Visoko občutljiva in ekološko trajnostna metoda HPTLC z reverzno fazo za določanje hidrokinona v komercialnih belilnih kremah

Kontakt:ali.ma@wecistanche.com

Mohammed H. Alqarni 1, Prawez Alam 1, Faiyaz Shakeel 2, Ahmed I. Foudah 1 in Sultan Alshehri 2,*

Povzetek: hidrokinon(HDQ) je naravno sredstvo za depigmentacijo, ki se običajno uporablja v pripravkih za toniranje kože. Varnost in okolju prijaznost analitičnih metod kvantifikacije HDQ v prejšnji literaturi nista bili upoštevani. Zato je bil vzpostavljen zelo občutljiv in ekološko bolj okolju prijazen test na osnovi tankoplastne kromatografije visoke ločljivosti z reverzno fazo (RP-HPTLC) za oceno HDQ v štirih različnih komercialnihbeljenjekreme (CWC). Binarno zmes etanol-voda(60:40, v·v−1) je bila uporabljena kot sistem zelenega topila. Ocena HDQ je bila izvedena pri 291 nm. Trenutni test na osnovi RP-HPTLC je bil linearen v območju 20–2400 ng pas-1. Sedanja analitična metoda je bila zelo občutljiva na podlagi podatkov o detekciji in kvantificiranju. Za določitev HDQ so bili primerni tudi drugi validacijski parametri, kot so točnost, natančnost in robustnost. Največje količine HDQ so bile pridobljene v CWC A (1,23 odstotka w·w-1), sledijo CWC C (0,81 odstotka w·w-1), CWC D (0,43 odstotka w·w-1) in CWC B (0,37 odstotka w· w−1). Ocena analyticalGREEnness (AGREE) za sedanjo analitično metodo je bila ocenjena na 0,91, kar kaže na odlične bolj zelene lastnosti sedanjega testa RP-HPTLC. Ti rezultati kažejo, da je sedanja analitska metoda zelo občutljiva in ekološko trajnostna za kvantitativno določanje HDQ v komercialnih formulacijah.

Ključne besede:strinjam se;hidrokinon; ekološko trajnostna RP-HPTLC; validacija

Izvleček Cistanchelahko lovijo proste radikale in preprečujejo kopičenje tirozinaze.

Kliknite zaCistanche učinki za beljenje

1. Uvod

hidrokinon(HDQ) je naravna spojina, ki je prisotna v več komercialnih formulacijah za toniranje kože za zdravljenje melazme (bolezen, ki jo povzroča prekomerno kopičenje melanina v človeški koži) [1,2]. Je močno sredstvo za depigmentacijo in se uporablja kot alternativa tirozinazi [3]. Je eno najpogosteje uporabljenih sredstev pri zdravljenju hiperpigmentacije človeške kože [4,5]. Učinkovita koncentracija HDQ v komercialnih formulacijah za toniranje kože se giblje od 1,5 do 2.0 odstotka w·w−1[6]. Visoka koncentracija HDQ (nad 5 odstotkov w·w−1) povzroča lokalno draženje in levkodermo na človeški koži [5,6]. Zaradi njegovih kontroverznih stranskih učinkov so številne države prepovedale HDQ kotbeljenjesredstvo v lokalnih formulacijah [7]. Kljub temu je več kliničnih raziskav pokazalo različne zaščitne učinkeHDQpri obvladovanju različnih kožnih hiperpigmentnih motenj, kot so melazma, pege, lentigini itd. [8,9]. Ob upoštevanju tako koristi kot tveganj HDQ je potrebna njegova kvantitativna analiza v različnih komercialnih formulacijah za toniranje kože.

Za kvantifikacijo HDQ se uporabljajo različni farmacevtski testi, bodisi sami bodisi v kombinaciji z drugimibeljenjesnovi v trženih belilnih kremah (CWC). Za kvantitativno analizo HDQ v komercialnih izdelkih za beljenje (CWP) in farmacevtskih pripravkih so bili dokumentirani različni testi, ki temeljijo na ultravijolični (UV) spektrometriji [10–13]. Dokumentiran je širok nabor testov na osnovi tekočinske kromatografije visoke ločljivosti (HPLC) za določanje HDQ skupaj z njegovimi etri v različnih CWC in CWP [14–23]. Uveljavljene so bile tudi različne voltametrične metode za hkratno določanje HDQ in njegovih etrskih derivatov v CWP [24–29]. ZaHDQanaliza skupaj z njegovimi etrskimi derivati ​​in drugimbeljenjeagentov v CWP. Za analizo HDQ so poročali tudi o nekaterih elektrokemičnih nanosenzorjih [34,35]. Naša raziskovalna skupina je za kvalitativno in kvantitativno analizo HDQ v CWC uporabila tudi eno samo metodo, ki temelji na tankoplastni kromatografiji visoke ločljivosti (HPTLC) [1].

