Visok vnos soli in njeni učinki na naravni črevesni mikrobiom pri divjih miših

1. Uvod

Črevesje sesalcev je naseljeno s kompleksno in raznoliko bakterijsko skupnostjo, ki skupaj z gostiteljem ustvarja občutljivo simbiotično razmerje [1,2]. Ta bakterijska skupnost izvaja številne funkcije, ki so koristne za gostitelja, vključno s presnovnimi, imunomodulatornimi in trofičnimi funkcijami [3–7], sestava črevesne mikrobiote pa se lahko med življenjem spreminja v skladu s posebnimi potrebami in fiziologijo gostitelja [1,8, 9]. Številne koristne funkcije črevesnih bakterij, ki spodbujajo zdravje, posredujejo presnovki, pridobljeni iz anaerobne fermentacije [10–13], disbiotična stanja pa lahko pomembno vplivajo na zdravje gostitelja [2,11,14,15]. Naraščajoča zaskrbljenost glede vpliva življenjskega sloga na zdravje je privedla do povečanega znanstvenega zanimanja za vpletenost črevesne mikrobiote in njene translacijske posledice [16,17]. Črevesno mikrobioto dejansko oblikujejo tako zunanji (npr. življenjski slog, prehrana in zdravljenje) kot intrinzični (npr. genetika gostitelja, imunski in presnovni predpisi) dejavniki [8, 18–20]. Splošno priznano je, da lahko zunanji elementi izzovejo vplivne učinke, pri čemer je prehrana eden glavnih dejavnikov, ki prispevajo k vplivanju na sestavo in delovanje črevesne mikrobiote [1,2,21]. Znano je, da zahodne prehranske sestavine, kot je visok vnos soli, škodijo homeostazi gostitelja, saj vplivajo na imunski sistem ter spreminjajo črevesno mikrobioto in bolezni [18, 22–37]. V mikrobioti mišjega črevesja je prehrana z visoko vsebnostjo soli (HSD) povezana z zmanjšanjem bakterij, ki spodbujajo zdravje in so znane kot proizvajalke kratkoverižnih maščobnih kislin (SCFA), kot so Lactobacillus spp., Bifidobacterium, Blautia in Faecalibaculum [28, 29, 38–41], poleg povečanja številčnosti Akkermansia, drugega oportunističnega proizvajalca SCFA, za katerega se je pokazalo, da vpliva na imunost gostitelja in bolezni v različnih modelnih sistemih [42, 43]. Mišji živalski modeli se pogosto uporabljajo za preučevanje, kako lahko prehranski dejavniki oblikujejo črevesno mikrobioto, imunski sistem in bolezen [29, 44–46]. Čeprav je uporaba običajnih laboratorijskih miši (CLM) še vedno veljavna možnost za številne študije, včasih ne uspe pravilno prevesti aplikacij, osredotočenih na črevesno mikrobioto [47–49]. Na primer, pokazalo se je, da imunološke in metabolomične raziskave na mišjih modelih vnetne črevesne bolezni (KVČB) in debelosti slabo napovedujejo translacijske rezultate študij črevesne mikrobiote [50]. To je lahko posledica številnih inherentnih razlik v teh modelnih sistemih, kot so različna anatomija črevesja, genetika in fiziologija [16, 50]. Vendar pa je druga težava pri uporabi CLM za preučevanje interakcij med mikrobioto in imunskim sistemom udomačitev sestave črevesnih bakterij v CLM, kar se odraža v zmanjšanju kompleksnosti in odpornosti črevesne mikrobiote CLM v primerjavi z divjimi mišmi [51]. Potreba po saniranih in nadzorovanih okoljih se sooča z zmanjšano prisotnostjo potencialnih patogenov in parazitov, kar naj bi posledično vodilo do manj "izobraženega" imunskega sistema pri CLM v primerjavi z divjimi mišmi [51–53]. Za reševanje tega problema je bil model divje miši razvit s prenosom zarodkov, pridobljenih iz miši C57BL/6, v divje miši, da bi pridobili črevesno mikrobioto divjega izvora, da bi premagali translacijsko vprašanje študij imunološke črevesne mikrobiote [54]. Nedavne študije, ki vključujejo ta mišji model, so pokazale boljše rezultate pri napovedovanju translacijske vrednosti eksperimentalnih imunoterapij v primerjavi s CLM [54,55]. Poleg tega je bila mikrobiota divjega črevesja bolj odporna in prožna na zdravljenje z antibiotiki in dieto z visoko vsebnostjo maščob v primerjavi s CLM, kar je primerljivo z bolj zapleteno situacijo pri ljudeh [54, 55]. Vendar kljub ugotovljenim učinkom HSD na črevesno mikrobioto, imunski sistem in različne modele bolezni pri CLM učinki visokega vnosa soli na naravno, divje pridobljeno črevesno mikrobioto niso znani. V tej študiji smo ocenili učinek HSD na različne sestave črevesnih bakterijskih ekosistemov in napovedne funkcije CLM v primerjavi z divjimi mišmi.

