Zdravstveno koristne lastnosti izvlečka pečk vinske trte in njegov vpliv na izbrane biokemične markerje v krvi, jetrih in ledvicah Rattus Norvegicus
Mar 10, 2022
Povzetek:Kadmij (Cd) je težka kovina, ki se pojavlja na vseh področjih okolja, vključno s prehranjevalno verigo. V telesu povzroča oksidativni stres s proizvodnjo prostih radikalov, ki so škodljivi za celice. Izvleček grozdnih pečk (GSE) vsebuje široko paleto biološko aktivnih sestavin, ki pomagajo nevtralizirati škodljive učinke prostih radikalov. V tej raziskavi smo spremljali učinke GSE, pripravljenega iz polrezistentne sorte vinske trte Season, ki je bogata s fenoli, na biokemične markerje rjavih podgan, izpostavljenih vplivu kadmija. GSE je povečal antioksidativno aktivnost v plazmi in vledvicein jetrih se je vsebnost Cd znatno znižala s sočasno uporabo GSE. Skladno s tem je sočasno dajanje GSE upočasnilo povečanje vsebnosti kreatinina in aktivnosti alanin aminotransferaze ter zmanjšanje aktivnosti katalaze in superoksid dismutaze, ki jih povzroča kadmij. Rezultati tega dela kažejo, da izvleček grozdnih pečk nudi zaščitni učinek pred vnosom težkih kovin v organizem.
1. Uvod
Kadmij (Cd) je težka kovina, ki se pojavlja na vseh področjih okolja; je del zemeljske skorje, vsebovan je v vodi, kopiči se v rastlinah in je prisoten v organizmih. Poleg prehranjevalne verige (pri rastlinah so viri večina žit, korenovk in zelenjave, med živalskimi organi pa predvsem jetra inledviceso vir), pomemben vir kadmija za človeka so cigaretni dim, izdihani izdihi različnih vrst zgorevanja, metalurška industrija in nekatere električne napeljave [1,2]. V telesu se kadmij veže predvsem na metalotionein, albumin in druge plazemske beljakovine v krvi. Kadmij je nevarna strupena kovina, ki povzroča oksidativni stres s proizvodnjo prostih radikalov, ki so škodljivi za celice. Prosti radikali lahko poškodujejo beljakovine, lipide, encime in DNK, zato jih morajo nevtralizirati antioksidanti, preden vstopijo v celice [3].
Če Cd ni nevtraliziran, povzroči razpad rdečih krvničk [4], se kopiči v organizmu, zlasti v jetrih inledvice— in zaradi svoje podobnosti s cinkom, ki je esencialni element, zlahka vstopa v encimske reakcije in sodeluje v biokemičnih procesih [5]. Iz organizma se izloča zelo počasi in težko [6]. Dobro je znano, da imajo lahko antioksidanti zaščitni učinek pred oksidativnim stresom in poškodbami težkih kovin, in to eksperimentalno delo je temeljilo na tem dejstvu. Izvleček grozdnih pečk (GSE) vsebuje širok spekter biološko aktivnih komponent v svoji matriki [7], ki pomagajo nevtralizirati škodljive učinke prostih radikalov. GSE ščiti celice pred poškodbami z uravnavanjem celične oksidativne poškodbe, zmanjšanjem poškodb organov, izboljšanjem ravnovesja med oksidanti in antioksidanti ter zmanjšanjem sproščanja vnetnih mediatorjev. Ima tudi protivnetne, antiapoptotične in proliferativne učinke [8]. Posebej pomembna je visoka vsebnost kondenziranega flavan-3-ola ali procianidinov, ki se preiskujeta kot alternativna metoda zdravljenja resnih bolezni [9,10]. Vendar pa lahko na vsebnost in sestavo fenolov grozdnih pečk ter na antioksidativno aktivnost ekstrakta pečk vpliva sorta vinske trte, podlaga, podnebne razmere ali tehnika gojenja [11–13] in s tem tudi antioksidativne lastnosti, kot kot tudi zaščitnih učinkov betonskega ekstrakta, ni mogoče enostavno predvideti. Namen tega dela je bil preučiti zaščitni učinek GSE, pripravljenega iz polodporne sorte vinske trte Cerason, na biokemične označevalce v krvi, plazmi, jetrih inledvicerjavih podgan, ki so bile izpostavljene učinkom kadmija.
Ključne besede:izvleček grozdnih pešk; antioksidanti; kadmij; rattus norvegicus; biokemični markerji; zaščitni učinek; ledvice, Renal
CISTANCHE BO IZBOLJŠAL DELOVANJE LEDVIC/LEDVIC
2. Rezultati in razprava
2.1. Antioksidativna aktivnost in fitokemična sestava izvlečka grozdnih pešk
Ekstrakt grozdnih pečk, pripravljen iz polrezistentne sorte Cerason, je bil testiran na antioksidativno delovanje, vsebnost skupnih polifenolov in izbrane posamezne antioksidante. Antioksidativno aktivnost smo določali spektrofotometrično s štirimi metodami, ki temeljijo na različnih principih (DPPH•, ABTS• plus, FRAP, FR), skupne polifenolne spojine pa z metodo Folin–Ciocalteu. Odvisno od uporabljene metode se je antioksidativna aktivnost gibala od 7 do 31 mg/g ekvivalenta galne kisline (GAE), skupna vsebnost polifenola pa 9,3 mg/g GAE (tabela 1). Rezultati tega dela poskusa so pokazali na visok antioksidativni potencial grozdnih pečk.
2.2. In vivo določanje učinka izvlečka grozdnih pešk pri podganah
2.2.1. Določanje vsebnosti kadmija v krvi, jetrih in ledvicahKadmij je najbolj razširjena strupena kovina v krmi. Po peroralni uporabi se absorbira iz črevesja, prenese v jetra in konjugira s tiolnimi skupinami metalotioneina (MT). Poleg tega se lahko Cd veže tudi na albumin ali druge beljakovine v krvi [14]. Kasneje se Cd kopiči v telesu, se le počasi izloča iz telesa z urinom in blatom in ima biološko razpolovno dobo približno 20 let. Največjo količino (približno tretjino) kadmija najdemo vledvicakorteks. V krvi je večina kadmija (približno 90 odstotkov) prisotna v rdečih krvničkah. Je strupen za številne organe in glavne tarče soledvice, kosti in pljuča [15–17]. Poročali so, da GSE znižuje koncentracijo kadmija v rdečih krvnih celicah in vledvice,medtem ko naj bi se njegova vsebnost v jetrih povečala [14]. Rezultati za vsebnost kadmija v krvi v tej študiji so prikazani na sliki 1A. Na začetku poskusa smo v krvi živali našli 3,2 µg/kg kadmija. Med poskusom je bila po 14 dneh povprečna vrednost kadmija v skupini z dodatkom GSE in kadmija bistveno višja kot v drugih skupinah (10,8 µg/kg, p=0.023). Po 28 dneh je bila variabilnost podatkov prevelika, da bi lahko opazili statistično pomembnost.
