Izvleček Herba Cistanche izboljša stanje mitohondrijskega glutationa in dihanje v podganjih srcih z možno indukcijo odklopnih proteinov

Uvod

Reperfuzija predhodno ishemičnega miokarda povzroči vrsto mitohondrijskih sprememb, vključno s povečano proizvodnjo reaktivnih kisikovih vrst (ROS), Ca2+preobremenitev in upad proizvodnje adenozin trifosfata (ATP), kar lahko vodi do nekroze in/ali apoptoze posredovane celične smrti (Redegeld et al., 1992; Lemasters et al., 1998). Ker imajo mitohondriji ključno vlogo pri določanjuPri določanju usode kardiomiocitov po izzivu ishemije/reperfuzije (I/R), mora biti zaščita pred poškodbo miokarda I/R zato usmerjena v ohranjanje strukturne in funkcionalne celovitosti mitohondrijev. Vzdrževanje metabolizma mitohondrijske energije po izzivu I/R je še posebej pomembno, ker je kontraktilna funkcija srca skoraj v celoti odvisna od ATP, ki ga ustvarijo mitohondriji. Kardiomiociti, ki so živi, ​​a se ne krčijo, so zelo malo uporabni.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA KREPANJE IMUNNOSTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Herba Cistanche, cela posušena rastlinaCistanche deserticolaYC Ma (Orobanchaceae) je parazitska rastlina, ki raste predvsem v puščavskih območjih severne in severovzhodne Kitajske. Herba Cistanche, ki je v kitajski medicini razvrščena kot "jang-poživljajoče" zelišče, se predpisuje za odpoved ledvic, žensko neplodnost in zaprtje, ki izhaja iz suhega črevesja pri senilnih bolnikih (Chen, 1998). Prejšnje študije v našem laboratoriju so pokazale, da metanolizvleček Herba Cistanchepoveča zmogljivost miokardnega ustvarjanja ATP (Leung & Ko, 2008) in ščiti pred miokardnimi I/R poškodbami pri podganah (Leung, 2006). Medtem ko je bila stimulacija zmogljivosti za ustvarjanje ATP vzporedna z izboljšanjem transporta mitohondrijskih elektronov (Leung & Ko, 2008), je bila kardioprotekcija pred poškodbo I/R, ki jo je povzročilo zdravljenje z zdravilom Herba Cistanche, povezana z zmanjšanjem izčrpanosti ATP v miokardu (Leung, 2006). V tej študiji smo za določitev vloge mitohondrijev pri kardioprotektivnem delovanju Herba Cistanche raziskali učinek zdravljenja z Herbo Cistanche na mitohondrijski status glutationa, vsebnost Ca2+, membranski potencial in stopnjo dihanja v srcih podgan. .

Materiali in metode

Zeliščni material

Herba Cistanche je bila kupljena pri lokalnem (Hong Kongu) trgovcu z zelišči (Lee Hoong Kee). Dobavitelj je potrdil pristnost zelišča in vzorec vavčerja (HKUST00301) je bil deponiran na Oddelku za biokemijo Hongkonške univerze za znanost in tehnologijo (HKUST). Izvedena je bila ekstrakcija zelišča z metanolom na podlagi predhodnih študij, ki so pokazale, da je takšen izvleček povečal mitohondrijsko tvorbo ATP in zaščitil pred I/R poškodbami v srcu podgan (Leung, 2006; Leung & Ko, 2008). Na kratko, Herba Cistanche (400 g) je bila narezana na majhne koščke in ekstrahirana s segrevanjem pod refluksom v 300 ml metanola pri 60 stopinjah 2 uri, kot je opisano prej (Leung & Ko, 2008). Postopek smo dvakrat ponovili. Zbrani ekstrakt smo posušili z uparjenjem topila pod znižanim tlakom; izkoristek je bil 42 % (m/m) glede na količino surovega zelišča. Ekstrakt smo do uporabe hranili pri 4 stopinjah. Čeprav se kitajska zelišča za oralno uživanje tradicionalno pridobivajo z vodo, smo v naši prejšnji študiji uporabili metanol zaradi lažje obdelave in shranjevanja vzorcev (Yim & Ko, 2002) in ugotovili smo, da je ekstrakcija metanola v vseh pogledih zadovoljiva.

