Materiali in metode

6. Testi celičnega privzema

Internalizacijo EV v celice smo spremljali s prvim obarvanjem LEV in SEV z lipofilnim DiI (MOP-D -3911) (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA). Po obdelavi celic z obarvanimi EV za 1, 3, 6, 12, 24 in 48 ur smo rastni medij odstranili in celice fiksirali s 4 odstotki paraformaldehida (Wako, Japonska). Dodali smo Hoechst 33342 (Invitrogen) in celice inkubirali 15 minut pri sobni temperaturi, da smo obarvali jedra (modro). Končno smo celice sprali s PBS, ki je vseboval 1 odstotek govejega serumskega albumina, in opazili fluorescenco (rdečo in modro) pod fluorescenčnim mikroskopom (Leica Microsystems, Wetzlar, Nemčija). Vsaj tri polja so bila izbrana in analizirana s programsko opremo ImageJ.

7. Merjenje vsebnosti melanina

Za oceno vsebnosti melanina so bile celice melanoma B16BL6 najprej nacepljene v 24-plošče z vdolbinicami (5 × 104 celic/vdolbinico) v prostornini 500 μL. Po 24 urah inkubacije so celiceso bili zdravljeni samo s 100 nM -MSH (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ali s 50 μL LEV in SEV pri 1, 5 in 10 µg/mL 48 ur. Po obdelavi celice speremo s PBS in nato inkubiramo z 2,5-odstotnim tripsinom (Gibco, Thermo Fisher Scientific) za izolacijo. Celične mikrosfere smo raztopili v 1n raztopini natrijevega hidroksida (Sigma-Aldrich), ki je vsebovala 1 odstotek DMSO (Sigma-Aldrich), 1 uro pri 80 stopinjah. Celične lizate smo prenesli na 96-ploščo z jamicami in vsebnost melanina določili z merjenjem absorbance pri 405 nm z uporabo encimskega markerja (BioTek). Vsebnost melanina je bila določena z uporabo standardne krivulje melanina, izdelane iz 0-100 µg/mL raztopine sintetičnega melanina (Sigma-Aldrich) (zunajcelični vezikli Slika, kot sledi). Vsebnost melanina je bila izračunana v primerjavi s kontrolami.

8. Test aktivnosti tirozinaze

Aktivnost TYR smo merili z aktivnostjo L-DOPA oksidaze. Celice B16BL6 smo inokulirali v medij -MEM, ki je vseboval 100 nM Sigma-Aldrich -MSH (500 μL) in gojili pri gostoti 1 × 105 celic/vdolbino v 24-ploščih z vdolbinicami. Po 24-urnem zdravljenju celic s 50 μL LEV in SEV pri koncentracijah 10, 50 in 100 µg/mL smo celice sprali s PBS in lizirali z 1 odstotkom Tritona X-100 (Sigma-Aldrich). Lizirane celice smo inkubirali pri - 80 stopinjah 30 minut in nato liofilizirali ter shranili pri sobni temperaturi 10 minut. Dobljene vzorce smo zbistrili s centrifugiranjem pri 12,000 × g 15 minut, nato pa dodali 2 mg/mL L-DOPA (Sigma-Aldrich) in inkubirali pri 37 stopinjah 1 uro. Absorbanco smo nato izmerili pri 490 nm z uporabo encimskega markerja (BioTek). Absorbanco smo nato izmerili pri 490 nm z BioTek.

Kliknite tukaj, da dobitekoristi Cistanche pri beljenju kožeinkakšni so učinki Cistanche tubulosa

9. Western blot analiza

Ravni beljakovin, povezane z antimelanogeno potjo, so bile znotrajcelično določene z Western blot analizo izvlečkov celih celic. Volumen 500 μL celic mišjega melanoma B16BL6 je bil inokuliran v 24-plošče z vdolbinicami (1 × 105 celic/vdolbinico). Celice smo lizirali z inkubacijo v pufru RIPA (Thermo Fisher Scientific) 20 minut v prisotnosti mešanice zaviralcev proteaz (Roche, Nemčija) in obdelali s 50 μL 10, 50 in 100 μg/mL EVs 24 ur. Celične lizate smo centrifugirali pri 17 709 g 15 minut in določili koncentracijo beljakovin v nastalih lizatih z uporabo kompleta za testiranje BCA (Thermo Fisher Scientific). Enake količine beljakovin (10-20 ug/vzorec) so bile naložene v vdolbinice Bolt 4-12 odstotkov Bis-Tris Plus gelov (Invitrogen) in elektrotransferirane na PVDF (poliviniliden fluorid) membrane (GE Healthcare, Chicago, IL, ZDA). Membrane so bile 1 uro sprane s tris-pufrano fiziološko raztopino, ki je vsebovala 0,2 odstotka (v/v) ten -20 (TBST), zaprte s TBST, ki je vsebovala 5 odstotkov (m/v) posnetega mleka (Gibco, Thermo Fisher Scientific). pri sobni temperaturi in nato inkubirali pri 4 stopinjah v primarni raztopini protiteles, razredčeni z 1 odstotkom (m/v) posnetega mleka. Inkubacija je potekala čez noč. Primarna uporabljena protitelesa so vključevala protitelesa anti-TRP-1 (1:1000), anti-TRP-2 (1:1000) in anti-MITF(1:1000) iz Abcam, Cambridge, UK; protitelesa proti TYR (1:500) podjetja Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, ZDA). Za standardizacijo na ravni beljakovin smo uporabili proti- -aktinsko protitelo (1:500; Santa Cruz). Primarna protitelesa so odkrili s sekundarnim protitelesom, označenim s hrenovo peroksidazo (HRP), proizvajalca Genetex (Irvine, CA, ZDA). Membrane smo sprali s TBST in inkubirali 1 uro pri sobni temperaturi z 1:2000 razredčino sekundarnega protitelesa v TBST. Signal, ustvarjen po izpiranju membrane s TBST in inkubaciji z reagentom za izboljšano kemiluminiscenco (ECL) (GE Healthcare), je bil zaznan s sistemom za slikanje z gelom ImageQuant 350 (GE Healthcare).

