Vzrok kronične bolezni ledvic (CKD)- anemija

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

DEL I.:P kronična bolezen ledvic je povezana s spremenjeno življenjsko dobo rdečih krvnih celic, deformabilnostjo in presnovo

Rosi Bissinger, Travis Nemkov & et al.

Razvojslabokŕvnostje tipičen zaplet naprednihkronična bolezen ledvic(CKD) in je povezana z okvaro kakovosti življenja¹in povečano tveganje za srčno-žilne dogodke²in hospitalizacijo,³pa tudi kognitivni upad.⁴Resnostslabokŕvnostje bila ocenjena kot neodvisni napovedovalec umrljivosti v dializi in ne dializi odvisni CKD (kronična bolezen ledvic) bolnikih.⁵Patofiziologija ledvičnih bolezni, povezanih zslabokŕvnostje zapletena in vključuje pomanjkanje železa in eritropoetina (EPO) pri določanju vnetja nizkega razreda, ki pa ogroža normalno eritropoezo v CKD (kronična bolezen ledvic) bolnikih.⁶V napredni CKD (kronična bolezen ledvic), je odziv EPO neustrezno nizek glede na stopnjoslabokŕvnost.^7,8Visoka razširjenost sočasne pomanjkanja železa v CKD (kronična bolezen ledvic) je posledica motene železne homeostaze.⁹Zanemarjani mehanizem izgube železa v CKD (kronična bolezen ledvic) je proteinurija, ki lahko povzroči izgube železa, vezanega na transferin (do 0,3 mg/d), ko proteinurija doseže nefrotsko območje.¹⁰Še en dejavnik, ki naj bi prispeval kslabokŕvnostv CKD (kronična bolezen ledvic) bolnikih je skrajšana življenjska doba rdečih krvnih celic (RBC), ki je bila prvič opisana > 60 let nazaj.^6,11,12

Korist zdravila Cistanche: zdravljenje bolezni ledvic in izboljšanje delovanja ledvic

Nedavna študija s testom izdihanega ogljikovega monoksida je pokazala, da se je življenjska doba RBC postopoma zmanjšala s 120 dni pri bolnikih s CKD faze 1 (kronična bolezen ledvic) do 60 dni pri bolnikih s stopnjo 5 CKD (kronična bolezen ledvic).¹³Zlasti transfuzija alogenih RBC od zdravih dajalcev do CKD (kronična bolezen ledvic) bolnikom je sledil hiter očistek transfuziranih RBC brez dokazov hemolize.¹²Verjeden mehanizem za to opazovanje je lahko stimulacija apoptoze podobne smrti celic pri anukleatih RBC, ki pomeni vzorec poškodbe, v katerem celovitost celične membrane ni ogrožena in citoplazmična vsebina ostaja nedotaknjena.¹⁴RBC, ki so v celici umrli, ima različne morfološke spremembe, ki so posledica citoskeletnih poškodb, kot so nastanek površinskih blebov, izguba elastičnosti membrane in/ali celična dehidracija.¹⁵Na molekularni ravni je RBC smrt povezana z znotrajcelično ca2þ kopičenjem, spremenjenim celični energijski status in razčlenitev fosfolipidno asimetrijo, kar na koncu vodi do zunanjih fosfatidilserina (PS) na zunanji plazemski membrani.^15,16Posledično makrofagov in specializirane dendritične celice hitro prepoznajo PS-zunanje RBC, kar vodi do erythrose phagocytosis in njihove katabolizem v vranici in jetrih.¹⁷Zaradi zmedene patofiziologijebolezni ledvic–povezanaslabokŕvnostštudije na živalih upravičene, da navedejo mehanizme, ki prispevajo k temu. Doxorubicin-induced nephropathy (DIN) in 129S1/SvImJ miši¹⁸in miši z neučinkovitim pomanjkanjem podocina (Nphs2Dipod)¹⁹so 2 modela, za ki sta značilna indukcija proteinurija nefrotskega razpona v nekaj dneh, napredovanje do odpovedi ledvic po 3 tednih in smrt v 6 do 7 tednih.^19–21Oba modela miške učinkovito dokapitalizacija vseh stopenj človeške CKD (kronična bolezen ledvic). V sedanji študiji smo preskušali, ali je pri teh miših progresivna odpoved ledvic z proteinuričnimibolezni ledvicvpliva na življenjsko dobo RBC in prispeva kslabokŕvnost. Vzporedno smo preučili RBC fenotip v krvi, ki je bil izvleč iz CKD (kronična bolezen ledvic) bolnikih z proteinurijo nefrotskega razpona.