Nega živali in zdravljenje z zdravili

Odrasle samice podgan Sprague-Dawley (stare 8–10 tednov; 200–230 g) so bile nameščene v prostoru z nadzorovano vlažnostjo, z 12-urnim ciklom temno/svetlo, pri približno 22 stopinjah in dovoljeno hrano in vodo ad libitum. Živali so bile naključno razporejene v različne skupine, s petimi živalmi v vsaki skupini. Podgane so prejeleIzvleček Herba Cistancheintragastrično ({{0}}.2 g/mL v vodi) pri 0.5g/kg ali 1,0 g/kg 3 zaporedne dni. Kontrolne (nezdravljene) živali so prejemale samo vodo. Štiriindvajset ur po zadnjem odmerku je bilo tkivo srčnega ventrikla pridobljeno iz anesteziranih živali za biokemično analizo. Vse eksperimentalne protokole je odobril Odbor za raziskovalno prakso, HKUST.

Priprava mitohondrijskih frakcij

Mleta tkiva srčnega prekata (~{{0}}.6g) smo homogenizirali v 10--kratnem (m/v) presežku ledeno mrzlega saharoznega pufra [0,32 M saharoze, 1 mM etilen diamin tetraocetne kisline (EDTA), 50 mM Tris/HCl; pH 7,4] z uporabo teflonsko-steklenega homogenizatorja pri 4000 obratih na minuto, s 25–30 gibi. Mitohondrijske pelete smo pripravili iz tkivnih homogenatov s centrifugiranjem pri 800 × g pri 4 stopinjah 30 minut, čistost pa smo določili z merjenjem relativnih specifičnih aktivnosti sukcinat dehidrogenaze in laktat dehidrogenaze v supernatantu oziroma peleti, kot je opisano prej (Evans, 1992). Mitohondrijske pelete smo suspendirali v 1 ml homogenizirajočega pufra.

Merjenje mitohondrijskih zmanjšanih ravni glutationa in oksidiranega glutationa

Ravni mitohondrijskega zmanjšanega glutationa (GSH) so bile določene encimsko z uporabo 5,59-ditiobis(2- nitrobenzojske kisline) (DTNB) in glutation reduktaze (GR) v protokolu, spremenjenem po Griffithu (198{{17} }). Alikvot (210 µL) mitohondrijske frakcije smo zmešali z 90 µL 10% (v/v) 5-sulfosalicilne kisline (SSA) in zmes centrifugiramo pri 600 × g 10 minut. Za merjenje ravni oksidiranega glutationa (GSSG) smo 100 µL količine supernatantov SSA zmešali z 10 µL 20 % (w/v) 2-vinilpiridina in 10 µL 60 % (v/v) trietanolamina v epruvetah za mikrofuge. Vsako epruveto smo pustili stati pri sobni temperaturi vsaj 1 uro. Reakcijsko mešanico, ki je vsebovala 0,63 mM DTNB in ​​0,053 mM NADPH (reduciran nikotinamid adenin dinukleotid fosfat) v fosfatnem pufru (0,1 M, s 5 mM Na2 EDTA; pH 7,5), smo predhodno inkubirali pri 30 stopinjah 2 minuti. Alikvot (30 µL) supernatanta vzorca SSA (celotni glutation) ali vzorca GSSG smo dodali v vdolbino 96-mikrotitrske plošče z vdolbinicami in 180 µL predhodno segrete reakcijske zmesi, ki je vsebovala 0,525 U/ mL GR, je bil nato dodan. Spremembe absorpcije pri 412 nm smo spremljali spektrofotometrično 5 minut. Koncentracije GSH in GSSG so bile ocenjene iz umeritvenih krivulj z uporabo GSH in GSSG [raztopljenih v 3 % (w/v) SSA] kot standardov in izražene kot nmol/mg proteina. Ravni GSH so bile ocenjene z odštevanjem dvakratne količine GSSG od skupnega GSH.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA IZBOLJŠANJE SPOLNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Merjenje mitohondrijske vsebnosti Ca2+

