Szczesna, K.; Roa, L.; Casal, C.; Gonzalez-Somermeyer, L.; Soler, M.; Velasco, CD; Martinez-San Segundo, P.; Petazzi, P.; Saez, MA; et al. Inhibicija Gsk3b zmanjša signalizacijo Nfkb1 in reši sinaptično aktivnost za izboljšanje fenotipa Rettovega sindroma pri miših z izločitvijo Mecp2-. Celica. Rep. 2018, 23, 1665–1677. [CrossRef] [PubMed]
24. Martin, M.; Rehani, K.; Jope, RS; Michalek, SM Toll-podobna receptorska proizvodnja citokinov je različno regulirana s kinazo glikogen sintaze. Nat. Immunol. 2005, 6, 777–784. [CrossRef]
25. Rippin, I.; Eldar-Finkelman, H. Mehanizmi in terapevtske posledice GSK-3 pri zdravljenju nevrodegeneracije. Celice 2021, 10, 262. [CrossRef]
26. Androulidaki, A.; Iliopoulos, D.; Arranz, A.; Doksaki, C.; Schworer, S.; Zacharioudaki, V.; Margioris, AN; Tsichlis, PN; Tsatsanis, C. Kinaza Akt1 nadzoruje odziv makrofagov na lipopolisaharid z uravnavanjem mikroRNA. Imuniteta 2009, 31, 220–231. [CrossRef]
27. Fichtner-Feigl, S.; Kesselring, R.; Martin, M.; Obermeier, F.; Ruemmele, P.; Kitani, A.; Brunner, SM; Haimerl, M.; Geissler, EK; Strober, W. IL-13 orkestrira razrešitev kroničnega vnetja črevesja s fosforilacijo glikogen sintaze kinaze-3. J. Immunol. 2014, 192, 3969–3980. [CrossRef]
28. Nagao, M.; Hayashi, H. Glikogen sintaza kinaza-3beta je povezana s Parkinsonovo boleznijo. Neurosci. Lett. 2009, 449, 103–107. [CrossRef]
29. Nadri, C.; Kozlovsky, N.; Agam, G.; Bersudsky, Y. Parametri GSK-3 v limfocitih bolnikov s shizofrenijo. Psychiatry Res. 2002, 112, 51–57. [CrossRef]
30. Jope, RS; Yuskaitis, CJ; Beurel, E. Glikogen sintaza kinaza-3 (GSK3): Vnetje, bolezni in terapevtiki. Neurochem. Res. 2007, 32, 577–595. [CrossRef]
31. Calvo, B.; Rubio, F.; Fernández, M.; Tranque, P. Disociacija možganov novorojenčkov in odraslih miši za hkratno analizo mikroglije, astrocitov in infiltriranih limfocitov s pretočno citometrijo. IBRO Rep. 2020, 8, 36–47. [CrossRef] [PubMed]
32. Legroux, L.; Pittet, CL; Beauseigle, D.; Deblois, G.; Prat, A.; Arbour, N. Optimizirana metoda za obdelavo CNS miši za hkratno analizo živčnih celic in levkocitov s pretočno citometrijo. J. Neurosci. Metode 2015, 247, 23–31. [CrossRef] [PubMed]
33. Batiuk, MY; de Vin, F.; Duque, SI; Li, C.; Saito, T.; Saido, T.; Fiers, M.; Belgard, TG; Holt, MG Imunoafinitetna metoda za izolacijo ultračistih odraslih astrocitov, ki temelji na ciljanju ATP1B2 s protitelesom ACSA-2. J. Biol. Chem. 2017, 292, 8874–8891. [CrossRef] [PubMed]
34. Stevens, SL; Bao, J.; Hollis, J.; Lessov, NS; Clark, WM; Stenzel-Poore, MP Uporaba pretočne citometrije za oceno časovnih sprememb v vnetnih celicah po žariščni možganski ishemiji pri miših. Brain Res. 2002, 932, 110–119. [CrossRef] [PubMed]
35. Kantzer, CG; Butin, C.; Herzig, ID; Wittwer, C.; Reiss, S.; Tiveron, MC; Drewes, J.; Rockel, TD; Ohlig, S.; Ninkovič, J.; et al. Anti-ACSA-2 opredeljuje novo monoklonsko protitelo za prospektivno izolacijo živih neonatalnih in odraslih astrocitov. Glia 2017, 65, 990–1004. [CrossRef]
36. Moreno-García, Á.; Bernal-Chico, A.; Colomer, T.; Rodríguez-Antigüedad, A.; Matute, C.; Mato, S. Analiza genske ekspresije endokanabinoidnega signaliziranja astrocitov in mikroglije med avtoimunsko demielinizacijo. Biomolecules 2020, 10, 1228. [CrossRef] [PubMed]
37. Deniset, JF; Surewaard, BG; Lee, W.; Kubes, P. Splenic Ly6Ghigh zreli in Ly6Gint nezreli nevtrofilci prispevajo k izkoreninjenju S. pneumoniae. J. Exp. med. 2017, 214, 1333–1350. [CrossRef]