CKD (kronična bolezen ledvic) inanemija: CISTANCHE

METODE

Podrobne informacije o materialih in metodah so na voljo v dopolnilnih materialih in metodah.

Študije miške

Eksperimenti so bili izvedeni na 8-tedenskih miših divjega tipa 129S1/SvImJ obeh spolov (Charles River). ZDRAVILO DIN so inducirali z enkratno injekcijo doksorubicina (14,5 mg/g telesne mase), kot je bilo opisano prej.^18,22Za nadzor nad mielotoksnim učinkom doksorubicina, ki ni povezan z razvojem nefropatije, so bile tudi miši C57BL/6, odporne na doksorubicin, podvržene istemu protokolu zdravljenja.²³Poleg tega Podobni eksperimenti izvedeni so na 8-tedenskim mišem s induktivnim brisanjem podocina (B6-Nphs2tm3.1Antc*Tg [Nphs1-rtTA*3G] 8Jhm*Tg[tetO-cre]1Jaw) ali Nphs2Dipod miša, ki so se 14 dni zdravili doksiciciklinom.¹⁹Vsi poskusi na živalih so bili izvedeni v skladu z Nacionalnim vodnikom za zdravstveno varstvo in uporabo laboratorijskih živali ter nemškim zakonom o dobrobiti živali, z odobritvijo lokalnih organov (Regierungspräsidium Tübingen, homologacijske številke M12/17 in M17/19G). Eksperimentalna zasnova študij miške je opisana v Dodatni sliki S1.

Bolnikov

Študija bolnika je bila izvedena v skladu z deklaracijo iz Helsinkija in jo je odobril lokalni odbor za etiko Univerzitetne bolnišnice Tübingen (556/2018BO2). Litij-heparin v krvi in urinu so bili pridobljeni od bolnikov z proteinurijo nefrotičnega razpona in ohranjene hitrosti glomerularne filtracije (GFR; faze 1–2; n 1/4 10) in pri bolnikih z zmanjšanim GFR (CKD (kronična bolezen ledvic) faza 3–5; 1/4 15) v Univerzitetni bolnišnici Tübingen. Kot kontrolno skupino je kri zdravih prostovoljcev s spolom in starosti (n 1/4 25) zagotovila krvna banka Univerzitetne bolnišnice Tübingen. Vsi človeški vzorci so bili zbrani po privolitvi. Klinične značilnosti bolnikov soTabela 1.

Preglednica 1 | Značilnosti bolnikov s CKD (kronična ledvična bolezen) in zdravih dajalcev krvi

Analize citometrije pretoka

Različne parametre smrti celic RBC so določili s sočlovekovo citometrijo.¹⁴Za določitev življenjske dobe RBC in vivo 25 ml 5,6-karboksifluoresceina diacetata sukcinimidil estra [5(6)-CFDA, ] je ubrizgano u retro orbitalni pleksus divjega tipa 129S1/SvImJ i miša ubrizganih doksorubicinom, se je ubrizgalo u koncentraciju 9,96 mM (topljivo u dimetilsulfooksidu), Kako je opisano prije.24 Na navedenim časovnim točkama, krv je bila izvukana iz retro-orbitalnega pleksusa miša, in odstotek 5(6)-CFDA, so SEþ celice zaznali s kolegi citometrijsko analizo. Končno so bili podatki analizirani s pomočjo flowJo programske opreme (FlowJo LLC).