Vsebnost Ca{{0}} v mitohondrijih je bila izmerjena z uporabo Ca2+-občutljive fluorescenčne sonde, Fluo-5N AM ester (Molecular Probes, Eugene, OR) z uporabo števca Victor2 Multi-Label Counter (Model 1420; PerkinElmer, Turku, Finska), kot je opisano v Menze et al. (2005). Konstante disociacije Ca2+ (vrednosti Kd) so bile določene s kompletom za umerjanje Ca2+, ki velja v območju koncentracij 1–1000 µM; ocenjene vrednosti Kd so bile 90–100 µM, z visoko zanesljivostjo po podatkih proizvajalca kompleta. Alikvot (25 µL) mitohondrijske frakcije (0,5 mg proteina/mL končne koncentracije) smo zmešali s 25 µL inkubacijskega pufra {100 mM KCl in 30 mM MOPS [3-(N-morfolino)propansulfonska kislina]; pH7,2} v 96-vdolbinici črne mikrotitrske plošče. Zmes smo inkubirali pri 25 stopinjah 15 minut; Nato smo dodali 25 µL digitonina (50 µg/mL) in 25 µL Fluo-5N AM estra (1 µM v 0,005 % (m/v) Pluronic F-127). Z olajšanjem prepustnosti membrane je digitonin posredoval mitohondrijski vstop fluorescenčnega barvila. Ugotovili smo, da so bile ravni Fluo-5N v mitohondrijskih pripravkih podganjega srca 20-krat povečane v prisotnosti digitonina. Reakcijske mešanice smo inkubirali pri 25 stopinjah 30 minut in izmerili fluorescenčne odčitke pri valovni dolžini vzbujanja 488 nm in valovni dolžini emisije 532 nm. Vsebnost Ca2+ v mitohondrijih je bila ocenjena z uporabo umeritvene krivulje in izražena kot µmol/mg proteina.

Merjenje potenciala mitohondrijske membrane

Membranski potencial (ΔΨm) je bil ocenjen z metodo, spremenjeno iz metode Bonavita et al. (2003), z uporabo fluorescenčnega barvila, lipofilne kationske sonde 5,596,69- tetrakloro-1,193,39-tetraetilbenzimidazolilkarbocianin jodida, običajno imenovanega JC-1. Alikvote (50 µL) mitohondrijskih frakcij (prilagojenih na 1 mg proteina/mL) smo inkubirali pri 37 stopinjah s 50 µL raztopine substrata (ki vsebuje 6 mM piruvata in 6 mM malata), 25 µL predhodno obdelane raztopine adenozin difosfata (ADP) (30 mM), in 25 µL 3 µM JC-1, v temi. Vrednosti ΔΨm so bile pridobljene z merjenjem fluorescence pri 535 nm (FL1) v primerjavi s 580 nm (FL2) z uporabo števca Victor2 MultiLabel Counter. JC-1 tvori agregate v mitohondrijih, kar povzroči visoke vrednosti fluorescence FL2 in kaže na normalen mitohondrijski potencial. Izguba ΔΨm povzroči zmanjšanje fluorescence FL2 (agregati JC-1 v manjši meri) in sočasno povečanje fluorescence FL1 (iz monomerov JC-1). Podatki so bili izraženi kot razmerja vrednosti fluorescence FL1/FL2. Za validacijo testa je bil uporabljen karbonil cianid m-klorofenilhidrazon (CCCP), sredstvo za kolapsiranje ΔΨm.

Merjenje mitohondrijskega dihanja

Hitrost mitohondrijske respiracije je bila izmerjena pri 37 stopinjah z uporabo instrumenta Hansatech Oxygraph-Plus, opremljenega s kisikovo elektrodo tipa Clark (Sarasota, FL, ZDA). Mitohondrijske frakcije (0.6 mg proteina/mL) smo suspendirali v dihalnem pufru, ki je vseboval 125 mM KCl, 20 mM MOPS, 10 mM Tris, 0,5 mM etilen glikol tetraocetne kisline (EGTA) in 2 mM KH2PO4; pH 7,2. Po inkubaciji pri 37 stopinjah 2 minuti je vsak vzorec prejel 50 µL raztopine substrata (5 mM piruvata in 5 mM malata). Stopnje dihanja so bile izmerjene v prisotnosti (stanje 3) 1 mM ADP in po fosforilaciji celotnega ADP v ATP (stanje 4). Razmerje med stopnjami dihanja v stanju 3:stanju 4 je indeks dihalne kontrole, ki kaže na tesno povezavo med dihanjem in fosforilacijo (Javadov et al., 2005; Kuwabara et al., 1997). Pred dodajanjem raztopine substrata je bila stopnja dihanja v stanju 1 izmerjena do začetka dihanja v stanju 2, stopnja dihanja v stanju 2 pa je bila ocenjena pred dodatkom ADP.