2. Materiali in metode

2.1. Živali in prehrana

Divje miši C57BL/6 (7–8 tednov stare samice, n=20) so bile kupljene pri Charles River in nastanjene v živalskem obratu Univerze v Hasseltu pod standardiziranimi pogoji. Divje miši (genetsko ozadje C57BL/6, samci n=12 in samice n=11) [54] so bile nameščene v živalskem obratu UHasselta pod standardiziranimi pogoji. Študije na živalih je odobril Etični odbor za poskuse na živalih (ECAE) na univerzi Hasselt (ID201618A4V1, ID202235). Miši so bile nameščene (4 miši/kletko) v sobi z nadzorovano temperaturo (21–23 ◦C) s ciklom svetlobe/temne svetlobe 12:12 h. Naslednje prečiščene diete so bile kupljene pri Ssniff (Soest, Nemčija): 0,5 % NaCl/kontrolna dieta (E15430-04) in 4 % NaCl/HSD (E15431-34). Za HSD so živali hranili z 1 % NaCl v pitni vodi poleg E15431-34, kot je opisano v [28]. Miši CLM so bile enakomerno porazdeljene med kontrolno skupino (n=10) in HSD (n=10). Za divje miši so bili samci in samice prav tako enakomerno porazdeljeni v kontrolnih in HSD prehranskih skupinah (6 samcev za kontrolo, 6 samcev za HSD, 5 samic za kontrolo in 6 samic za HSD).

rastlina cistanche krepi imunski sistem

2.2. Ekstrakcija DNK

Ekstrakcija mikrobne DNA je bila izvedena, kot je opisano v [28], z uporabo spremenjenega protokola QIAmp Fast DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Hilden, Nemčija). Na kratko, fekalne pelete smo dodali v 2-mL Eppendorf, ki vsebuje 0.5 mm steklene kroglice in 1,5 ml liznega pufra (ASL) (Qiagen, Hilden, Nemčija). Za izvedbo mehanske homogenizacije peletov smo uporabili stepanje kroglic. Popolna ekstrakcija je bila izvedena v skladu s protokolom proizvajalca z manjšimi modifikacijami (podaljšanje inkubacijskega časa proteinaze K na 2 uri pri 70 ◦C). Koncentracije DNA so bile ovrednotene s spektrofotometrom NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, ZDA) in shranjene pri –20 ◦C pred pomnoževanjem gena 16S rRNA.

2.3. Pomnoževanje in sekvenciranje gena 16S rRNA

Zaporedje gena 16S rRNA je bilo pomnoženo z uporabo primerja, specifičnega za regijo V4 (F515/R806), kot je opisano prej [56]. Na kratko, 25 ng DNA smo uporabili na reakcijo PCR (30 µL) (KAPA HiFi HotStart ReadyMix, Roche, Basel, CH, ZDA) začetne denaturacije za 30 s pri 98 °C, čemur je sledilo 25 ciklov (10 s pri 98 °C). C, 20 s pri 55 ◦C in 20 s pri 72 ◦C). Reakcije so bile izvedene v treh izvodih, združene na vzorec in očiščene s sistemom za čiščenje na osnovi magnetnih kroglic (Agencourt AMPure XP, Beckman Coulter, Brea, CA, ZDA). Priprava knjižnice je bila izvedena s PCR z omejenim ciklom za pridobitev indeksirane knjižnice z uporabo tehnologije Nextera (Nextera XT Index Kit, Illumina, San Diego, CA, ZDA), čemur je sledil drugi korak čiščenja magnetnih kroglic AMPure XP. Indeksirani vzorci so bili nato normalizirani na isto koncentracijo 4 nM, združeni in sekvencirani na platformi Illumina MiSeq PE300 s protokolom seznanjenega konca 2 × 300 bp v skladu s protokolom podjetja (Illumina, Inc., San Diego, CA, ZDA).