Na začetku poskusa v jetrih (slika 1B) poskusnih živali nismo zaznali kadmija. Skladno s tem v jetrih živali iz kontrolne in GSE skupine med poskusom niso odkrili kadmija. Po drugi strani pa je bila po 14 dneh poskusa povprečna vrednost kadmija v skupini z dodatkom kadmija 5,8 mg/kg, v skupini z dodatkom kadmija in GSE pa povprečna vrednost 5,2 mg/kg. Obe vrednosti sta se bistveno razlikovali od kontrolne skupine (p=0.002 in p=0.018 za skupino, ki je prejemala samo kadmij, in skupino s kadmijem oziroma GSE). Po 28 dneh se je povprečna vrednost v skupini z dodatkom kadmija povečala na 6,7 mg/kg, kar se je pomembno razlikovalo od ravni kadmija v skupini z dodatkom kadmija in GSE, ki se je rahlo znižala na 4,8 mg/kg. (p=0.008).
Na začetku poskusa kadmija vledvice(Slika 1C) poskusnih živali. V skladu s tem ni bilo zaznati kadmijaledviceživali iz kontrolne in GSE skupine med poskusom. Po drugi strani pa je bila po 14 dneh povprečna vrednost kadmija v skupini z dodatkom kadmija 9,5 mg/kg, v skupini z dodatkom kadmija in GSE pa 6,5 mg/kg. Obe vrednosti sta se značilno razlikovali od kontrolne skupine (p < 0.001="" za="" obe="" skupini).="" po="" 28="" dneh="" se="" je="" povprečna="" vrednost="" v="" skupini="" z="" dodatkom="" kadmija="" povečala="" na="" 16,6="" mg/kg,="" kar="" se="" je="" pomembno="" razlikovalo="" od="" ravni="" kadmija="" v="" skupini="" z="" dodatkom="" kadmija="" in="" gse,="" ki="" se="" je="" le="" rahlo="" povečala="" na="" 10,4="" mg/kg.="" kg="" (p="0.009)." tako="" je="">ledvicein v jetrih se je vsebnost Cd znatno znižala z dajanjem GSE. GSE vsebuje fenolne spojine, ki lahko kelirajo Cd in tako zmanjšajo kopičenje Cd. Tvorba teh kelatov je verjetno povzročila zmanjšano sposobnost proteinov, da vežejo Cd, ki bi ga tako lahko učinkoviteje izločili iz telesa [18].
2.2.2. Določanje vsebnosti kreatinina in sečnine
Glede na kopičenje kadmija vledvice, theledvicaje eden najpomembnejših tarčnih organov za toksičnost, ki jo povzroči Cd. Zato jeledvicav plazmi smo določili markerje kreatinin in sečnino. Določitev kreatinina je dober pokazatelj glomerularne filtracije in se uporablja predvsem za spremljanje potekabolezni ledvic. Razmerje med koncentracijo kreatinina in glomerulno filtracijo je hiperbolično; ko se zmanjša glomerularna filtracija, se zmanjša tudi izločanje kreatinina [19]. Povečan vnos težke kovine kadmija vodi vpoškodbe ledvicin s tem zmanjšano učinkovitost izločanja kreatinina. Posledično povišana raven kreatinina v krvi kaže na aledvičnamotnja [20].
V naši študiji so bile ravni kreatinina povečane s Cd v skladu s predhodno objavljenimi rezultati [21]. Povprečna vrednost vsebnosti kreatinina (Slika 2A) pri poskusnih živalih na začetku poskusa je bila 3.0 mg/L. V skupini, ki je prejemala kadmij, je prišlo do pomembnega povečanja spremljanih vrednosti na 5,1 mg/L (po 14 dneh, p=0.015) in na 6,2 mg/L (po 28 dneh, p < 0.001).="" v="" skupini,="" pri="" kateri="" so="" gse="" dajali="" sočasno="" s="" kadmijem,="" je="" bilo="" povečanje="" tega="" markerja="" manjše="" (4,2="" mg/l="" po="" 14="" dneh="" in="" 5,5="" mg/l="" po="" 28="" dneh)="" in="" statistično="" značilno="" šele="" po="" 28="" dneh="" v="" primerjavi="" s="" kontrolo="" (="" p="">< 0,001).="" tako="" je="" bilo="" povečanje="" koncentracije="" kreatinina="" upočasnjeno="" s="" sočasno="" uporabo="" gse,="" kar="" kaže="" na="" zmanjšanje="" toksičnega="" učinka,="" ki="" ga="" povzroča="" kadmij.="" v="" skupini,="" ki="" je="" prejemala="" samo="" gse,="" so="" bile="" normalne="">
Urea je kvantitativno najpomembnejši produkt razgradnje aminokislin in beljakovin. Nastaja v jetrih iz amoniaka, ki se sprošča pri reakcijah deaminacije med presnovo aminokislin. Izloča se iz organizma predvsem sledvicez glomerularno filtracijo in tubulno resorpcijo [22]. V primeruledvične bolezni, hitrost proizvodnje sečnine presega hitrost njenega očistka, kar ima za posledico zvišanje ravni sečnine v krvi. Poleg tega kadmij zavira vgradnjo aminokislin v beljakovine, kar povzroča uremijo [21]. Po drugi strani pa se ob okvari delovanja jeter zmanjša sinteza sečnine in s tem tudi njena koncentracija v plazmi [20]. Tako je koncentracija sečnine v krvi odvisna od vsebnosti beljakovin v prehrani,ledvičnaizločanje in presnovna funkcija jeter.