10. Elektronsko mikroskopsko odkrivanje intracelularne proizvodnje melanina

Celice smo obdelali z LEV ali SEV in inkubirali 48 ur. Po obdelavi smo celice fiksirali z inkubacijo z 200 mM kakodilatnim pufrom, ki je vseboval 8 odstotkov glutaraldehida in 20 odstotkov paraformaldehida (Wako). Po dehidraciji z etanolom so bili pripravljeni ultra tanki rezi z uporabo mikrotoma Leica EM UC7 (Leica) in zbrani na 200-mrežasti bakreni mreži. Sekcije so bile obarvane z 1 odstotkom uranil acetata in svinčevega citrata, slike pa so bile pridobljene s transmisijskim elektronskim mikroskopom JEOL JEM 1010 (JEOL) pri 80 kV.

Izvleček Cistanche

11. Merjenje učinka beljenja z uporabo modela človeške kože

Za testiranje belilnega učinka LEV je bil uporabljen model človeške kože derm-me (Tego Science, Seul, Koreja). Tkivo človeške kože je bilo 7 dni obdelano z 10 μg/mL leva kot negativna kontrola. Koncentracija arbutina je bila 70 µg/mL. Človeško kožno tkivo smo raztopili v 1 N NaOH in izmerili absorbanco pri 405 nm z uporabo encimskega markerja (BioTek) za določitev vsebnosti melanina. Sedmi dan so pigmentacijo kože primerjali z mikroskopsko analizo vzorcev, obarvanih po Fontani. Za obarvanje po Fontana-Massonu so vzorce kože čez noč fiksirali pri sobni temperaturi v 4-odstotnem paraformaldehidu (Waco), razrezali in vdelali v parafinski vosek. Parafinsko vdelane odseke smo nato 1 uro segrevali v pečici pri 60 stopinjah, da se posušijo. Odseke smo nato trikrat namočili v ksilen, dvakrat v 95-odstotni etanol in dvakrat v 100-odstotni etanol ter nato sprali z destilirano vodo. Fontana-Massonovo barvanje smo izvedli z raztopino amonijevega srebra pri 56 stopinjah in sprali z destilirano vodo. Predmetna stekelca smo nato fiksirali v 0,2-odstotni raztopini zlatega klorida in potopili v 5-odstotno raztopino natrijevega tiosulfata pri sobni temperaturi. Na koncu so bila stekelca dehidrirana v svežem alkoholu.

12. Statistična analiza

Podatki, pridobljeni s poskusi, so izraženi kot povprečje ± SEM. Izvedli smo poskuse s štirimi serijami aktivnosti, vsebnostjo melanina in aktivnostjo TYR (dopolnilna slika S3). Enosmerna analiza variance (ANOVA) in Dunnettov test sta bila izvedena z uporabo GraphPad Prism (GraphPad Prism Software Inc., San Diego, CA, ZDA). p < razlike; 0.05, p < 0.01, p < 0,001 so veljali za statistično pomembne.

Izvleček Cistanche tubulosa

Diskusija

V nasprotju z večino evkariontskih celic imajo rastline kompleksno celično steno, ki predstavlja pomembno oviro za gibanje eksosomov. Posledično rastlinske celice sproščajo eksosome skozi vrsto multivezikularnih teles, spojenih s plazemsko membrano. Sekretorni produkti, ki jih sproščajo rastlinski izločki, se odlagajo v periplazmatsko režo ob plazemski membrani; ko se kopičijo, ustvarijo pritisk, ki izločku omogoči, da prečka pregrado celične stene. Posledično se lahko izločeni material, vključno z eksosomi, sprosti brez potrebe po energiji. EV rastlinskega izvora so po velikosti podobni ali večji od naravno prisotnih eksosomov živalskih celic in so podobni tistim, opaženim v eksosomski tekočini sončnice (50-200 nm) in EV Arabidopsis (50-300 nm). Učinkovitost celičnega privzema velja za ključno determinanto učinkovitosti, saj se tarče mnogih terapevtskih učinkovin nahajajo znotraj celice. Zato smo določili optimalni čas in koncentracijo privzema s celicami melanoma in opazili hiter prenos LEV in SEV v celice melanoma v 12 urah.