Po izčrpni analizi prijavljenih esejev o analizi HDQ je bilo ugotovljeno, da varnost in ekološka trajnost farmacevtskih metod v literaturi nista bili ocenjeni ali upoštevani pri vrednotenju. Poleg tega zeleni/ekološko trajnostni testi HPTLC z reverzno fazo (RP-HPTLC) še niso bili uporabljeni za ocenoHDQv svojih CWC. Ekološko trajnostni/zeleni testi na osnovi HPTLC ponujajo številne prednosti, kot so preprostost, ekonomičnost, nizki stroški delovanja, kratek čas analize, vzporedna analiza več vzorcev, jasnost odkrivanja in zmanjšanje toksičnosti za okolje v primerjavi s HPLC in drugimi analitičnimi metodami [36–39]. V skladu s tem je bila za to študijo izbrana metoda RP-HPTLC za določanje HDQ. Za oceno profila zelenega stanja farmacevtskih testov se uporabljajo različni pristopi [38–43]. Kljub temu samo analitični metrični pristop GREEnness (AGREE) uporablja vseh 12 načel zelene analitične kemije (GAC) za oceno okolju prijaznosti [42].

Pristop metrike AGREE je bil uporabljen za oceno zelene vrednosti sedanje metode RP-HPTLC [42]. Zato je bilo to delo opravljeno za razvoj zelo občutljive in zelene/ekološko trajnostne metode RP-HPTLC za ocenoHDQv štirih različnih CWC. Profil zelene barve trenutne metode RP-HPTLC je pridobil AGREE: analitični kalkulator zelene barve. Ta analitični test za analizo HDQ je bil potrjen v skladu s smernicami Mednarodnega sveta za harmonizacijo (ICH) Q2 (R1) [44].

2. Materiali in metode

2.1. Materiali

Referenčni standard HDQ (čistost: 99 odstotkov) je bil nabavljen pri Fluka Chemica (Darmstadt, Nemčija). Metanol (MeOH) in etanol (EtOH) stopnje HPLC sta bila nabavljena pri Alfa Aesar (Tewksbury, MA, ZDA). Voda stopnje HPLC (H2O) je bila zbrana iz sistema za čiščenje vode Milli-Q (E-Merck, Darmstadt, Nemčija). Druga uporabljena topila in reagenti so bili analitske kakovosti. Štiri različne CWC HDQ so bile pridobljene s farmacevtskega trga v Al-Kharju v Savdski Arabiji v mesecu juniju 2021. CWC izHDQje bil pred začetkom poskusov shranjen v hladnem in temnem prostoru pri 22 ◦C. CWC so bili shranjeni približno en mesec pred začetkom poskusov.

2.2. Kromatografija

Kvantifikacija HDQ z denzitometrijo RP-HPTLC v njegovem referenčnem standardu in štirih različnih CWC je bila izvedena z uporabo instrumenta HPTLC (CAMAG, Muttenz, Švica). Kvantitativna analiza HDQ je bila izvedena na 10 × 20 cm2 ploščah s stekleno podlago, predhodno prevlečenih z RP silikagelnimi ploščami 60 F254S (E-Merck, Darmstadt, Nemčija). Vzorci na ploščah TLC so bili opaženi kot 6 mm trakovi z uporabo avtomatskega vzorčevalnika 4 (ATS4) aplikatorja (CAMAG, Ženeva, Švica). Aplikator vzorca je bil opremljen z mikrolitrsko brizgo CAMAG (Hamilton, Bonaduz, Švica). Stopnja uporabe za kvantitativno analizoHDQje bila konstantna pri 150 nL s−1. Plošče so bile razvite v avtomatski razvijalni komori 2 (CAMAG, Muttenz, Švica) na razdalji 80 mm. Sistem zelenega topila za analizo HDQ je bil EtOHH2O (60:40, v·v−1). Razvijalno komoro smo predhodno nasičili s hlapi mobilne faze 30 minut pri 22 ◦C. HDQ je bil zaznan pri 291 nm. Dimenzije reže so bile 4 × 0,45 mm2, hitrost skeniranja pa 20 mm s-1. Vsak poskus je bil izveden v trojniku. Za obdelavo podatkov je bila uporabljena programska oprema WinCATs (v. 1.4.3.6336, CAMAG, Muttenz, Švica).