V naši študiji so bile ravni sečnine povečane s Cd v skladu s predhodno objavljenimi rezultati [21]. Povprečna vrednost vsebnosti sečnine (Slika 2B) pri poskusnih živalih na začetku poskusa je bila 207 mg/L. V skupini, ki je prejemala kadmij, je prišlo do pomembnega povečanja spremljanih vrednosti na 329 mg/L (po 14 dneh) in 425 mg/L (po 28 dneh). V skupini, pri kateri so GSE dajali sočasno s kadmijem, je bilo povečanje tega markerja le nekoliko nižje – 325 mg/L po 14 dneh in 381 mg/L po 28 dneh. Obe skupini, ki sta prejemali samo kadmij in kadmij skupaj z GSE, sta se pomembno razlikovali od kontrolne skupine po 14 (p=0.001 oziroma p=0.002) oziroma 28 dneh poskusa (p < 0,001).="" za="" oba).="" v="" skupini,="" ki="" je="" prejemala="" samo="" gse,="" so="" bile="" ugotovljene="" normalne="">
2.2.3. Določanje plazemske antioksidativne aktivnosti
Kadmij povzroči vrsto učinkov, povezanih predvsem z oksidativnim stresom. Ker Cd ni redoks-aktiven, ne ustvarja neposredno reaktivnih kisikovih vrst. Kljub temu so o njihovi proizvodnji po izpostavljenosti Cd poročali v številnih študijah in pregledali Cuypers et al. [23]. Mehanizmi, ki vodijo do redoks motenj med izpostavljenostjo Cd, vključujejo izčrpavanje reduciranega glutationa, ki ga povzroča afiniteta Cd do tiolnih skupin, zamenjavo Fe s Cd v proteinih, ki vodi do povečanih koncentracij redoks-aktivnega prostega Fe, mitohondrijsko disfunkcijo in indukcijo NADPH oksidaze, ki katalizirajo tvorbo superoksidnih radikalov [23]. Med oksidativnim stresom lahko antioksidativne spojine, kot so fenoli, prekinejo proizvodnjo novih reaktivnih vrst z njihovo pretvorbo v stabilne oblike radikalov. Zato lahko rastlinski izvlečki, bogati s fenoli, zagotovijo zaščitne učinke proti Cd ali spojinam, ki vsebujejo Cd [24].
V tej študiji je bila povprečna vrednost plazemske antioksidativne aktivnosti (slika 3) pri poskusnih živalih na začetku poskusa 0,71 mg/L. V vseh poskusnih skupinah so opazili rahlo povečanje v primerjavi s kontrolno skupino. Vendar pa je bila edina pomembna razlika med skupino, zdravljeno z GSE, in kontrolno skupino po 28 dneh (p=0.012), kar potrjuje pozitiven učinek GSE na antioksidativno aktivnost v plazmi. Prejšnji rezultati so dvoumni; včasih so ugotovili povečanje antioksidativnega potenciala v plazmi, ki ga povzroča GSE [25], včasih pa ne [14].
2.2.4. Določanje aktivnosti ALT in AST
Oksidativni stres je povezan z izgubo funkcionalne celovitosti membranske arhitekture, ki jo povzroči povečana peroksidacija lipidov. Po drugi strani pa povečana prepustnost citoplazemske membrane povzroči uhajanje jetrnih markerskih encimov (ALT in AST) v kri [14]. Dejansko sta ALT in AST diagnostično pomembna tudi pri omejeni poškodbi jeter zaradi zastrupitve, o njunem povečanju v serumu, ki ga povzroča kadmij, pa so poročali že prej [14] in to je potrdila ta študija. Povprečna vrednost aktivnosti ALT (Slika 4A) pri poskusnih živalih na začetku poskusa je bila 0,84 µkat/L. V skupini, ki je prejemala kadmij, je bilo zabeleženo pomembno povečanje spremljanih vrednosti na povprečno 1,52 µkat/L po 14 dneh (p < 0.001)="" in="" 1,87="" µkat/l="" po="" 28="" dneh="" (p="" {{="" 13}}.004).="" v="" skupini,="" ki="" ji="" je="" bil="" gse="" dajan="" sočasno="" s="" kadmijem,="" je="" bilo="" povečanje="" tega="" markerja="" bistveno="" počasnejše="" kot="" v="" skupini,="" ki="" je="" prejemala="" samo="" kadmij="" (1,23="" µkat/l="" po="" 14="" dneh="" in="" 1,92="" µkat/l="" po="" 28="" dneh).="" po="" 14="" dneh="" poskusa="" se="" je="" ta="" skupina="" razlikovala="" tako="" od="" kontrolne="" skupine="" (p="0.009)" kot="" od="" skupine="" kadmija="" (p="0.026)," medtem="" ko="" se="" je="" po="" 28="" dneh="" bistveno="" razlikovala="" samo="" iz="" kontrolne="" skupine="" (p="0.003)." v="" skupini,="" ki="" je="" prejemala="" samo="" gse,="" so="" se="" vrednosti="" po="" 14="" dneh="" prav="" tako="" povečale="" na="" 1,17="" µkat/l.="" ta="" vrednost="" se="" je="" pomembno="" razlikovala="" od="" kontrolne="" skupine="" (p="0.024)" in="" je="" bila="" primerljiva="" z="" vrednostjo="" skupine,="" ki="" je="" prejemala="" tako="" gse="" kot="" kadmij.="" po="" 28="" dneh="" so="" bile="" vrednosti="" skupine="" samo="" gse="" podobne="" kontrolni="">
Povprečna vrednost vsebnosti AST (Slika 4B) pri poskusnih živalih na začetku poskusa je bila 2,07 µkat/L. V skupini, ki je prejemala kadmij, je bilo statistično značilno povečanje opazovanih vrednosti zabeleženo šele po 28 dneh poskusa (3,52 µkat/L, p=0.001). Presenetljivo je bilo, da je bilo v skupini, pri kateri so GSE dajali sočasno s kadmijem, povečanje tega markerja hitrejše in bistveno drugačno od kontrolne skupine tako po 14 dneh kot po 28 dneh (2,67 oziroma 2,84 µkat/L, p {{15). }}.043 za oba), čeprav je bila vrednost po 28 dneh nekoliko nižja kot pri skupini, ki je prejemala samo kadmij. Različica samo za GSE je imela normalne vrednosti.
V našem poskusu je dajanje GSE lahko upočasnilo povečanje aktivnosti ALT. Ta učinek ustreza predhodno objavljenim rezultatom [14] in je morda posledica čiščenja lipidnih peroksidov s prenosom vodika iz fenolne spojine v lipidni peroksid, ki vsebuje proste radikale. Po drugi strani pa je bil dolgoročno ta učinek majhen. Povečanje aktivnosti AST, ki ga povzroča kadmij, je precej pospešilo dajanje GSE. Vendar pa je dolgoročno prišlo do rahlega zmanjšanja aktivnosti AST. Tako lahko GSE delno kompenzira toksični učinek Cd na celične membrane.