38. Ng, HHM; Lee, RY; Goh, S.; Tay, ISY; Lim, X.; Lee, B.; Žvečka, V.; Li, H.; Tan, B.; Lim, S.; et al. Imunohistokemično točkovanje CD38 v mikrookolju tumorja napoveduje odzivnost na imunoterapijo proti PD-1/PD-L1 pri hepatocelularnem karcinomu. J. Immunother. Rak 2020, 8, e000987. [CrossRef]
39. Okuyama, S.; Makihata, N.; Jošimura, M.; Asakura, Y.; Yoshida, T.; Nakajima, M.; Furukawa, Y. Oenothein B zavira vnetje, ki ga povzroča lipopolisaharid (LPS), v mišjih možganih. Int. J. Mol. Sci. 2013, 14, 9767–9778. [CrossRef]
40. Carnevale, D.; Mascio, G.; Ajmone-Cat, MA; D'Andrea, I.; Cifelli, G.; Madona, M.; Cocozza, G.; Frati, A.; Carullo, P.; Carnevale, L.; et al. Vloga nevroinflamacije pri amiloidni patologiji možganov, ki jo povzroča hipertenzija. Neurobiol. Staranje 2012, 33, e19–e205. [CrossRef]
41. Zhang, J.; Xue, B.; Jing, B.; Tian, H.; Zhang, N.; Li, M.; Lu, L.; Chen, L.; Diao, H.; Chen, Y. LPS aktivira nevroinflamatorne poti za induciranje depresije pri Parkinsonovi bolezni podobnih boleznih. Spredaj. Pharmacol. 2022, 13, 961817. [CrossRef] [PubMed] 4
2. Tarr, AJ; Chen, Q.; Wang, Y.; Sheridan, JF; Quan, N. Nevralni in vedenjski odzivi na vnetje nizke stopnje. Obnašaj se. Brain Res. 2012, 235, 334–341. [CrossRef] [PubMed]
43. Kang, J.; Park, D.; Šah, M.; Kim, M.; Koh, P. Lipopolisaharid inducira aktivacijo nevroglije in aktivacijo NF-κB v možganski skorji odraslih miši. Lab. Anim. Res. 2019, 35, 19. [CrossRef]
44. Khan, MS; Ali, T.; Abid, MN; Jo, MH; Khan, A.; Kim, MW; Yoon, GH; Cheon, EW; Rehman, SU; Kim, MO Litij izboljša nevrotoksičnost, ki jo povzročajo lipopolisaharidi, v skorji in hipokampusu možganov odrasle podgane. Neurochem. Int. 2017, 108, 343–354. [CrossRef] [PubMed]
45. Paxinos, G.; Franklin, KB Mišji možgani v stereotaksičnih koordinatah. 2001. Na voljo na spletu: https://books.google.es/books/ about/The_Mouse_Brain_in_Stereotaxic_Coordinat .html?id=tZdjQgAACAAJ&redir_esc=y (dostopano 1. marca 2022).
46. Bronte, V.; Pittet, MJ Vranica v lokalni in sistemski regulaciji imunosti. Imuniteta 2013, 39, 806–818. [CrossRef]
47. Liu, T.; Zhang, L.; Joo, D.; Sun, S. NF-κB signalizacija pri vnetju. Transdukt signala. Tarča. Ther. 2017, 2, 17023. [CrossRef] [PubMed]
48. Balič, JJ; Albargy, H.; Luu, K.; Kirby, FJ; Jayasekara, WSN; Mansell, F.; Garama, DJ; De Nardo, D.; Baščuk, N.; Louis, C. Fosforilacija serina STAT3 je potrebna za presnovno reprogramiranje TLR4 in izražanje IL-1. Nat. Komun. 2020, 11, 3816. [CrossRef]
49. Hongisto, V.; Vainio, JC; Thompson, R.; Courtney, MJ; Coffey, ET Skupina Wnt glikogen sintaze kinaze 3beta je kritična za nevronsko smrt, ki jo povzroča trofična deprivacija. Mol. Celica. Biol. 2008, 28, 1515–1527. [CrossRef]
50. Eom, T.; Jope, RS Blokirana zaviralna serinska fosforilacija glikogen sintaze kinaze-3 / poslabša proliferacijo nevronskih prekurzorskih celic in vivo. Biol. Psihiatrija 2009, 66, 494–502. [CrossRef] 5
1. Franceschi, C.; Campisi, J. Kronično vnetje (vnetje) in njegov potencialni prispevek k boleznim, povezanim s starostjo. J. Gerontol. Ser. Biomed. Sci. med. Sci. 2014, 69, S4–S9. [CrossRef]
52. Enioutina, EY; Bareyan, D.; Daynes, RA Vloga nezrelih mieloidnih celic pri imunskem staranju. J. Immunol. 2011, 186, 697–707. [CrossRef] [PubMed]
53. Tang, Y.; Le, W. Diferencialne vloge mikroglije M1 in M2 pri nevrodegenerativnih boleznih. Mol. Neurobiol. 2016, 53, 1181–1194. [CrossRef] [PubMed]