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

Kliknite tukaj za ogled izdelkov Cistanche Enhance Imunity

【Vprašajte za več】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com/Whats App: 0086 18599088692/Wechat: 18599088692

2.4. Obdelava in statistična analiza podatkov sekvenciranja genov 16S rRNA

Neobdelana zaporedja so bila obdelana s cevovodom QIIME 2 [57]. Po filtriranju dolžine in kakovosti (privzeti parametri) so bili odčitki filtrirani in dodeljeni operativnim taksonomskim enotam (OTU) z uporabo DADA2 [58]. Taksonomska dodelitev je bila izvedena z algoritmom VSEARCH (https://github.com/torognes/vsearch; dostop 9. novembra 2022) in bazo podatkov Silva v128 (https://www.arb-silva.de /; dostopano 9. novembra 2{{40}}22). Tabela ASV je bila nato normalizirana z redčenjem na globini 6,147, tako da je vsak vzorec dosegel plato na koncu krivulje redčenja. Raznolikost alfa je bila ocenjena z uporabo dveh različnih metrik: bogastvo OTU (opazovano), ekološki indeksi Chao1, Shannon, Simpson, inverzni Simpson (InvSimpson). Za beta-diverziteto so bile izračunane Bray-Curtisova različnost, Jaccardova podobnost ter utežene in neutežene metrike UniFrac [59] in narisane z analizo načelnih koordinat (PCoA), da se vizualizira dejanska razdalja med vzorci. Za normalizacijo tabele štetja OTU je bilo izvedeno redčenje na globini 6305 sekvenc na vzorec 100-krat. Izhod, pridobljen iz dodelitve taksonomije OTU, kot tabela taksonomije, je bil uporabljen za strnitev normalizirane tabele OTU v tabele za nivoje taksonomije L2 (deblo), L5 (družina) in L6 (rod). Statistične analize so bile izvedene z uporabo R (https://www.R-project.org/; dostopno 25. novembra 2022; različica 4.2.0). Paket R "vegan" (različica 2.6-4) [60] je bil uporabljen za ustvarjanje metrik beta-diverzitete za primerjavo sestavnih razlik skupin s PCoA ali analizo glavnih komponent (PCA). Paketi in ločevanje podatkov so bili testirani s permutacijskim testom s psevdo-F razmerji (funkcija "Adonis" v "vegan"). Ločevanje v smislu beta raznovrstnosti med skupinami je bilo preizkušeno s permutacijsko multivariatno analizo variance z uporabo matrik razdalje (PERMANOVA, funkcija "Adonis" v "vegan"), medtem ko so bile razlike za disperzijo znotraj skupin preizkušene z multivariatnim testom disperzije homogenosti skupin (PERMDISP , funkcija "betadisper" v "vegan"). Iz analize so bili izločeni taksoni, ki niso bili prisotni v vsaj 4 vzorcih. Razlike glede relativne številčnosti taksonov so bile najprej ovrednotene s preliminarnim Kruskal-Wallisovim testom med 4 skupinami in nato nadalje ovrednotene z Wilcoxonovim testom med naslednjimi primerjalnimi pari: CLM Control vs. CLM HSD, divjad Control vs. wildling HSD, CLM Control proti wildling Control, CLM HSD proti wildling HSD. Za ovrednotenje taksonomskih razlik med divjadjo in CLM je bila uporabljena linearna diskriminantna analiza velikosti učinka (LEfSe: https://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/; dostopno 25. novembra 2022) za razlikovanje glavnih značilnosti na ravni rodu [ 61]. Rezultati LEfSe so bili nato prikazani kot palični graf, pri čemer je bil prag ocene linearne diskriminantne analize (LDA) višji od 1,0. Kadarkoli je bilo potrebno, so bile p-vrednosti večkratnih primerjav prilagojene z metodo Benjamini–Hochberg. Stopnja lažnega odkritja (FDR) Manjši ali enak 0,05 je veljal za statistično pomemben: * p Manjši ali enak 0,05; ** p Manjši ali enak 0,01; *** p Manjše ali enako 0,001. Funkcionalne razlike med mikrobiomi z različno vsebnostjo NaCl v hrani (0,5 % in 4 % vsebnost NaCl v hrani) je analiziral PICRUst2, bioinformatični programski paket za napovedovanje funkcionalne vsebnosti metagenoma iz podatkov sekvenciranja genov 16s rDNA (https://huttenhower.sph. harvard.edu/picrust/ dostopno 29. novembra 2022; PICRUSt2 2.4.1) [62]. Cevovod PICRUSt2 je bil uporabljen za reprezentativna zaporedja in njihovo tabelo številčnosti iz DADA2 z uporabo standardnih parametrov (https://github.com/picrust/picrust2/wiki/Full-pipeline-script; dostopno 29. novembra 2022). Iz celotnega izhoda cevovoda je bila metagenomska napoved za poti KEGG Orthology in MetaCyc zgrajena kot tabele, s napovednimi funkcijami kot vrsticami in vzorci kot stolpci, in uporabljena za primerjavo funkcij črevesne mikrobiote pri divjih živalih in CLM pri režimu HSD. Napovedne funkcije mikrobne skupnosti, ki so največ prispevale k variaciji med divjino in CLM po prvi (PC1), drugi (PC2) in tretji glavni komponenti (PC3), so bile izbrane za nadaljnjo analizo pri porabi HSD v obeh modelih. Matriko z številčnostjo napovedne funkcije smo nato normalizirali, transformirali v vrednosti centriranega logaritemskega razmerja (CLR) in izračunali razmerje log2mean (HSD/kontrola) tako za divje živali kot za CLM. Končno so razmerja log2mean primerjali med skupinami z Wilcoxonovim testom in narisali kot klinopis. Razlike med skupinami so statistično primerjali v programski opremi R z uporabo Wilcoxon-test in Kruskal-Wallis testnih funkcij ter vrednosti p, prilagojenih po Holmovi ali Benjamini-Hochbergovi metodi.