2.2.5. Določanje aktivnosti SOD in CAT v jetrih
Poleg neposredne udeležbe v oksidativnih reakcijah kadmij zavira aktivnost antioksidativnih encimov, kot sta SOD in CAT, encimov, ki lahko razstrupljajo superoksidne radikale oziroma vodikov peroksid [14]. SOD je encim, ki učinkovito duši superoksidni radikal in ga pretvori v manj strupen vodikov peroksid, ki ga lahko nadalje razgradi katalaza ali peroksidaza [26]. CAT je encim, ki ga najdemo v skoraj vseh živih organizmih, ki so izpostavljeni kisiku. Deluje kot katalizator za razgradnjo vodikovega peroksida v vodo in kisik [27]. Ima eno najvišjih stopenj pretvorbe med encimi [28] in kot antioksidativni encim je eden od zaščitnih mehanizmov, ki vodijo k vzdrževanju ravnovesja v človeškem telesu [29]. Mehanizem zmanjšanja aktivnosti encimov, ki ga povzroči Cd, je verjetno neposredna vezava Cd na aktivna mesta encimov [30].
V tej študiji so opazili tudi zmanjšanje aktivnosti SOD in CAT. Na začetku poskusa je bila povprečna aktivnost encima SOD v jetrih (slika 5A) poskusnih živali 18,4 U/mg proteina. Po 14 dneh poskusa je bila aktivnost SOD bistveno višja v skupini, ki je prejemala GSE (21,1 U/mg), kot v obeh skupinah, ki sta prejemali kadmij (p < 0.001="" in="" p="" {{="" 9}}.009="" za="" skupine="" samo="" s="" kadmijem="" oziroma="" kadmij="" z="" gse),="" vendar="" je="" bila="" samo="" v="" skupini,="" ki="" je="" prejemala="" samo="" kadmij,="" aktivnost="" sod="" znatno="" nižja="" (16,7="" u/mg)="" kot="" v="" kontrolni="" skupini="" (p="0" .005).="" po="" 28="" dneh="" poskusa="" sta="" se="" obe="" skupini,="" ki="" sta="" prejemali="" kadmij,="" pomembno="" razlikovali="" od="" obeh="" kontrolnih="" skupin="" (16,4="" u/mg,="" p="0.002" in="" 17,6="" u/mg,="" p="0.023" za="" kadmij="" samo="" in="" kadmij="" z="" gse)="" in="" skupina,="" zdravljena="" samo="" z="" gse="" (p="">< 0,001="" in="" p="0.005" samo="" za="" kadmij="" oziroma="" kadmij="" z="">
Na začetku poskusa je bila povprečna aktivnost encima CAT v jetrih (slika 5B) 32,7 U/mg proteina. Po 14 dneh poskusa je bila aktivnost CAT bistveno večja v skupini, ki je prejemala GSE (33,5 U/mg), kot v obeh skupinah, ki sta prejemali kadmij (p=0.002 in p=0.031 za samo kadmij oziroma kadmij s skupinami GSE), vendar je bila samo v skupini, ki je prejemala samo kadmij, aktivnost CAT bistveno nižja (23,8 U/mg) kot v kontrolni skupini (p=0.005). Vendar se je po 28 dneh aktivnost CAT v skupini, ki je prejemala GSE skupaj s kadmijem, dodatno zmanjšala na 27,1 U/mg, dosegla vrednosti skupine, ki je prejemala samo kadmij (25,8 U/mg), in se bistveno razlikovala od kontrolne skupine (p { {21}}.033). Skupina, zdravljena samo z GSE, se je bistveno razlikovala od obeh skupin s kadmijem (p=0.026 in p=0.012 samo za kadmij oziroma kadmij z GSE). Zanimivo je, da je zmanjšanje, ki ga povzroča kadmij, upočasnilo sočasno dajanje GSE. Za CAT so bili ti učinki GSE opaženi že prej [14]. Kelacijski učinek fenolnih spojin, ki jih vsebuje GSE, bo verjetno zmanjšal sposobnost kadmija, da se veže na aktivno mesto encima.
2.2.6. Določitev vsebnosti MT
Kadmij ni podvržen nobenim neposrednim presnovnim pretvorbam, vendar je v vseh tkivih v glavnem vezan na metalotionein (MT). MT spada v skupino intracelularnih beljakovin z nizko molekulsko maso, bogatih s cisteinom, z molekulsko maso 6–10 kDa. Primarna vloga MT v organizmu je vzdrževanje homeostaze cinka, razstrupljanje težkih kovin in zaščita pred oksidativnim stresom. Ekspresijo MT lahko inducirajo številni eksogeni in endogeni dejavniki, kot so UV-sevanje, težke kovine, stresni hormoni, prosti kisikovi radikali, mediatorji vnetja, okužbe, travme in onkogeneza [31,32]. MT se v veliki meri sintetizira v jetrih inledvicain se sprosti v kri. Čeprav je MT odgovoren za kopičenje kadmija v tkivih z zmanjšanjem njegovega izločanja, MT ščiti pred akutno in kronično toksičnostjo, ki jo povzroči Cd [33]. V naši raziskavi smo vsebnost MT spremljali v krvi, jetrih inledvica.
Povprečna vrednost vsebnosti MT v krvi (Slika 6A) poskusnih živali je bila na začetku poskusa 23,9 nmol/g. Po 14 dneh so bile spremembe minimalne in po 28 dneh so opazili veliko variabilnost med ponovitvami, kar je povzročilo statistično nedokončnost (p=0,948). Srednja vrednost vsebnosti MT zaledvice(Slika 6B) poskusnih živali na začetku poskusa je bila 21,46 nmol/g. V nobeni poskusni skupini se med poskusom vrednosti niso pomembno spremenile (p=0,938). Povprečna vrednost vsebnosti MT v jetrih (Slika 6C) poskusnih živali je bila na začetku poskusa 17,15 nmol/g. Po 14 dneh se je vsebnost MT rahlo povečala v vseh poskusnih skupinah, razlike glede na kontrolno skupino pa so bile značilne za skupino, ki je prejemala samo Cd, in skupino, ki je prejemala samo GSE (p=0.008 in p=0 .046). Po 28 dneh se je vsebnost MT v skupini GSE vrnila na vrednost kontrolne skupine, medtem ko je vsebnost MT v skupini Cd ostala povečana in se je razlikovala tako od kontrolne kot skupine GSE (p=0.046 in p=0.035). V skupini, ki je prejemala GSE skupaj s kadmijem, se vsebnost MT ni pomembno razlikovala od kontrolne – kar je bilo v skladu z nižjo vsebnostjo kadmija v jetrih te skupine – v primerjavi s skupino, ki je prejemala samo kadmij (razlika je bila pomembna po 28 dni poskusa).