54. Hoogland, IC; Houbolt, C.; van Westerloo, DJ; van Gool, WA; van de Beek, D. Sistemsko vnetje in mikroglialna aktivacija: Sistematični pregled poskusov na živalih. J. Neuroinflamm. 2015, 12, 114. [CrossRef] [PubMed]
55. Furube, E.; Kawai, S.; Inagaki, H.; Takagi, S.; Miyata, S. Heterogenost, odvisna od regije možganov, in razlika, odvisna od odmerka, v prehodnem povečanju populacije mikroglije med vnetjem, ki ga povzroči lipopolisaharid. Sci. Rep. 2018, 8, 2203. [CrossRef]
56. Brandi, E.; Torres-Garcia, L.; Svanbergsson, A.; Haikal, C.; Liu, D.; Li, W.; Li, J. Mikroglialna in astrocitna aktivacija, specifična za možgansko regijo, kot odziv na sistemsko izpostavljenost lipopolisaharidom. Spredaj. Starajoči se nevroki. 2022, 14, 910988. [CrossRef]
57. Radulović, K.; Mak'Anyengo, R.; Kaja, B.; Steinert, A.; Niess, JH Injekcije lipopolisaharida v miši za posnemanje vnosa produktov, pridobljenih iz mikrobov, po preboju črevesne pregrade. J. Vis. Exp. 2018, 135, e57610. [CrossRef]
58. Fink, MP Živalski modeli sepse. Virulence 2014, 5, 143–153. [CrossRef]
59. Zhou, H.; Andonegui, G.; Wong, CH; Kubes, P. Vloga endotelijskega TLR4 za rekrutacijo nevtrofilcev v mikrožile centralnega živčnega sistema pri sistemskem vnetju. J. Immunol. 2009, 183, 5244–5250. [CrossRef]
60. Beurel, E. HDAC6 uravnava LPS-toleranco v astrocitih. PLoS ONE 2011, 6, e25804. [CrossRef]
61. Yao, L.; Li, P.; Chen, Q.; Hu, A.; Wu, Y.; Li, B. Zaščitni učinki tolerance na endotoksin na periferno nevroinflamacijo, ki jo povzroči lipopolisaharid, in dopaminergično nevronsko poškodbo. Imunofarmakol. Imunotoksikol. 2022, 44, 326–337. [CrossRef] 62. Park, SH; Park-Min, KH; Chen, J.; Hu, X.; Ivashkiv, LB Faktor tumorske nekroze povzroči navzkrižno toleranco na endotoksin v makrofagih, posredovano s kinazo GSK3. Nat. Immunol. 2011, 12, 607–615. [CrossRef] [PubMed]
63. Yamawaki, Y.; Shirawachi, S.; Mizokami, A.; Nozaki, K.; Ito, H.; Asano, S.; Oue, K.; Aizawa, H.; Yamawaki, S.; Hirata, M. Katalitično neaktiven protein, povezan s fosfolipazo C, uravnava anoreksijo, ki jo povzroči vnetje hipotalamusa pri miših, ki ga povzroči lipopolisaharid. Neurochem. Int. 2019, 131, 104563. [CrossRef] [PubMed]
64. Shah, SA; Khan, M.; Jo, M.; Jo, MG; Amin, FU; Kim, MO Melatonin stimulira signalno pot SIRT 1/Nrf2, ki preprečuje oksidativni stres, ki ga povzroči lipopolisaharid (LPS), da reši postnatalne možgane podgan. Nevrologija CNS. Ther. 2017, 23, 33–44. [CrossRef] [PubMed]
65. Cho, YJ; Lee, YA; Lee, JW; Kim, JI; Han, JS Kinetika vnetnih citokinov po intraperitonealni injekciji tribromoetanola in kombinacije tribromoetanola/ksilazina pri miših ICR. Lab. Anim. Res. 2011, 27, 197–203. [CrossRef] [PubMed]
66. Posel, C.; Moller, K.; Boltze, J.; Wagner, DC; Weise, G. Izolacija in pretočna citometrična analiza imunskih celic iz ishemičnih mišjih možganov. J. Vis. Exp. 2016, 108, 53658. [CrossRef] [PubMed]
67. Serrano-Perez, MC; Martin, ED; Vaquero, CF; Azcoitia, I.; Calvo, S.; Cano, E.; Tranque, P. Odziv transkripcijskega faktorja NFATc3 na ekscitotoksične in travmatične možganske napade: Identifikacija subpopulacije reaktivnih astrocitov. Glia 2011, 59, 94–107. [CrossRef]
69. Fradejas, N.; Serrano-Perez Mdel, C.; Tranque, P.; Calvo, S. Ekspresija selenoproteina S v reaktivnih astrocitih po poškodbi možganov. Glia 2011, 59, 959–972. [CrossRef]