2.3. Kalibracijska krivulja HDQ in priprava vzorcev za nadzor kakovosti

Navedeno količino HDQ (10 mg) smo razdelili v 100 mL EtOH-H2O (60:40, v·v-1) zelenih sistemov topil, da smo dosegli osnovno raztopino s koncentracijo 100 µg mL-1. Različne količine osnovnih raztopin smo dodatno razredčili z uporabo sistemov EtOH-H2O (60:40, v·v−1), da smo dosegli koncentracije HDQ v območju 20–2400 ng pas−1. Dobljene rešitveHDQki so vsebovale različne koncentracije, so bile označene na ploščah HPTLC. Območje vrha HPTLC za HDQ je bilo pridobljeno za vsako raztopino HDQ z uporabo tega farmacevtskega testa. Umeritvena krivulja HDQ je bila ustvarjena z risanjem koncentracij HDQ glede na območje HPTLC. Poleg tega trije različni vzorci za nadzor kakovosti (QC), kot so vzorci nizkega QC (LQC; 20 ng pas-1), srednjega QC (MQC; 600 ng pas-1) in visokega QC (HQC; 2400 ng pas-1). , so bili pridobljeni ločeno, da bi določili različne validacijske parametre za ta farmacevtski test.

2.4. Obdelava vzorcev za določanje HDQ v CWC

HDQ je bil ekstrahiran iz štirih različnih CWC s sprejetjem postopka, navedenega v literaturi [1]. Natančno stehtane (5.0 g) količine štirih različnih CWC, vključno z A, B, C in D, so bile ločeno prenesene v lij ločnik. Vsak CWC je bil stresan v liju ločniku z MeOH (3 × 70 mL) 30 minut pri 22 °C. Ekstrakti MeOH iz vsakega CWC so bili združeni in ločeno uparjeni do suhega pod znižanim tlakom z uporabo rotacijskega vakuumskega uparjalnika. Dobljene ostanke smo rekonstituirali z 10 mL MeOH in shranili v hladilniku do nadaljnjega vrednotenja. Dobljene vzorce smo podvrgli analizi HDQ z uporabo te analitske metode pri 291 nm.

2.5. Validacijski parametri

Sedanji test RP-HPTLC za analizo HDQ je bil validiran za različne validacijske parametre z upoštevanjem smernic ICH-Q2 (R1) [44]. TheHDQlinearnost je bila ovrednotena z risanjem koncentracij HDQ glede na njegovo izmerjeno površino vrha. Linearnost HDQ je bila ovrednotena pri 11 različnih vzorcih QC z 20, 40, 60, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 1200 in 2400 ng pasom-1 za ta farmacevtski test. Parametri učinkovitosti sistema za to analitično metodo so bili ovrednoteni glede na faktor zaostanka (Rf), faktor asimetrije (As) in število teoretičnih plošč na meter (N m−1). Rf, As in N m-1 so bili pridobljeni pri MCQ (600 ng pas-1), kot je bilo že navedeno v literaturi [45].

Natančnost za sedanjo metodo RP-HPTLC je bila določena kot odstotek izkoristka. Odstotek izkoristka je bil dosežen pri LQC (20 ng pas-1), MQC (600 ng pas-1) in HQC (2400 ng pas-1) za sedanjo analitično metodo.

Natančnost za sedanjo analitično metodo je bila ovrednotena kot intra/meddnevna natančnost. Natančnost znotraj dneva je bila določena z analizo HDQ pri LQC, MQC in HQC na isti dan za ta analitični test. Meddnevna natančnost je bila določena z analizo HDQ pri LQC, MQC in HQC v treh različnih dneh za sedanji analitični test [44]. Vsaka natančnost je bila izmerjena šestkrat (n=6).