Skupaj so statistično pomembne spremembe v vsebnosti MT, ki jih povzroča Cd, opazili le v jetrih. Prej so poročali o povečanju MT v krvi poskusnih živali, ki so prejemale kadmij [34]. V tem primeru rezultati kažejo, da se lahko razstrupljanje Cd preko MT zgodi v jetrih.
3. Materiali in metode
3.1. Oblikovanje poskusaRjave podgane iz rodu Wistar (stare osem tednov, 235 ± 3 g) so bile razdeljene v štiri skupine po šest osebkov: A) kontrolna skupina podgan na običajni dieti (n=6); B) skupina podgan, ki jim je bil dodan GSE (200 mg GSE/dan) (n=6); C) skupina, ki je prejemala kadmij (2 mg Cd/dan – konkretno CdCl2, raztopljen v vodi) (n=6); in D) skupina, ki je prejemala dieto, ki je vsebovala kadmij (2 mg Cd/dan), ki ji je bil dodan GSE (200 mg GSE/dan) (n=6). Izvleček je bil vzet iz semen sorte vinske trte Cerason; njegova priprava in karakterizacija sta opisani v razdelku 3.2. (Izvleček pečk vinske trte). Ekstrakt smo stehtali dnevno v odmerku 200 mg, preden smo ga dali poskusnim rjavim podganam (200 mg GSE na vsako podgano; 0,85 g/L kg telesne mase). GSE smo dajali z vodo. Podgane so dobile vlažne krmne mešanice in neškodljivo (otroško) vodo ad libitum. Enkrat na teden so živali menjali stelje. Po 14 in 28 poskusnih dneh so bile tri živali iz vsake skupine evtanazirane in jim odvzeta kri s srčno punkcijo. Pred odvzemom smo intraperitonealno dali zdravilo Fraxiparin (0,01 ml / kg), nato pa smo živalim dali dietil eter pod inhalacijsko anestezijo. Vzorec krvi je bil nato zbran v mikroepruvete, prevlečene s heparinom (ali epruvete z EDTA – za analize MT in kadmija; brez naknadnega centrifugiranja), čemur je sledilo nežno centrifugiranje (800 g/10 min) in zbiranje krvi plazmo za nadaljnjo analizo. Jetra in desnoledvicaso bili ekstrahirani za nadaljnjo analizo. Študija je bila izvedena v skladu s Helsinško deklaracijo, protokol pa je potrdila Strokovna komisija za zagotavljanje dobrega počutja poskusnih živali Univerze Mendel v Brnu (za projekt IGA-ZF/2016-AP011).
3.2. Izvleček pečk vinske trte
Semena vinske trte (sorta Cerason—Merlot × Seibel 13 666) so bila sortirana, očiščena, posušena in zmleta. Sortiranje je potekalo preko tropin na separacijskem stroju, kjer so bila semena ločena od olupkov. Tako izločena semena smo nato splaknili, prazna semena odstranili, preostala semena pa očistili. Očiščena in oprana semena smo 12 h sušili v sušilniku pri 50 ◦C. Sledilo je mletje semen z laboratorijskim mlinčkom IKA MF 10 Basic (IKA Werke, Staufen im Breisgau, Nemčija). Zmleta semena smo 120 h ekstrahirali v 75 odstotnem etanolu (22 ◦C, stresanje pri 50 RPM; IKA KS 260 Basic, proizvajalec: IKA Werke, Staufen im Breisgau, Nemčija) v razmerju en del zmletih semen na deset delov. etanola (m/m). Po tem smo ekstrakt dali v 25 ml epruvete (Eppendorf, Hamburg, Nemčija) in centrifugirali (Hettich MIKRO 220 Centrifuge; Hettich, Westphalia, Nemčija) pri 4 ◦C in RCF 25,000× g. Iz epruvete smo vzeli centrifugiran vzorec in ga prenesli v vakuumsko destilacijsko bučko (IKA RV 10 digital VC; IKA Werke, Staufen im Breisgau, Nemčija), kjer je etanol izhlapel. Uparjanje je potekalo v vakuumu pri 90 ◦C, ekstrakt pa smo prenesli v petrijevke in liofilizirali v vakuumu pri 53 ◦C (liofilizator Heto PowerDry PL 3000; Trigon-plus, Cestlice, Češka). Po pripravi smo izvleček dali poskusnim živalim.
CISTANCHE BO IZBOLJŠAL OKUŽBO LEDVIC/LEDVIC
3.3. Določanje antioksidativne aktivnosti in skupne vsebnosti polifenolov
Da bi zagotovili objektivnost rezultatov, smo za določanje antioksidativne aktivnosti uporabili štiri bistveno različne metode. Vzorci so bili analizirani na avtomatskem spektrofotometru BS-400 (Mindray, Shenzen, Kitajska). Vse vzorce smo analizirali v treh izvodih, dobljena vrednost je ustrezala povprečju teh meritev. Te analize so bile izvedene po Sochorju et al. [35].
3.3.1. Določanje antioksidativne aktivnosti z metodo ABTS
Raztopino za določanje antioksidativne aktivnosti s testom ABTS smo pripravili z mešanjem dveh raztopin – raztopino 1: 7 mM raztopino ABTS, pripravljeno s tehtanjem m=9.60 mg na 5 mL destilirane vode; in raztopina 2: 4,95 mM raztopina kalijevega persulfata, pripravljena s tehtanjem m=1,67 mg na 5 mL destilirane vode. Nastalo raztopino razredčimo z destilirano vodo v razmerju 1:10 in pustimo 12 ur na temnem in hladnem. Nato smo 150 µL reagenta R1 (7 mM ABTS in 4,95 mM kalijevega persulfata) pipetirali v plastične kivete, nato dodali 3 µL vzorca in merili v spektrofotometru (λ=660 nm) 12 min. Glede na umeritveno krivuljo smo absorbanco pretvorili v ekvivalentno vsebnost galne kisline; antioksidativna aktivnost je bila izračunana iz umeritvene krivulje z uporabo galne kisline kot standarda (10–200 mg·L1), rezultati pa so bili izraženi kot ekvivalenti galne kisline.