RBC deformabilnost in osmotska gradientna ektacitometrija

RBC deformabilnost je bila izmerjena z lasersko podprtim optičnim analizatorjem rotacijskih celic (LORCA Max Sis; RR mehatronika), ki je bila podrobno opisana drugje.²⁵Ektacitometrijo osmotskega gradienta (lahko) so izvedli tudi z uporabo LORCA Max Sis in merili deformabilnost v različnih osmotičnih pogojih.²⁶

Histološki pregled

Za obotavanje hematoksilina in eozina so bile vranice in stegnenice obmagane s hematoksilinom in eozinom. Vsi diapozitivi so bili obojani s primarnim protitelesom Ter119 (BD Pharmingen; razredčenje 1:500). Za periodično oblivanje kisline–Schiff, 2,5 mm debele rezineLedviceso bili obokani s periodično kislino–Schiff reagentom (Carl Roth) in hematoksilinom (Abcam). May-Grünwald-Giemsa madež (Pappenheim metoda) je bil izveden za določanje sprememb oblike RBC, kot je opisano prej.²⁷Glomeruli izoliranje je bilo narejeno z biotinilacijskim pristopom in razvrščanjem celic.¹⁹Za odkrivanje beljakovin podocina je bilo uporabljeno protitelo zdravila Sigma (P0372).¹⁹Roti-Mount Fluor Care 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; Carl Roth) je bil uporabljen za madež jedr.

Ultra visoko zmogiji tekoča kromatografija-masna spektrometrija metabolomika iz miške RBC

Analize so bile opravljene kot prej objavljene.²⁸Na kratko, analitična platforma uporablja Vanquish ultra visoko zmogljivost tekoči kromatografski sistem (Thermo Fisher Scientific), ki je na spletu skupaj z Q Exactive masnega spektrometra (Thermo Fisher Scientific).

Cistanche zdravljenje bolezni ledvic, ki jo povzroča anemija

Statistične analize

Podatki so na voljo kot aritmetična sredstva SEM ali kot mediana medkvertilnega razpona (25. – 75. percentil) z n, ki predstavlja število uporabljenih živali oziroma vključenih bolnikov. Podatki so bili testirani na normalnost z Kolmogorov-Smirnov test, D'Agostino test, in Shapiro-Wilk test. Variance so analizirali z Bartlett testom za enake variance. Tukey ali Dunn multi-comparison posttest, unpaired Student t-test ali Mann-Whitney U test je opravil GraphPad Prism 8 (GraphPad Software). P< 0.05="" with="" 2-="" tailed="" testing="" was="" considered="" statistically="" significant.="" additional="" graphs="" were="" plotted="" through="" graphpad="" prism="">

REZULTATI

Eksperimentalna proteinurična bolezen ledvicslabokŕvnostpri miših Po indukciji so miši 129S1/SvImJ z DIN in Nphs2Dipod mišmi razvile proteinurijo nefrotskega razpona (slika 1a in dopolnilna slika S2C) in progresivno odpoved ledvic, za kar so značilne visoke ravni sečnine v plazmi od 20. dne dalje (slika 1b in dopolnilna slika S2D). V prvih 10 dneh so miši doživele povečanje telesne mase z asciti (slika 1c in dopolnilna slika S2E), kar odraža zadrževanje natrija zaradi izločanja serinskih proteaz ali proteinurija.¹⁸Po spontanem obratu zadrževanja natrija so te miši vedno shujšale. Pri miših z DIN in Nphs2Dipod mišmi so svetlobne mikroskopske slike, posnete po 10 dneh, pokazale značilne histomorfološke spremembe, skladne s fokalno segmentalno glomerularno sklerozo (slika 1d in dopolnilna slika S2B). Teh ni bilo pri miših C57BL/6, ki so jih injicirali doksorubicina (slika 1d). Zdravljenje z doksorubicinom je pri 129S1/SvImJ in C57BL/6 miših močno upadlo, število RBC in hematokrit (slika 1e–g) od 10. Nasprotno pa so se v 20. in 30.slabokŕvnost, za kar je značilna zmanjšana srednja vrednost korpuskularnega volumna (slika 1h) in zmanjšan hemoglobin (dodatna slika S2F), karslabokŕvnostje povezana s progresivno odpovedjo ledvic in ne z zdravljenjem z doksorubicinom na