Robustnost je bila ovrednotena z uvedbo nekaterih majhnih sprememb v sistemih zelenih topil za sedanjo metodo RP-HPTLC. Za oceno robustnosti je bil prvotni sistem topil EtOH H2O (60:40, v·v−1) spremenjen v EtOH-H2O (62:38, v·v−1) in EtOHH2O (58:42, v·v−1). ) sisteme topil, specifični odziv HPTLC in vrednosti Rf pa so bile zabeležene in interpretirane [44].

Občutljivost za to analitično metodo je bila ocenjena kot meje zaznavanja (LOD) in kvantifikacije (LOQ) z uporabo metode standardnega odklona. LOD in LOQ HDQ za to analitično metodo sta bila izračunana, kot je navedeno v literaturi [44, 45].

Najvišja čistost/specifičnost je bila ovrednotena s primerjavo vrednosti Rf in UV-spektrov HDQ v CWC A, B, C in D s standardnim HDQ za ta farmacevtski test.

2.6. Kvantitativna analiza HDQ v CWC

Dobljene vzorce CWC A, B, C in D smo nanesli na HPTLC plošče in zabeležili njihove TLC odzive. Območje vrha zaHDQv CWC je bilo zabeleženo. Vsebnost HDQ v CWC je bila izračunana z uporabo umeritvene krivulje HDQ za sedanjo analitično metodo.

2.7. Ocena zelenosti

Značilnosti zelene barve za to analitično metodo so bile pridobljene z uporabo metričnega pristopa AGREE [42]. Rezultati AGREE (0.0–1.0) te analitične metode so bili zabeleženi z uporabo AGREE: analitičnega kalkulatorja zelene barve (različica0.5, Univerza v Gdansku tehnologije, Gdansk, Poljska, 2020).

3. Rezultati in razprava

3.1. Razvoj metode

Na podlagi analitičnih metod iz literature je bilo ugotovljeno, da manjka ekološko trajnostna/zelena metoda RP-HPTLC za analizo HDQ v komercialni kozmetiki. Zato je bila ta študija izvedena za razvoj hitre, zelo občutljive in ekološko trajnostne Metoda RP-HPTLC za analizo HDQ v CWC.

Za RP-HPTLC analizo HDQ različni deleži EtOH in H2O, vključno z EtOH-H2O (50:50, v·v−1), EtOH-H2O (60:40, v·v−1), EtOH-H2O (70:30, v·v−1), EtOH H2O (80:20, v·v−1) in EtOH-H2O (90:10, v·v−1) so bile ocenjene kot zelene kombinacije topil za razvoj zanesljivega pasu za analizo HDQ. Mešanice topil so bile razvite v pogojih nasičenja komore. Iz zabeleženih podatkov je bilo opaziti, da EtOH-H2O (50:50, v·v−1), EtOH-H2O (70:30, v·v−1), EtOH-H2O (80:20, v·v− 1) in mešanice zelenih topil EtOH-H2O (90:10, v·v−1) so ponudile slab kromatogramHDQz nesprejemljivo vrednostjo As (Kot {{0}}.29). Vendar se je izkazalo, da kombinacija EtOH-H2O (60:40, v·v−1) zelenega topila ponuja dobro ločen kromatogram HDQ pri Rf=0.83 ± 0,02 s sprejemljivo vrednostjo As (As {{ 12}}.03) (slika 1). Zato je bil EtOH H2O (60:40, v·v−1) optimiziran kot zelene mešanice topil za analizo HDQ v CWC. UV-spektralni pasovi za sedanjo metodo RP-HPTLC so bili zabeleženi denzitometrično, največji odziv HPTLC pa je bil ugotovljen pri 291 nm za sedanjo metodo RP-HPTLC. Zato je bila celotna analiza HDQ izvedena pri 291 nm.

3.2. Validacijski parametri

Ta farmacevtski test za kvantitativno določanje HDQ je bil potrjen za obseg linearnosti, parametre učinkovitosti sistema, točnost, natančnost, robustnost, občutljivost in najvišjo čistost/specifičnost z upoštevanjem priporočil ICH [44]. Rezultati regresijske analize najmanjših kvadratov umeritvene krivulje HDQ za to metodo RP-HPTLC so predstavljeni v tabeli 1.HDQumeritvena krivulja je bila linearna v območju 20–2400 ng pasu z determinacijskim koeficientom 0,9997 za to analitično metodo. ti podatki kažejo na dobro linearnost med koncentracijo HDQ in njegovim odzivom.