3.3.2. Določanje antioksidativne aktivnosti z metodo DPPH
Najprej smo stehtali m {{0}},35 mg radikala DPPH. To količino smo prenesli v 250 ml merilno bučko in dopolnili z metanolom. Nato smo 150 µL reagenta R1 (0,095 mM DPPH) pipetirali v plastične kivete, čemur je sledil dodatek 15 µL vzorca za merjenje. Test DPPH temelji na sposobnosti stabilnega prostega radikala 2,2-difenil-1-pikrilhidrazila, da reagira z donorji vodika. DPPH kaže močno absorpcijo v ultravijolično-vidnem spektroskopskem spektru (UV-VIS). Absorbanco smo merili 12 minut pri λ=505 nm. Glede na umeritveno krivuljo smo absorbanco pretvorili v ekvivalentno vsebnost galne kisline.
3.3.3. Določanje antioksidativne aktivnosti z metodo zmanjševanja železove antioksidativne moči
Za določanje antioksidativne aktivnosti z metodo FRAP (ferri reducing antioxidant power) so bile uporabljene tri raztopine—(1) raztopina TPTZ: 10 mM TPTZ (m=78.02 mg), raztopljenega v 25 ml 40 mM HCl; (2) raztopina FeCl3: 20 mM FeCl3 (m=135.13 mg), raztopljenega v 25 ml destilirane vode; in (3) raztopina acetatnega pufra: 0,02 M acetatni pufer pH 3,6 (m=775 mg natrijevega acetata, raztopljenega v 250 ml destilirane vode, pH uravnan z ocetno kislino). Tri raztopine smo zmešali v razmerju 1:1:10 (TPTZ:FeCl3:acetatni pufer). Nato smo 150 µL reagenta pipetirali v plastične kivete in dodali 3 µL vzorca. Absorbanco smo merili 12 minut pri λ=605 nm. Antioksidativno aktivnost smo izračunali iz umeritvene krivulje z uporabo galne kisline kot standarda (10–200 mg·L1). Rezultati so bili izraženi kot ekvivalent galne kisline.
3.3.4. Določanje antioksidativne aktivnosti z metodo prostih radikalov klorofilina
Skupaj 200 µL reagenta R1 (0,1 M HCl, ekstrakt klorofila, reakcijski pufer, katalizator) smo odpipetirali v plastične kivete in nato dodali 8 µL vzorca. Ta metoda uporablja sposobnost klorofilina (natrijevo-bakrove soli klorofila), da sprejema in oddaja elektrone, medtem ko stabilno spreminja maksimum absorpcije. Ta proces je pogojen z alkalnim okoljem in dodatkom katalizatorja. Absorbanco smo merili 12 minut pri λ=450 nm. Za izračun so bile uporabljene zadnje izmerjene vrednosti. Rezultati so bili izraženi kot ekvivalent galne kisline.
3.3.5. Določanje skupne koncentracije polifenola
Za določanje skupnih polifenolnih spojin smo uporabili metodo Folin–Ciocalteu. Vse vzorce smo analizirali v treh izvodih, dobljeno vrednost pa smo dobili kot povprečje teh meritev. 40 µL vzorec smo odpipetirali v kiveto (3 mL) in razredčili s 1960 µL destilirane vode. Nato smo v kiveto dodali 50 µL reagenta Folin-Ciocalteu. Zmes smo temeljito pretresli in po 3 minutah dodali 300 µL 20-odstotne raztopine Na2CO3 dekahidrata. Reakcijsko mešanico smo stresali in inkubirali pri 22 °C 120 minut. Po tem času smo izmerili absorbanco (SPECORD 210; Carl-Zeiss, Jena, Nemčija) pri λ=750 nm proti slepemu vzorcu. Rezultati so bili izraženi kot ekvivalent galne kisline.
3.4. Določanje antioksidantov s HPLC
Določanje posameznih antioksidantnih komponent s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti z masnim spektrometrom. Analize vzorcev, uporabljenih za oceno flavonoidov in proantocianinov, so bile izvedene v kromatografskem sistemu Agilent Technologies 12{{10}}0 (Jet Stream Technologies, Santa Clara, CA, ZDA), ki je sestavljen iz naslednje naprave: rezervoarji za mobilno fazo, razplinjevalec, binarna črpalka, rezervoar za vzorec z avtomatskim vzorčevalnikom in masni detektor z Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS (Jet Stream Technologies, Santa Clara, CA, ZDA). Ločevanje vzorcev je potekalo v kromatografskih kolonah Zorbax SB C18 z dimenzijami 50 × 2,1 mm in velikostjo delcev 2,7 µm. Čas analize je bil vedno 6 minut. Sorazmerna hitrost nosilnega plina je bila 0,6 mL·min1. Organska komponenta mobilne faze je bila gradientne stopnje metanola (topilo B), vodna sestavina pa je vsebovala 0,05 M amonijevega formata (topilo A). Gradient gibljive faze je bil naslednji: čas 0 min: 50 odstotkov topila A in 50 odstotkov topila B; čas 2,5 min: 100 odstotkov topila A in 0 odstotkov topila B; čas 5 min: 50 odstotkov topila A in 50 odstotkov topila B. Temperaturo kolonskega termostata smo naravnali na 45 ◦C.
CISTANCHE BO IZBOLJŠAL LEDVIČNE/LEDVIČNE BOLEČINE
3.5. Določanje izbranih biokemijskih markerjev
Biokemični označevalci v krvi, plazmi, jetrih inledvicaživali so spremljali, da bi ugotovili zaščitni učinek GSE pred negativnimi učinki kadmija. Opravljene so bile naslednje analize: (1) Analize plazme: skupna antioksidativna aktivnost plazme, kreatinin, sečnina, ALT, AST. (2) Krvne analize: MT. (3) Jetrne analize: SOD, CAT, MT. (4)Ledvicaanalize: MT.