Slika 1 | Delovanje ledvic in anemija pri miših, ki so jih injicirali doxorubicin 129S1/SvImJ.(a–d) Miši, injicirane z doksorubicinom 129S1/SvImJ, so razvile (a) visoko proteinurijo, (b) progresivno povecavanje koncentracije uree u plazmi, (c) tranzitno povecavanje telesne mase, i (d) tipične histomorfoloske spremembe indikativne za fokalnu segmentalnu glomerularnu sklerozu 10. (e–h) Poleg tega so te miši razvileslabokŕvnostreflflekted z (e) znižano raven hemoglobina, (f) nižjimi števili rdečih krvnih celic (RBC), (g) zmanjšanimi koncentracijami hematokrita in (h) zmanjšanim povrednim krvožilnim volumenom. (a–d) Miši C57BL/6, ki so jih injicirali doxorubicin, niso pokazale znakov poškodbe ledvic in (npr.slabokŕvnost10. dan normalizirali 20. in 30. dan. Aritmetika pomeni, da je prikazan SEM. *P< 0.05,="" **p="">< 0.01,="">< 0.001,and="" ****p="">< 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" between="" healthy="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" #p=""><0.05, ##p="">< 0.01,="" ###p="">< 0.001,="" and="" ####p="">< 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" to="" the="" baseline="" of="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" and="" §p="">< 0.05,="" §§p="">< 0.01,="" §§§p="">< 0.001,="" and="" §§§§p="">< 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" between="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" c57bl/6="" mice.="" crea,="">

Anemija pri eksperimentalni proteinurski bolezni ledvic ni posledica ogrožene eritropoeje

Oba modela anemične miške sta prikazala znatno povečanje odstotka obtočnih retikulocit (slika 2a in dodatna slika S3C). Koncentracije EPO v plazmi so se dramatično povečale 10. Pri miših s pomanjkanjem podocina so se koncentracije EPO v plazmi povlele 10. V histoloških analizah kostnega mozga in vranice se je število eritropoidnih predhodnih celic v primerjavi s mijeloidnim predhodnikom povečalo 30. dan (slika 2d–g), kar kaže na stimulirano eritropoezi pri miših anemičnega 129S1/SvImJ z DIN.

Slika 2 | Eritropoezis se spodbuja v doksorubicinom injiciranih miših 129S1/SvImJ z anemijo.(a)Slabokŕvnostpri miših, ki so jih injicirali doxorubicin 129S1/SvImJ, so se pojavile kljub povečanemu številu retikulocita v 20. (b) Koncentracija eritropoetina v plazmi je bila 10. (c–e) Kvantifikacija absolutnega števila (c) mieloidnih in (d) erythroidnih celic v kostnem mozegu. Razmerje (e) miške mieloidnih in erythroidnih celic v zdravih in vbrizganih doksorubicina 129S1/SvImJ miši v kostnem mozegu je na dan 30. (f,g) Histologija (f) vranice in (g) kostnega mozga je pokazala povečanje erythroidnih prejšnjih celic, opaženih tudi pri nižjih povečavah, v odmerku, vbrizganih 129S1/SvImJ miši (desni paneli) v primerjavi z zdravimi mišmi (leve plošče) 30. (f,g) Ter119 imunohistokemijo (spodnje plošče) podprli hematoxylin in eosin (H&E) ugotovitve. Ter119 je pozitiven v erythroid prekursors (jedrji celic) in v rdečih krvnih celicah (nenukleirane celice). bar 1/4 100 mm; 1/4 25 mm. Aritmetika pomeni, da je prikazan SEM. *P< 0.05,="" **p="">< 0.01,="" and="" ***p="">< 0.001="" indicate="" significant="" difference="" between="" healthy="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" ##p="">< 0.01="" and="" ####p="">< 0.0001="" indicate="" significant="" difference="" to="" baseline="" of="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" and="" §p="">< 0.05,="" §§p="">< 0.01,="" and="" §§§§p="">< 0.0001="" indicate="" significant="" difference="" between="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" c57bl/6="">

KoristCistanche: zdravljenje bolezni ledvic in izboljšanje delovanja ledvic

Zmanjšana življenjska doba RBC je primarni vzrok za anemijo pri eksperimentalni proteinurični bolezni ledvic