TYR je glikoprotein, ki katalizira pretvorbo l-tirozinaze v L-DOPA, korak, ki omejuje hitrost v sintezi melanina. Oba EV imata antimelanogeni učinek, vendar je antimelanogeni učinek LEV bistveno večji od učinka SEV.

Proizvodnjo melanina uravnava -MSH-MC1R, zaviranje PKC pa je znano, da zmanjša pigmentacijo kože in las. Vendar številne genetske, biokemične in farmakološke študije kažejo, da je signalna pot -MSH-MC1R glavno gonilo melanogeneze. Čeprav naši poskusi niso pokazali neposredne interakcije med MITF in TYR, je bilo dokazano, da LEV zavirajo melanogenezo z zmanjšanjem izražanja MITF prek UV-odvisne poti -MSHMC1R, kar posledično zmanjša izražanje TYR, TRP-1, in TRP-2. Domnevamo, da so proteini družine TRP posredno povezani drug z drugim, vendar bodo morda potrebni nadaljnji poskusi, da se dokaže neposredna interakcija med njimi. Poleg tega rekonstruirani modeli človeške kože kažejo, da LEV učinkovito zavirajo sintezo melanina, ki jo povzroči UV.

Cistanche dulcis

Zaključek

Naše ugotovitve kažejo, da so LEV kandidati za nova antimelanogena zdravila, ki zmanjšujejo melanogenezo z zaviranjem izražanja beljakovin, povezanih z melaninom. Rezultati so potrdili, da so LEV zmanjšali MITF in tako znižali TRP v celicah melanoma B16BL6. lev in arbutin zavira TRY za 66 oziroma 67 odstotkov. Vsebnost melanina v rekonstruirani koži, zdravljeni z LEV, se je zmanjšala za 43 odstotkov in 28 odstotkov v primerjavi z neobdelano negativno kontrolo oziroma arbutinom kot pozitivno kontrolo.

Na podlagi zgodnjih ugotovitev verjamemo, da bi lahko bila električna vozila rastlinskega izvora uporabna kot antimelanogeno sredstvo za razvoj naravne kozmetike. V prihodnosti so potrebne nadaljnje raziskave za razvoj električnih vozil rastlinskega izvora kot učinkovite sestavine za izboljšanje kože, poleg tega pa je treba dokazati varnost električnih vozil rastlinskega izvora na modelih človeške kože. Naši rezultati kažejo, da se lahko EV uporablja za zmanjšanje melanina in s tem posvetlitev kože. Vendar ima lahko EV toksične učinke na kožo, zato je treba izvesti druge poskuse, kot so testi alergij ali Amesovi testi.

REFERENCE

[1] Nosanchuk JD, Nimrichter L, Casadevall A, et al. Vloga vezikularnega transporta makromolekul skozi celične stene v patogenezi gliv. Commun Integr Biol. 2008;1(1):37–39.

[2] Robinson DG, Ding Y, Jiang L. Nekonvencionalno izločanje beljakovin v rastlinah: kritična ocena. Protoplazma. 2016; 253 (1): 31–43.

[3] Paiva EA. Kako sekretorni produkti prečkajo rastlinsko celično steno, da se sprostijo? Nova hipoteza, ki vključuje ciklična mehanska dejanja protoplasta. Ann Bot. 2016; 117 (4): 533–540.

[4] Hood JL, Scott MJ, Wickline SA. Povečanje koloidne stabilnosti eksosoma po elektroporaciji. Analna biokemija. 2014; 448 (1): 41–49.

[5] Rutter BD, Innes RW. Zunajcelični vezikli, izolirani iz apoplasta lista, nosijo proteine ​​odziva na stres. Plant Physiol. 2017; 173 (1): 728–741.

[6] Luan X, Sansanaphongpricha K, Myers I, et al. Inženiring eksosomov kot rafiniranih bioloških nanoplatform za dostavo zdravil. Acta Pharmacol Sin. 2017; 38 (6): 754–763.

[7] Videira IF, Moura DF, Magina S. Mehanizmi, ki uravnavajo melanogenezo. Nedrček Dermatol. 2013;88(1):76–83.

[8] Park HY, Lee J, Kapasi S, et al. Lokalna uporaba zaviralca protein kinaze C zmanjša pigmentacijo kože in las. J Invest Dermatol. 2004; 122 (1): 159–166.

[9] Yamanishi DT, Graham M, Buckmeier JA, et al. Diferencialna ekspresija genov proteinske kinaze C v normalnih človeških neonatalnih melanocitih in metastatskih melanomih. karcinogeneza. 1991;12(1):105–109.

[10] Borovansky J, Riley PA. Melanini in melanosomi: biosinteza, biogeneza, fiziološke in patološke funkcije. Hoboken, NJ: Wiley-Blackwell; 2011

[11] D'Mello S, Finlay G, Baguley B, et al. Signalne poti v melanogenezi. Int J Mol Sci. 2016;17(7):1–18.