Statistična analiza

Podatki so bili analizirani z enosmerno analizo variance (ANOVA) za primerjave več skupin. Vrednosti najmanj pomembne razlike (LSD) so bile uporabljene za identifikacijo pomembnih razlik med obema skupinama, ko so bile vrednosti p < 0.05.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA IZBOLJŠANJE SPOLNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Rezultati

Kot je prikazano na slikah 1 in 2, obdelava z metanolomizvleček Herba Cistanche({{0}}.5 ali 1,0 g/kg/dan × 3) znatno izboljša status mitohondrijskega glutationa v srcih podgan, kar dokazujejo od odmerka odvisna zvišanja ravni GSH (11–30 %) in zmanjšanje ravni GSSG (31 %).

Zdravljenje z zdravilom Herba Cistanche je odvisno od odmerka zmanjšalo mitohondrijske ravni Ca2+ v srcih podgan v primerjavi s kontrolnimi skupinami; zatiranje je bilo 41 % pri odmerku 1.0 g/kg (slika 3).

Zdravljenje z zdravilom Herba Cistanche je povečalo mitohondrijski ΔΨm, kar dokazuje zmanjšanje (14–16 %) razmerja FL1/FL2. CCCP (100 µM) je povzročil kolaps ΔΨm, kot kaže povečanje razmerja FL1/FL2 (slika 4).

Zdravljenje Herba Cistancheokrepljeno mitohondrijsko dihanje, kar dokazuje znatno višja stopnja dihanja stanja 3 (84 %) pri poskusnih živalih v primerjavi s kontrolami (tabela 1). Ravni dihanja v stanju 2 in stanju 4 so bile povečane za 47 oziroma 80 %, vendar je bila stimulacija dihanja v stanju 4 popolnoma zatrta z 1 mM gvanozin-5'-difosfata, zaviralca odklopnega proteina 2/3. Zdravljenje z zdravilom Herba Cistanche ni vplivalo na indeks respiratorne kontrole, ocenjen z razmerjem stopenj dihanja v stanju 3/stanje 4.

Diskusija

Mitohondriji, izolirani iz src podgan, zdravljenih z Herba Cistanche, so pokazali izboljšan status glutationa, kar je razvidno iz povečanih ravni GSH in znižanih ravni GSSG. Vzdrževanje mitohondrijskega redoks statusa glutationa je ključnega pomena za kardioprotekcijo pred poškodbo I/R (Chiu & Ko, 2003). Vsebnost Ca2+ v citosolu se poveča med ishemijo miokarda preko privzema Ca2+ uniporterja notranje membrane (Ataka et al., 1992; Grover et al., 1990), kar vodi do mitohondrijskega Ca{{6} } kopičenje. Naši rezultati kažejo, da je zdravljenje z izvlečkom Herba Cistanche izboljšalo mitohondrijski redoks status glutationa in znižalo mitohondrijsko raven Ca2+, kar lahko nudi zaščito pred poškodbo I/R miokarda (Leung, 2006). Nezmožnost zdravljenja z zdravilom Herba Cistanche pri višjem odmerku 1,0 g/kg, da dodatno zniža ravni GSSG in Ca2+, je lahko povezana z obstojem samoomejujočega regulativnega mehanizma, ki vpliva na redoks potencial glutationa in stanje kalcija v mitohondrijih.