3. Rezultati

3.1. HSD vpliva na raznolikost in sestavo CLM in mikrobiote divjega črevesa

Da bi raziskali vpliv HSD na črevesni mikrobni ekosistem divjega izvora pri miših, smo divje miši in CLM hranili HSD ali kontrolne diete. Miši so bile dva tedna na prehranskih režimih in sestava mikrobiote fekalnega črevesa je bila nato raziskana s sekvenciranjem gena 16S RNA iz fekalnih peletov, zbranih 14. dan (slika 1A). V skladu s prejšnjim poročilom niso bile odkrite velike razlike v telesni masi med kontrolnimi in HSD skupinami CLM in divjih miši [29]. Da bi ocenili različno črevesno mikrobioto med obema modeloma CLM in divjimi mišmi na začetku, smo ocenili alfa raznolikost (opazovani ali bogastvo, Chao1, Shannonov, Simpsonov in inverzni Simpsonov indeks), beta raznolikost (Bray-Curtisova različnost) in glavno taksonomske razlike. V skladu s prejšnjimi študijami [54] je mikrobioto divjega črevesja zaznamovala večja mikrobna bogastvo (slika 1B, vsi indeksi alfa raznolikosti), pa tudi izrazita in bolj heterogena mikrobna sestava kot CLM (slika 1C, PERMANOVA p {{9} }.001 & PERMDISP p=0.0009, divji v primerjavi s CLM in slika S1). Kar zadeva mikrobne podpise, so črevesno mikrobioto CLM in divjih miši zaznamovali različni bakterijski taksoni (slika S1). V skladu z Rosshart et al. [54], bakterijski taksoni iz divjih miši pripadajo Intestinomonas, Desulfovibrio, Tuzzerella, Oscillobacter, Orodibacter in patogenemu rodu Helicobacter, ki je zaznamoval divje pridobljen neudomačen profil tega modela (slika S1).