Parametri sistemske učinkovitosti te farmacevtske metode so bili proučeni pri MQC (600 ng band−1), rezultati pa so vključeni v tabelo 2. Vrednosti Rf, As in N m−1 za trenutna analitska metoda je bila predvidena kot 0.83 ± 0,02, 1,03 ± 0,03 oziroma 4987 ± 2,87. Ti rezultati so pokazali, da je bila trenutna analitična metoda zanesljiva za analizo HDQ v CWC.

Rezultati analize točnosti za sedanjo analitično metodo so navedeni v tabeli 3. Odstotek izkoristka HDQ za sedanjo metodo RP-HPTLC je bil določen kot 101,80 odstotka, 98,16 odstotka in 99,38 odstotka pri LQC, MQC oziroma HQC. . Visoke vrednosti odstotkov izkoristkov so pokazale točnost sedanje metode RP-HPTLC za analizo HDQ v CWC.

Natančnost je bila določena kot odstotek koeficienta variacije (odstotek CV), rezultati pa so prikazani v tabeli 4. Odstotki CV HDQ ​​za to analitično metodo so bili predvideni kot 0.91, 0. 59 in 0.26 odstotkov pri LQC, MQC oziroma HQC za natančnost znotraj dneva. Odstotki CV HDQ ​​za sedanjo metodo RP-HPTLC so bili predvideni kot 0.98, {{10}}.69 in 0,32 odstotka pri LQC, MQC oziroma HQC za meddnevna natančnost. Nizke vrednosti odstotka CV so pokazale natančnost sedanje metode RP-HPTLC za analizo HDQ v CWC.

Rezultati analize robustnosti za sedanjo analitično metodo so prikazani v tabeli 5. Odstotki CV za analizo robustnosti so bili predvideni kot 0.59–0.66 odstotkov za sedanjo analitično metodo. Vrednosti Rf HDQ so bile ugotovljene v območju 0.82–0.84 za sedanjo analitično metodo. Majhne spremembe Rf vrednosti HDQ in nižji odstotek CV so pokazali robustnost sedanje analitične metode za kvantifikacijo HDQ v CWC.

Občutljivost za sedanjo analitično metodo je bila zabeležena kot "LOD in LOQ", njuni fizični vrednosti pa sta prikazani v tabeli 1. "LOD in LOQ" za sedanjo analitično metodo sta bili predvideni kot 6,91 ± 0.23 in 2 0.73 ± 0,68 ng band−1 zaHDQkvantifikacija. Te fizične vrednosti "LOD in LOQ" za sedanjo analitično metodo so pokazale občutljivost za analizo HDQ v CWC.

Najvišja čistost/specifičnost za to analitično metodo je bila ovrednotena s primerjavo prekritih UV spektrov HDQ v štirih različnih CWC s tistimi standardnega HDQ. Prekriti UV-spektri standardnih HDQ in HDQ v štirih različnih CWC so prikazani na sliki 2. Največji kromatografski odziv za HDQ v standardnih HDQ in proučevanih CWC je bil opažen pri 291 nm za to analitično metodo. Enaki UV-spektri, vrednosti Rf in valovna dolžina HDQ v standardnih HDQ in CWC so pokazali najvišjo čistost/specifičnost za to analitično metodo.