Mitohondriji s transportom elektronov ustvarjajo elektrokemični protonski gradient preko notranje membrane. Ta gradient uporablja ATP sintaza za fosforilacijo ADP v ATP. Zmanjšan potencial mitohondrijske membrane, kot pri hipoksiji/reoksigenaciji po poškodbi gojenih kardiomiocitov (Chiu et al., 2008), povzroči zmanjšanje nastajanja ATP. Zdravljenje z zdravilom Herba Cistanche, ki lahko poveča potencial miokardne mitohondrijske membrane, morda poveča nastajanje ATP, zlasti med poishemično reperfuzijo. Spet lahko obstoj samoomejujočega regulacijskega mehanizma pojasni, zakaj učinki zdravljenja z zdravilom Herba Cistanche na potencial mitohondrijske membrane niso odvisni od odmerka.

Zdravljenje z zdravilom Herba Cistanche je močno povečalo stopnjo dihanja v stanju 3 v mitohondrijih srca podgan, kar je bilo ocenjeno s porabo kisika. Ta ugotovitev je skladna z rezultati, pridobljenimi z in vitro in situ meritvami zmogljivosti mitohondrijske generacije ATP (Leung & Ko, 2008). Zanimivo je, da čeprav je zdravljenje z zdravilom Herba Cistanche zmanjšalo raven miokardnega ATP v stanju dinamičnega ravnovesja (podatki niso prikazani), je zdravljenje povečalo nastajanje mitohondrijskega ATP. Vpletenost ločenega dihanja lahko pojasni ta neskladna opažanja. Do nevezane oksidativne fosforilacije pride, ko se protoni premaknejo preko mitohondrijske notranje membrane nazaj v mitohondrijski matriks, s čimer se razprši membranski potencial, ki ga tvori transportna veriga elektronov. Posledica tega je zmanjšanje protonske gibalne sile, ki poganja nastajanje ATP (Garvey, 2003). Posledično sta koncentracija Ca2+ in proizvodnja ROS v mitohondrijih dramatično oslabljena (Teshima et al., 2003). Ta predlog je skladen z rezultati te študije, ki je pokazala zmanjšanje mitohondrijskih ravni Ca2+ v srcih, zdravljenih z Herba Cistanche. Kar zadeva nepovezano dihanje, lahko zdravljenje z zdravilom Herba Cistanche sproži sintezo nevezanih proteinov (UCP). Znano je, da UCP ločijo oksidativno fosforilacijo in izražanje UCP1 v srcih transgenih miši ščiti pred poškodbo miokarda, ki jo povzroči I/R (Hoerter et al., 2004). Ločevalni učinek UCP-jev so zavirali purinski nukleotidni difosfati in trifosfati (kot so ADP, ATP, gvanozin difosfat (GDP) in GTP) (Echtay et al., 2002). V tej študiji so bili mitohondrijski parametri, kot sta membranski potencial in stopnja dihanja, izmerjeni v prisotnosti ADP (kot substrat); ločitveni učinek UCP-jev je bil zato oviran. Ko pa je bila stopnja dihanja mitohondrijev v stanju 4 izmerjena v odsotnosti ADP, je bila ta stopnja višja v mitohondrijih, pripravljenih iz src, zdravljenih z Herba Cistanche, kot v srcih netretiranih kontrolnih oseb. Stopnja dihanja v stanju 4 odraža porabo kisika v mitohondrijih, ko protoni uhajajo nazaj v mitohondrijski matriks prek mehanizma, ki ne vključuje F1 F0 -ATPaze (Garvey, 2003). Možna vpletenost UCP-jev v povečanje dihanja v stanju 4, ki ga povzroča Herba Cistanche, je podprta z ugotovitvijo, da je to izboljšanje zavrl BDP (Bento et al., 2007).

Skratka, zdravljenje z zdravilom Herba Cistanche lahko izboljša stanje mitohondrijskega glutationa, zmanjša mitohondrijsko raven Ca2+ ter poveča potencial mitohondrijske membrane in stopnjo dihanja v srcih podgan. Izboljšanje statusa in funkcionalne sposobnosti mitohondrijskega glutationa ter domnevna indukcija UCP so lahko povezani z zaščito srca, ki jo zagotavljaZdravljenje Herba Cistanchepo I/R poškodbi.

NARAVNI IZVLEČEK RASTLINE CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%