Slika 1. Vpliv HSD na bakterijsko sestavo CLM (n=10/skupino) in divjih miši (n=11 za divje Ctrl in n=12 za divje HSD). (A) Eksperimentalna zasnova. C57BL/6 CLM ali divje miši so hranili s 0.5% NaCl (kontrola, Ctrl) ali visoko soljo s 4% NaCl (HSD) in črevesno bakterijsko skupnost črevesja, za katero je značilno sekvenciranje pomnoževanja gena 16S rRNA. (B) Indeksi za alfa raznolikost mikrobiote fekalnega črevesa CLM in divjadi; od leve proti desni so prikazani naslednji indeksi: opazovano (BOGASTVO OUT), Chao1, Shannon, Simpson, Simpson (inverzni Simpson). Razlike med skupinami so statistično ovrednotene z Wilcoxonovim testom. (C) Graf glavne koordinatne analize ordinacije beta raznolikosti iz metrike različnosti Bray-Curtis med CLM v primerjavi z divjim (zgoraj), nadzorom CLM v primerjavi s CLM HSD (spodaj levo) in nadzorom divjih živali v primerjavi z divjim HSD (spodaj desno); ločitev in homogenost med skupinami sta bili izračunani s testoma PERMANOVA oziroma PERMDISP. * p Manjše ali enako 0.05; ** p Manjše ali enako 0.01; **** p Manjše ali enako 0.0001. Slika 1. Vpliv HSD na bakterijsko sestavo CLM (n=10/skupino) in divjih miši (n=11 za divje Ctrl in n=12 za divje HSD). (A) Eksperimentalna zasnova. C57BL/6 CLM ali divje miši so bile hranjene z 0,5 % NaCl (kontrola, Ctrl) ali visoko soljo s 4 % NaCl (HSD) in črevesje črevesne bakterijske skupnosti, označeno s sekvenciranjem amplikona gena 16S rRNA. (B) Indeksi za alfa raznolikost mikrobiote fekalnega črevesa CLM in divjadi; od leve proti desni so prikazani naslednji indeksi: opazovano (BOGASTVO OUT), Chao1, Shannon, Simpson, Simpson (inverzni Simpson). Razlike med skupinami so statistično ovrednotene z Wilcoxonovim testom. (C) Graf glavne koordinatne analize ordinacije beta raznolikosti iz metrike različnosti Bray-Curtis med CLM v primerjavi z divjim (zgoraj), nadzorom CLM v primerjavi s CLM HSD (spodaj levo) in nadzorom divjih živali v primerjavi z divjim HSD (spodaj desno); ločitev in homogenost med skupinami sta bili izračunani s testoma PERMANOVA oziroma PERMDISP. * p Manjše ali enako 0,05; ** p Manjši ali enak 0,01; **** p Manjše ali enako 0,0001.

HSD je povzročil znatno zmanjšanje bakterijske raznolikosti (slika 1B, vsi indeksi alfa raznolikosti) kot tudi pomemben mikrobni premik v sestavi CLM (slika 1C, PERMANOVA p=0.001, PERMDISP p=0 .1, CLM Ctrl v primerjavi s CLM HSD). V nasprotju s tem je bila črevesna mikrobiota divjih miši značilna večja raznolikost pri HSD (slika 1B, opazovani in Chao1 indeksi), ki se razlikuje od CLM, zanje pa je bil značilen tudi manj izrazit premik mikrobne sestave pri HSD v primerjavi s CLM (slika 1C, PERMANOVA p=0.001, PERMDISP p=0.5, divji Ctrl v primerjavi z divjim HSD).

3.2. Črevesna mikrobna sestava divjih miši je bolj odporna na HSD kot CLM

Razlike v sestavi bakterij med divjino in CLM so bile dodatno taksonomsko opredeljene. Na ravni debla so bili najpogostejši deli glede na relativno številčnost: Firmicutes (CLM: 52 ± 12 %, divji: 32 ± 34 %), Bacteroidota (CLM: 24 ± 23 %, divji: 57 ± 19 %), Actinobacteriota (CLM: 1{{10}} ± 7 %, divje: 0,7 ± 1,3 %) in Verrucomicrobiota (CLM: 24 ± 23 %, divje: 0 %/ni zaznano) (slika 2). Profil črevesnih mikrobov je pokazal nadaljnje različne abundance za vse vrste, odkrite v fekalnih vzorcih med divjimi mišmi in CLM (slika 2). Zlasti jedro mikrobiote phyla Firmicutes, Bacteroidota in Verrucomicrobiota so se bistveno razlikovale med obema modeloma (slika 2). Natančneje, na družinski ravni so opazili drugačen prispevek pri črevesni mikrobioti divjadi v primerjavi s črevesno mikrobioto CLM za večino bakterij, za katere so prej poročali, da so občutljive na HSD [28], vključno z Lactobacillaceae, Clostridiaceae, Peptostreptococcaceae in Akkermansiaceae (slika 3). V skladu s tem so bili podobni trendi potrjeni na ravni rodu med vzorci divjadi in CLM za glavne člane zgoraj omenjenih družin; med temi so bili najbolj reprezentativni Lactobacillus, Roseburia, Tuzzerella, Faecalibaculum in Akkermansia (sliki S1 in 4). Za nadaljnjo opredelitev vpliva HSD na sestavo mikrobiote CLM in črevesja divjadi smo analizirali tudi vpliv prehranskega režima na različnih ravneh klasifikacije. Na ravni debla je bila črevesna mikrobiota CLM, zdravljena s HSD, značilna znatno zmanjšanje Firmicutes in obogatitev Verrucomicrobiota (slika 2), vendar HSD v vzorcih divjadi ni prizadel nobene od glavnih debel (slika 2). Na družinski ravni je bilo za črevesno mikrobioto CLM značilno znatno zmanjšanje bakterij, ki proizvajajo mlečno kislino, kot je Lactobacillaceae, pa tudi proizvajalcev SCFA, kot sta Peptostreptococcaceae in Clostridiaceae (slika 3). Poleg tega smo pri CLM, hranjenem s HSD, opazili povečanje Akkermansiaceae, Sutterellaceae, Defluvitaleaceae in Eggerthellaceae (slika 3). Nasprotno pa je HSD prizadel različne družine bakterij v mikrobioti divjega črevesja, med njimi dve zelo razširjeni Muribaculaceae in Prevotellaceae, ki sta bili povečani ob HSD (slika 3). Bakterijska modulacija, ki je najbolj prispevala k HSD-učinku v CLM, je vključevala povečanje rodov Akkermansia, Parasutterella in Enterorhabdus, kot tudi zmanjšanje Lactobacillus, Roseburia, Tuzzerella, (Eubacterium) oxidoreducens skupine, Muribaculum in Anaervorax (slika 4). Razen Roseburia noben od zgoraj omenjenih rodov ni bil prizadet zaradi HSD v mikrobioti divjega črevesja, medtem ko je rod Anaerovorax pokazal nasprotno težnjo kot pri CLM (slika 4).