3.5.1. Določanje celotne plazemske antioksidativne aktivnosti,Kreatinin, sečnina, ALT in AST Avtomatski biokemijski analizator BS{{0}} (Mindray, Shenzen, Kitajska) je bil uporabljen za analizo celotne antioksidativne aktivnosti plazme, kreatinina, sečnine, ALT in AST. Določanje skupne antioksidativne aktivnosti plazme. Za določitev antioksidativne aktivnosti plazme smo uporabili metodo prostih radikalov [35]. Ta metoda uporablja sposobnost klorofilina (natrijevo-bakrove soli klorofila), da sprejema in oddaja elektrone, medtem ko stabilno spreminja maksimum absorpcije. Ta proces je pogojen z alkalnim okoljem in dodatkom katalizatorja. Skupaj 200 µL reagenta R1 (0,1 M HCl, ekstrakt klorofilina, reakcijski pufer in katalizator) smo odpipetirali v plastične kivete, nato pa dodali 8 µL vzorca. Absorbanco smo merili 12 minut pri λ=450 nm in za izračun uporabili zadnjo izmerjeno vrednost. Antioksidativno aktivnost smo izračunali iz umeritvene krivulje z uporabo galne kisline kot standarda, rezultate pa smo izrazili kot ekvivalent galne kisline.
Določanje vsebnosti kreatininaPrincip metode je fotometrično določanje barvnega kompleksa kreatinina z alkalnim pikratom, katerega hitrost nastajanja je sorazmerna s koncentracijo kreatinina v vzorcu. Za določanje kreatinina je bil uporabljen diagnostični komplet podjetja Greiner (Greiner GmbH, Pleidelsheim, Nemčija). V kiveto smo odpipetirali skupno 180 µL reagenta R1 (0,16 mM natrijevega hidroksida), čemur je sledil dodatek 10 µL vzorca in 30 µL reagenta R2 (4 mM pikrinske kisline). Absorbanco smo merili šest minut pri λ=505 nm. Za izračun smo uporabili vrednost absorbance samo reagenta R1 z vzorcem in vrednost absorbance po 6 min inkubacije z reagentom R2.
Določanje alanin aminotransferazeZa določanje ALT je bil uporabljen diagnostični komplet podjetja Greiner (Greiner GmbH, Pleidelsheim, Nemčija). Najprej smo v kivete avtomatsko pipetirali 150 µL reagenta R1 (100 mM Tris pufra pH 7,5; 500 mM L-alanina, 1200 U/L laktat dehidrogenaze) in 15 µL vzorca plazme. Nato smo samodejno pipetirali 30 µL reagenta R2 (15 mM 2-oksoglutarata, 0,18 mM NADH) in zmes inkubirali 5 minut. Absorbanca je bila izmerjena pri λ=340 nm. Za izračun smo uporabili vrednosti absorbance samo reagenta R1 z vzorcem in vrednosti absorbance po 5 min inkubacije z vzorcem. Rezultat smo glede na umeritveno krivuljo pretvorili v encimsko aktivnost v µkat/L.
Določanje aspartat aminotransferazeZa določanje AST je bil uporabljen diagnostični komplet podjetja Greiner (Greiner GmbH, Pleidelsheim, Nemčija). Najprej smo v kivete samodejno pipetirali 150 µL reagenta R1 (80 mM Tris pufer pH 7,8, 240 mM L-aspartat, 1200 U/L malat dehidrogenaza) in 15 µL vzorca plazme poskusnih živali. Nato smo izvedli mešanje in inkubacijo pri 37 °C 270 s. Nato smo samodejno pipetirali 30 µL reagenta R2 (15 mM 2-oksoglutarata, 0,18 mM NADH) in zmes inkubirali 5 minut. Absorbanco smo izmerili pri λ=340 nm. Za izračun smo uporabili vrednosti absorbance samo reagenta R1 z vzorcem in vrednosti absorbance po 5 min inkubacije z vzorcem. Rezultat smo glede na umeritveno krivuljo pretvorili v encimsko aktivnost v µkat/L.
Določanje sečnineZa določanje sečnine smo uporabili naslednji postopek: 200 µL reagenta R1 (Tris pufer pH 7,8, ADP, ureaza in GLDH) in 200 µL reagenta R2 (2-oksoglutarat, NADH) smo samodejno pipetirali v kivete, sledil je vzorec volumna 4 µL, nakar je bila mešanica premešana in inkubirana pri 37 ◦C 30 s. Nato smo izmerili absorbanco pri λ=340 nm in po nadaljnjih 60 s ponovno izmerili absorbanco. Za izračun so bile uporabljene vrednosti absorbance po 30 s in po nadaljnjih 60 s. Vrednosti smo odšteli eno od druge in rezultat pretvorili v skladu z umeritveno krivuljo v vsebnost sečnine.
Določanje skupnih beljakovin z biuretno metodoDoločanje skupnih beljakovin z metodo Biuret je podrobno opisano v drugi publikaciji [9]. Skupaj 180 µL reagenta Biuret (15 mM natrijevega kalijevega tartrata, 100 mM NaI, 5 mM KI in 5 mM CuSO4) smo odpipetirali v kiveto, čemur je sledilo 45 µL vzorca. Po desetih minutah inkubacije pri 37 ◦C smo izmerili absorbanco pri valovni dolžini λ=546 nm. Tu gre za reakcijo peptidne vezi s Cu (II) v alkalnem okolju s tvorbo modro-vijolične barve. Za izračun smo uporabili vrednost absorbance samega reagenta in vrednost absorbance po desetih minutah inkubacije z vzorcem.
3.5.2. Določanje superoksid dismutaze (SOD) in katalaze (CAT) Določanje aktivnosti SODZa določanje aktivnosti SOD (SOD, EC 1.15.1.1) je bil uporabljen komercialni komplet (19160 SOD, Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija). Merjenje smo izvajali v plastični kiveti na avtomatskem analizatorju BS 400 (Mindray, Shenzen, Kitajska). Najprej smo v kiveto odpipetirali 200 µL reagenta R1 (20 × pufrsko razredčena raztopina WST) in reagent inkubirali pri 37 °C 108 s (1 min, 48 s). Nato smo pipetirali 20 µL vzorca in pri 378 s (6 min, 18 s) sprožili reakcijo z dodajanjem 20 µL reagenta R2 (167× pufrsko razredčena raztopina encima). Zmes smo inkubirali 72 s (1 min, 12 s) in nato izmerili absorbanco pri λ=450 nm. Kinetiko reakcije smo merili 180 s (3 min) in absorbanco odčitali vsakih devet sekund. Instrument je izračunal povprečno povečanje absorbance na minuto (∆A) in aktivnost SOD izmerjenih vzorcev v skladu z umeritveno enačbo. Rezultati so bili izraženi v U/mL in nato pretvorjeni v mg beljakovin.