Zunanjost PS na zunanjem navodilu plazemske membrane RBC je pokazatelj smrti celic in nosilec erythro phagocytosis.¹⁴Smrt celic RBC je bila količinsko razvrščena z analizami razvrščanja celic, aktiviranih s fluorescenco, za fluorescenčne površine PS.¹⁴V sveže narisani krvi je bil odstotek celic, ki so izpostavljene PS, >4-krat višji 20. dan pri miših z DIN (4,16 % & 0,86 %) v primerjavi z zdravimi mišmi (1,00 % & 0,11%) (slika 3a). Podobno so miši Nphs2Dipod pokazale približno 2-kratno povečanje izpostavljenosti PS (1,27 % & 0,20 %) v primerjavi z zdravimi mišmi (0,58 % & 0,05 %) na 30. dan (dodatna slika S3A). Znano je, da se RBC izločijo iz obtoka z makrofagami, ki prebivajo v vranici.17 To opazovanje lahko zato pojasni večje razmerje med vranico/telesno maso Nphs2Dipod miši (Dopolnilna slika S2G), kjer se dvakrat več RBC razgradi v primerjavi z zdravimi mišmi C57BL/6. Ker proteinurija nefrotskega razpona vodi do disproteinemije,29 smo nadalje preiskali, ali se lahko okrepljena smrt RBC celic stimulira s sestavino v plazmi miši z DIN. Kot je prikazano na sliki 3b, je bila izpostavljenost PS v 10.^OC) zdravih RBC v plazmi vbrizganih doksorubicina 129S1/ SvImJ miši v primerjavi z inkubacijo zdravih miši v plazmi. Ca2þ priliv v RBC, posredovan s kanali za neselekcijo, neodvisnim od napetosti,^30,31je eden od ključnih regulatorjev smrti RBC celic. V RBC, zbranih v 20. ta pojav je bil reapituliran v Nphs2Dipod miši na dan 20 (Dopolnilna slika S3B). V obeh modelih miši je bila znatna negativna korelacija odstotka ps-pozitivnih RBC, prislabokŕvnostravni hemoglobina (slika 3d in dodatna slika S3D). Poleg tega je obstajala znatna korelacija z okvaro ledvic, ki jo je odražala koncentracija sečnine v plazmi (slika 3e in dopolnilna slika S3E) in v manjši meri z proteinurijo (slika 3f in dopolnilna slika S3F). Nadomestilo za izgubo RBC vslabokŕvnost, je bil nastanek novih RBC stimuliran pri obeh miših, kar kaže povečan odstotek obtoka retikulocitih in je bil bistveno povezan z velikostjo RBC, ki izpostavlja PS (slika 3g in dopolnilna slika S3G).

Slika 3 | Pri miših z nefropatijo, ki jo povzroči doksorubicin, se razvije povečana smrt rdečih krvnih celic (RBC), posredovana s povečano koncentracijo kalcija v znotrajcelični celici.(a) Zunanjost fosfatidilserina (PS), ki odraža smrt RBC, je bila po indukciji nefropatije, ki jo je induciral doktorubicin, okrepljena 20. (b) Inkubacijo zdravih RBC v plazmi, vzetih 10. (c) zunanjost PS je spremljala povečana znotrajcelijska koncentracija kalcija RBC, ki so jo 20. (d–g) (d) odstotek RBC, ki so izpostavljeni PS, je bil povezan s koncentracijo hemoglobina, poškodbami ledvic, ki jih je navedla (e) koncentracija sečnine v plazmi in (f) proteinurijo, kot tudi z (g) tvorbo retikulocita. (d–g) Podatki vključujejo vsako časovno točko (0, 10, 20 in 30 dni) vsake zdrave 129S1/SvImJ in 129S1/SvImJ miške z nefropatijo, ki jo povzroči doksorubicin. Aritmetika pomeni, da je prikazan SEM. **P< 0.01,="" ***p="">< 0.001,="" and="" ****p="">< 0.0001="" indicate="" significant="" difference="" between="" healthy="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" (in.)="" 129s1/svimj="" mice;="" #p="">< 0.05,="" ##p="">< 0.01,="" and="" ####p="">< 0.0001="" indicate="" significant="" difference="" to="" baseline="" of="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" and="" §§§§p="">< 0.0001="" indicate="" significant="" difference="" between="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" c57bl/6="" mice.="" crea,="" creatinine;="" mfi,="" mean="" fluorescence="">

KoristCistanche: zdravljenje bolezni ledvic in izboljšanje delovanja ledvic

KLIKNITE TUKAJ ZA DEL II.