Slika 2. Učinek HSD na bakterijsko vrsto črevesne mikrobiote CLM (n=10/skupino) in divjih miši (n=11 za divje Ctrl in n=12 za divje HSD). Celotna sestava v smislu relativne številčnosti filu je prikazana s stolpčnim grafom za vsakega posameznika (zgoraj) in škatlastim grafom za določeno filo (spodaj); statistične primerjave so bile izvedene med skupinami z Wilcoxonovim testom. * p Manjše ali enako 0.05; ** p Manjše ali enako {{10}},01; *** p Manjše ali enako 0,001; **** p Manjše ali enako 0,0001.

Slika 3. Vpliv uživanja hrane z visoko vsebnostjo soli na družine bakterij CLM (n=10/skupino) in divje miši (n=11 za divje Ctrl in n=12 za divje HSD). Celotna sestava na ravni družine je predstavljena s črtastim prikazom za vsakega posameznika (zgoraj) in okvirnim prikazom za določene družine (spodaj); statistične primerjave so bile izvedene med skupinami z Wilcoxonovim testom. * p Manjše ali enako 0.05; ** p Manjše ali enako {{10}},01; *** p Manjše ali enako 0,001; **** p Manjše ali enako 0,0001.

Slika 4. Spremembe bakterijskih rodov pri CLM (n=10/skupina) in divjih miših (n=11 za divje Ctrl in n=12 za divje HSD). Skupni relativni prispevek številčnosti na ravni rodu je narisan kot krožni palični grafikon za vsakega posameznika (na vrhu) in kot okvir za določene rodove (spodaj); statistične primerjave so bile izvedene med skupinami z Wilcoxonovim testom. * p Manjše ali enako 0.05; ** p Manjše ali enako 0.01; *** p Manjše ali enako 0,001; **** p Manjše ali enako 0,0001.