3.3. Analiza vsebine HDQ v CWC

Uporabnost tega analitičnega testa je bila preverjena pri kvantitativni oceni HDQ v CWC. KromatogramHDQiz CWC je bil identificiran s primerjavo njegove točke TLC pri Rf {{0}}.83 ± 0.02 s tistimi standardne HDQ za to analitično metodo. Kromatogrami HDQ v CWC A in B za ta analitski test so povzeti na sliki 3. HPTLC kromatogrami HDQ v CWC so bili identični tistim za čisti HDQ. Nekateri dodatni vrhovi so se pojavili tudi v kromatogramih CWC, kar bi lahko bilo povezano z različnimi pomožnimi snovmi, prisotnimi v CWC. Ekološko trajnostna metoda HPTLC je bila selektivna za analizo HDQ pri Rf=0.83 brez motenj zaradi drugih sestavin CWC. Ugotovljeno je bilo, da je vrednost Rf (0.83) HDQ v CWC identična vrednosti standardnega HDQ ({{20}}.83), kar kaže, da med HDQ in CWC sestavine. Zato sestavine formulacije niso vplivale na kakovost kromatograma HDQ, LOD in učinkovitost sedanje metode HPTLC analize HDQ. Prisotnost dodatnih vrhov v kromatogramih CWC je pokazala, da je bila trenutna metoda RP-HPTLC zanesljiva za oceno HDQ v prisotnosti sestavin formulacije. Vsebnost HDQ v CWC je bila določena iz umeritvene krivulje HDQ, rezultati pa so vključeni v tabelo 6. Tabela 6 povzema tudi označeno količino HDQ in sestavine njegove formulacije. Vsebnost HDQ je bila najvišja v CWC A (1,23 odstotka w·w−1), sledita CWC C (0,81 odstotka w·w−1), CWC D (0,43 odstotka w·w). −1) in CWC B (0,37 odstotka w·w−1). Zabeležene vsebnosti HDQ so bile veliko nižje od označene količine (2.00 odstotkov w·w−1) HDQ v proučevanih CWC. Vsebnost HDQ v dveh različnih CWC (A in B) je bila zabeležena kot 0,69 odstotka w·w−1 oziroma 0,34 odstotka w·w−1 z uporabo metode normalne faze HPTLC v literaturi [1]. Poročane vsebnosti HDQ so bile tudi veliko nižje od označene količine (2.00 odstotkov w·w−1) HDQ v literaturi [1]. Več CWC ali CWP se trži pod trditvijo, da so povsem naravni. Vendar pa je običajno najti nekatere sintetične kemikalije kot nečistoče z enakimi učinki kot pri takih CWC ali CWP kot goljufija. Količina HDQ, zabeležena v tem delu, in količina, zapisana v literaturi, je pokazala, da imajo proučevane CWC nizko količino HDQ in se ne ujemajo s trditvami na etiketi [1]. Zato se pričakuje, da preučevani CWC vsebujejo nekaj sintetičnih kemikalij kot primesi. Na splošno se ta analitični test lahko uporablja za analizo HDQ v kozmetičnih in farmacevtskih pripravkih.

3.4. Ocena zelenosti

Za oceno zelenega stanja farmacevtskih testov se uporabljajo različne metode [38–43]. Vendar le pristop AGREE uporablja vseh 12 načel GAC za vrednotenje zelenosti [42]. Zato je bil profil zelene barve te analitične metode pridobljen s pomočjo kalkulatorja AGREE. Predvideni rezultat AGREE z uporabo 12 različnih principov GAC za ta analitični test je predstavljen na sliki 4. Rezultat AGREE za različne principe GAC je bil zabeležen na naslednji način: Obdelava vzorca: 0.61Pozicioniranje analitične naprave: 1.{{ 9}}Koraki za pripravo vzorca: 1.00Stopnja avtomatizacije: 0.80Derivatizacija: 1.00Količina odpadkov: 1.{{17} }Prepustnost analize: 1.00Poraba energije: 1.00Obdelava vzorca: 0,51Vir reagenta: 1.00Strupenost topil: 1.00 Varnost upravljavca: 1.00

Skupni rezultat AGREE za to analitično metodo je bil zabeležen kot 0.91, kar kaže na odlično zeleno analitično metodo zaHDQkvantifikacija.

4. Sklep

Metoda RP-HPTLC-denzitometrije je bila razvita za analizo HDQ v štirih različnih CWC HDQ. Ta test RP-HPTLC je bil validiran za različne validacijske parametre. Sedanja analitična metoda je bila zelo občutljiva, hitra in ekološko trajnostnaHDQanalizo. Rezultat AGREE za to analitično metodo je predlagal odličen analitični test za kvantifikacijo HDQ. Sedanji RMetoda P-HPTLC je bila primerna za analizo HDQ v štirih različnih CWC. Ti rezultati so pokazali, da se ta analitični test lahko uporabi za analizo HDQ v različnih kozmetičnih in farmacevtskih pripravkih.