3.5.3. Določanje vsebnosti metalotioneinaDoločanje koncentracije metalotioneina v krvi, jetrih inledvicerjavih podgan je bila izvedena s tehniko odstranjevanja adsorpcijskega prenosa (AdTS) z diferencialno pulzno voltametrijo (DPV). Za analizo smo odvzeli 200 µL analiziranega supernatanta in ga v merilni posodi zmešali z 1 800 µL Brdičkovega reagenta, nakar smo izvedli samo elektrokemijsko določitev. Test je bil izveden v skladu s predhodno opisanim protokolom [37]. Uporabljena je bila klasična trielektrodna povezava. Delovna elektroda je bila viseča živosrebrna kapljična elektroda (HMDE) s površino padca 0,4 mm2, medtem ko je bila referenčna elektroda Ag/AgCl/3 M KCl, pomožna pa platinska elektroda. Osnovni elektrolit (1 mmol·L1 [CO(NH3)6]Cl3 in 1 mol·L1 amonijevega pufra; NH3(aq) plus NH4Cl, pH 9,6) smo zamenjali za vsak izmerjen vzorec. Parametri DPV so bili naslednji: začetni potencial 0.7 V, končni potencial 1,75 V, mehurčenje 5 s, čas nanašanja 240 s, čas modulacije 0.0 5 s, intervalni čas 0,25 s, potencialni korak 0,00105 V, hitrost skeniranja 0,0042 V/s in amplituda modulacije 0,02505 V. Določanje MT je bilo izvedeno na merilni napravi, ki jo sestavlja 695 Autosampler, povezan z merilno enoto VA Stand 693 in nadzorovan s krmilno enoto TraceAnalyser 693 VA (vsi Metrohm, Herisau, Švica). Celoten merilni sistem smo ohladili na 4 ◦C z Julabo F25 (Julabo, Seelbach, Nemčija). Dobljene voltamograme smo izvozili v program VA Database 2.2 (Metrohm, Herisau, Švica) in analizirane vzorce deoksigenirali z aktivnim mehurčkom argona s čistostjo 99,999 odstotkov.
3.5.4. Določanje vsebnosti kadmija v krvi, jetrih in ledvicah Razgradnja vzorcev Za razgradnjo jeter inledvicavzorcev, za razgradnjo vzorcev krvi pa je bil uporabljen mikrovalovni ekstraktor Multiwave 3000 (Anton Paar Graz, Avstrija). Mineralizacija je potekala na mokri način z uporabo 65 % dušikove kisline (HNO3 supra pure) (Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija) in 30 % vodikovega peroksida (H2O2 supra pure) (Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija) Skupaj 0,4 g jetra ozledvicavzorec smo stehtali v vrsto teflonskih posod in vzorcu dodali 5 mL 65-odstotne HNO3, 3 mL 30-odstotne H2O2 in 2 mL Milli Q H2O. Posode smo zaprli in instrument zagnali v skladu z navodili proizvajalca. Mikrovalovna razgradnja je trajala 40 minut pri 210 ◦C. Nato smo vzorce ohlajali 45 minut in hranili pri 4 ◦C v PE posodah. Skupno 0,01 g vzorca krvi smo stehtali v niz steklenih posod in vzorcu dodali 300 µL 65-odstotnega HNO3 in 200 µL 30-odstotnega H2O2. Posode smo zaprli in instrument zagnali v skladu z navodili proizvajalca. Mikrovalovna razgradnja je trajala 40 minut pri temperaturi 140 ◦C. Nato smo vzorce ohlajali 45 minut in hranili pri 4 ◦C do določitve z AAS.
Določanje kadmija z atomsko absorpcijsko spektrometrijoKadmij smo določali na napravi Agilent 280/240 Series AA Systems (Agilent Technologies). Jetra inledvicavzorce smo analizirali v plamenu acetilen–zrak (Fa AAS), vzorce krvi pa z elektrotermično atomizacijo (ETA AAS) pri valovni dolžini 228,8 nm. Umeritveni niz s koncentracijami 0–20 µg·L za analize na ETA AAS in 0–10 mg·L1 za Fa AAS je bil pripravljen iz standardne raztopine kadmija (Analytika Praha, Prag, Češka), s koncentracijo 1.000 ± 0,002 g·L1. Sledilo je merjenje raztopin umeritvenih serij in izdelava umeritvenih krivulj, nato pa je bila izvedena mineralizacija krvi, jeter inledvicavzorci so bili izmerjeni.
3.6. Statistična analizaVse meritve so bile izvedene v treh izvodih. Izstopajoče vrednosti so bile identificirane z Grubbsovim testom in izključene (skupaj sta bila ugotovljena dva izstopajoča vrednosti). Pred statistično analizo so bili podatki transformirani z logaritemsko transformacijo in analizirani z enosmerno ANOVA (vsako časovno točko posebej) s Tukey HSD post-hoc testom. Prag statistične pomembnosti je bil nastavljen kot p <>
4. Sklepi
Nedavno je prišlo do farmacevtskega in gospodarskega trenda iskanja novih zdravil med rastlinskimi sekundarnimi metaboliti, ki so snovi, ki lahko pomagajo zaščititi pred vrsto bolezni. Zahvaljujoč pomembnim biološko aktivnim sestavinam, ki jih semena vinske trte vsebujejo v svojem matriksu, se lahko (in se že) uporabljajo v medicinske namene. Znano je, da izvlečki grozdnih pešk ščitijo tkiva pred poškodbami, povezanimi z oksidativnim stresom, ki jih povzroča strupena težka kovina kadmij. Na to zaščito verjetno vpliva fenolna sestava uporabljenih grozdnih pečk. V tej študiji so izvleček grozdnih pečk, pripravljen iz polodporne sorte Cerason s precej visoko vsebnostjo fenolov, testirali glede zaščite pred spremembami, ki jih povzroča kadmij. Preučevani GSE je lahko povečal plazemsko antioksidativno aktivnost, če je bil uporabljen sam, in znižal vsebnost kadmija v jetrih inledvicepodgan pri sočasni uporabi. V skladu s tem se poveča jetrni markerski encim ALT inledvicamarkerja kreatinina, ki ga povzroča kadmij, je GSE upočasnil. Poleg tega je zmanjšanje aktivnosti antioksidativnih encimov SOD in CAT, ki ga povzroča kadmij, upočasnilo sočasno dajanje GSE. Ti rezultati kažejo, da je GSE močno zaščitno sredstvo pred učinki težkih kovin.