3.3. HSD vpliva na napovedne mikrobne funkcije pri CLM, vendar ne pri divjih miših

Izhod PICRUSt 2 ni zaznal nobene pomembne razlike med funkcijami mikrobne skupnosti divjih HSD v primerjavi z nezdravljenimi divjimi mišmi tako za opombe poti KEGG Orthology kot MetaCyc, z edino izjemo povečane funkcije gena recG, ki jo povzroči HSD za ATP-odvisno helikazo iz ortologijo KEGG (slika 5A). Za vpliv HSD na CLM je bilo značilno znatno zmanjšanje napovednih funkcij za KEGG Orthology, med njimi gena spp (saharoza-6-fosfataza) in pfkA (fosfofruktokinaza 1), oba vključena v presnovo škroba in saharoze, kar je v skladu s prejšnjimi ugotovitvami [28] (slika 5A). Poleg tega so za črevesno mikrobioto CLM, hranjenega s HSD, značilne zmanjšane napovedne funkcije genov, vključenih v membranski transport (feoB za transport železa, AB 2P AB 2 permeazni protein, AB 2A AB 2 vezavni protein ATP), biosinteza glutamina (glnA) , transkripcijski regulator družine LacI (lacI, galR) in transketolaza (tktA, tktB) (slika 5A). Za poti MetaCyc je HSD znatno obogatil črevesno mikrobioto CLM za napovedne funkcije, povezane z zmanjšanjem nitratov (denitrifikacijska pot), razgradnjo galaktoze (razgradnja D-galaktarata, super pot razgradnje D-glukarat in D-galaktarat), razgradnjo fenil-propanoata, maščobno kislinsko reševanje, razgradnja sukcinata v butanojsko kislino in razgradnja aminokislin (razgradnja aromatskega amina, razgradnja L-levcina) (slika 5B). Poleg tega je v skladu s prejšnjimi ugotovitvami [28] črevesna mikrobiota HSD v CLM izgubila napovedne funkcije za biosintezo aminokislin (super pot biosinteze L-alanina, biosinteza L-lizina), mešano kislo fermentacijo, z izgubljenim dodatnim novim podpisom, kot je N- razgradnja acetilglukozamina/N-acetil-manozamina/N-acetilnevraminata in razgradnja deoksiribonukleozidov (razgradnja pirimidina in purina, biosinteza inozin-5-fosfata III) (slika 5B).

Slika 5. Nadaljevanje

Slika 5. Vpliv HSD na napovedne metagenomske funkcije črevesja v črevesni mikrobioti CLM (n=10/skupina) in divji (n=11 za divji HSD Ctrl in n=12 za divji HSD). Izhod PICRUSt2, narisan kot klinopis za opombo ortologije KEGG (A) in poti MetaCyc (B), izražen kot povprečno razmerje log2 štetja napovednih funkcij med vzorci HSD in Ctrl. Vse statistične primerjave so bile izvedene med skupinama Ctrl proti HSD z Wilcoxonovim testom.

4. Razprava

Znano je, da je zapletena in raznolika črevesna mikrobiota divjih živali bolj odporna na nekatere modele bolezni [51] in prehranske režime, kot je vnos velike količine maščob [54, 55]. Vendar nobena predhodna študija ni ocenila učinkov visokega vnosa natrija na črevesno mikrobioto mišjega divjega izvora. Tukaj smo prvič raziskali, kako HSD vpliva na mikrobioto divjega črevesja v primerjavi s CLM. Zanimivo je, da so naši rezultati pokazali, da je v primerjavi s CLM divji mikrobiom bolj odporen na motnje HSD tako na sestavni kot na napovedni funkcionalni ravni. Ugotovljeno je, da lahko visok vnos soli poveča tveganje za različne bolezni, kot so srčno-žilne ali avtoimunske bolezni, s spreminjanjem sestave črevesnega mikrobioma in imunske homeostaze [25, 29, 31, 34, 63–65]. V skladu s prejšnjimi poročili so za HSD-inducirane premike v črevesni mikrobioti v CLM značilne znatne spremembe v mikrobni raznolikosti, sestavi in ​​napovednih funkcijah [28]. Bakterije, ki spodbujajo zdravje, kot so družina Peptostreptococcaceae in rodovi Lactobacillus, Roseburia in Tuzzerella, so se zmanjšale v smislu relativne številčnosti v CLM, medtem ko se je Akkermansia znatno povečala v skupinah, hranjenih s HSD. Zaznali smo tudi višje relativne številčnosti HSD pri Defluvitaleaceae, Enterorhabdus in Parasutterella. Zanimivo je, da je rod Parasutterella osrednja sestavina črevesne mikrobiote tako CLM kot ljudi, kjer se obnaša kot asaharolitik in proizvajalec sukcinata [66]. Znano je, da sta Enterorhabdus iz družine Eggerthellaceae in Parasutterella iz družine Sutterellaceae obogatena pri bolnikih s KVČB [67,68], kar dodatno kaže, kako lahko HSD vpliva na razvoj bolezni. Zanimivo pa je, da divje miši niso pokazale podobne entitete mikrobnih premikov, ki jih povzroča HSD, kot je CLM. Kljub temu se je raznolikost divjih živali znatno povečala na HSD za opazovane meritve OTU in Chao1 in le nekaj taksonov je bilo vključenih v motnje HSD črevesne mikrobiote divjih živali, med njimi povečanje Anaervorax, skupaj z zmanjšanjem Erysipelatoclostridium, Roseburia in Lachnospiraceae UCG-004 rod. Roseburia je bil edini bakterijski podpis, ki je bil običajno deljen med skupinami HSD v primerjavi z ustreznimi kontrolami, kljub temu, da je CLM, hranjen s HSD, še vedno značilen po večji številčnosti te bakterije v primerjavi z divjimi mišmi, hranjenimi s HSD. Opozoriti je treba, da je bilo dokazano, da imajo bakterije, ki proizvajajo butirat, kot je Roseburia, manjšo relativno številčnost pri bolnikih z ulceroznim kolitisom [69], to zmanjšanje pa je bilo tudi povezano z genetskim tveganjem za KVČB pri ljudeh [70]. To je v skladu s prejšnjimi ugotovitvami, kjer je bilo ugotovljeno, da so premiki bakterijskih rodov, kot sta Roseburia ali Lactobacillus, povezani s tveganjem za hipertenzijo, ki jo verjetno spodbuja zahodna prehrana [71]. Bakterijska sestava črevesja je povezana tudi s črevesno gibljivostjo in fiziologijo [72].

koristi cistanche za moške - krepitev imunskega sistema

Rod Anaerovorax je bil predhodno opažen pri miših z nenormalno fiziologijo črevesja in zmanjšano gibljivostjo [73]; vendar lahko obogatitev Anaervoraxa v HSD za divje miši vodi do drugačne vloge tega taksona v kontekstu črevesne homeostaze in pravilnega delovanja. V skladu s prejšnjimi ugotovitvami smo opazili povečanje rodu Akkermansia v skupini HSD CLM [28], medtem ko je bila črevesna mikrobiota divjih miši osiromašena za ta rod, kar je tudi skladno s prejšnjimi študijami na tem modelu [51, 53–55]. Čeprav je rod Akkermansia potencialni probiotik zaradi njegovega pozitivnega učinka na izboljšanje imunoloških in presnovnih profilov gostitelja (npr. pri debelosti in sladkorni bolezni tipa 2) [42,74–77], je vloga tega rodu še vedno nejasna zaradi njegove negativne korelacija s kliničnimi rezultati pri kolorektalnem raku [78], Parkinsonovi bolezni [79,80] in bolnikih z multiplo sklerozo [81]. V skladu z našimi prejšnjimi rezultati, pridobljenimi s potmi MetaCyc [28], je CLM na HSD pokazal zmanjšane napovedne mikrobne funkcije, povezane s presnovo škroba in saharoze za ortologijo KEGG. Vendar pa manjši premiki v sestavi črevesnih bakterij divjih miši, hranjenih s HSD, niso povzročili nobenih pomembnih sprememb v napovednih bakterijskih funkcijah, kar kaže, da so črevesna mikrobiota in presnovna/ekološka omrežja, pridobljena iz divjih živali, veliko bolj stabilna in se lahko veliko lažje prilagodijo Prehranske razlike, ki jih povzroča HSD, v primerjavi s črevesnimi ekosistemi CLM, kar zahteva nadaljnje preiskave. Omeniti velja tudi možen vpliv črevesne glivične skupnosti na mrežo črevesnih bakterij pri različnih prehranskih režimih. Prejšnje študije so že pokazale, kako so potencialne interakcije med bakterijami in glivami vpletene v homeostazo imunskega sistema gostitelja in razvoj bolezni [82–85]. V tem kontekstu je CLM dodatno omejen z njihovo nižjo kompleksnostjo bakterij v primerjavi z divjimi mišmi, kar lahko ovira vzpostavitev raznolike črevesne mikobiote [54]. Prihodnje študije bodo lahko določile prispevek črevesnih glivičnih skupnosti v nastavitvah črevesne mikrobiote in imunosti gostitelja z uporabo divjega modela. Če povzamemo, naša študija zagotavlja podatke o tem, kako visok vnos natrija vpliva na naravni črevesni mikrobni ekosistem, pridobljen iz divjine, v primerjavi z udomačeno skupnostjo črevesnih bakterij CLM. Naša študija je pokazala, da HSD ne vpliva na bakterijske taksone in črevesno mikrobioto pri divjih miših na enak način kot pri udomačeni črevesni mikrobioti iz CLM. Ta razlika, kot je bilo že navedeno za druge prehranske režime ali stanja, kot so diete z visoko vsebnostjo maščob [54, 55], kaže, da so potrebne prihodnje raziskave naravnih sistemov mišjih modelov za povzetek in oceno vpliva prehranskih posegov na kompleksnejše črevesne ekosisteme, kot pri ljudeh.

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema