Kako imajo feniletanoidni glikozidi, aktivna sestavina Cistanche, nevroprotektivno vlogo?

Xue Gong†a, Yan Xu†b, Kai Renc, Xiaorong Baid, Chunhong Zhanga

POVZETEKV tej študiji smo osamili osemfeniletanoidglikozidiiz Paraboea martini prvič in ovrednotili mehanizem, na katerem temeljijonevroprotektivnoučinkiproti poškodbam, ki jih povzroči H2O2- v celicah PC12. Za pregledovanje je bila uporabljena metoda MTSfeniletanoidglikozidiza zaščitno sposobnost. Nato sta bili uporabljeni qRT-PCR in Western blotting analiza za odkrivanje ravni transkripcije HO-1 in GCLC, ki jih uravnava Nrf2. Inhibitor ZnPP smo uporabili za analizo vpletenosti Nrf2 v izražanje HO-1. Analize so pokazale, da so kaleolariozid B, parabozid B in parabozid II prav tako povečali izražanje HO -1, vendar niso pokazali očitnega učinka na GCLC. Predobdelava z ZnPP je bistveno zmanjšalanevroprotektivnoučinki. Tako so feniletanoidni glikozidi, izolirani iz P. martini, zaščitili celice PC12 pred poškodbami, ki jih je povzročil H2O2-, z uravnavanjem HO-1. Rezultati so dokazali, da je P. martini lahko potencialno terapevtsko sredstvo za zdravljenjenevrodegenerativnebolezni.

ZGODOVINA ČLANKAPrejeto 8. aprila 2019 Sprejeto 30. julija 2019

KLJUČNE BESEDEParaboea martini;feniletanoidni glikozidi; nevroprotektivni učinki; cinkov protoporfirin; HO-1

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Mehanizem nevroprotektivnega učinka Cistanche deserticola, kliknite tukaj, če želite izvedeti več

Znano je, da ima oksidativni stres bistveno vlogo pri patogenezi številnih bolezni. Povezana je z etiologijoAlzheimerjeva bolezen(AD), Parkinsonova bolezen (PD), epilepsija in druge bolezni [1–3]. Trenutno je bil dosežen stalen napredek pri preučevanju patogeneze AD, PD in drugih bolezni. Vendar pa zaradi omejenega poznavanja molekularnih mehanizmov, na katerih temelji AD, PD in druge bolezni, učinkovite preventivne ali kurativne strategije za te bolezni niso bile realizirane [4]. H2O2 je pomembna sestavina reaktivnih kisikovih spojin (ROS). V skladu s tem je poškodba celic PC12, ki jo povzroča H2O2-, najpogosteje uporabljen model oksidativnega stresa in se pogosto uporablja v eksperimentalnih študijah nevroprotektivnih učinkov [5]. Heme oksigenaza 1 (HO-1) in glutamat-cistein ligaza-katalitična podenota (GCLC) sta pomembna celična antioksidantna encima in oba gena sta regulirana nižje od jedrskega faktorja eritroida 2 (Nrf2), ki se pojavlja kot obetaven terapevtik cilj za nevroprotekcijo [6,7].Feniletanoidglikozidi, ki izhajajo iz enote C-6-C-3, vsebujejo veliko fenolnih hidroksilnih skupin in imajo pomembno antioksidativno delovanje ter delujejo proti staranju. V zadnjih nekaj letih so študije pokazale, da številne zdravilne rastline vsebujejo feniletanoidne glikozide, ki kažejo pomembno antioksidativno delovanje. Na primer, znano je, da imajo feniletanoidni glikozidi, pridobljeni iz Herba cistanche, zaščitne učinke na kognitivne pomanjkljivosti pri AD. Ta študija je raziskala povezani zaščitni mehanizem z uporabo modela AD senescence-accelerated prone mouse 8 (SAMP8). Rezultati so pokazali, da je sposobnost feniletanoidnih glikozidov za izboljšanje kognitivnih pomanjkljivosti pri miših SAMP8 lahko povezana s spodbujanjem sinaptične plastičnosti, ki vključuje antioksidativne procese [8]. V tej študiji sta bila dva feniletanoidna glikozida ločena in prečiščena iz grč Tectona grandis (tikovina); te spojine so pokazale opazne antioksidativne učinke, ki so bili določeni z amperometrično metodo [9]. Poleg tega kafeoil feniletanoidne glikozidne spojine iz Lindernia ruellioides in vitro izvajajo od odmerka odvisne antioksidativne in antioksidativne učinke odstranjevanja radikalov brez anionov [10]. Mehanizmi delovanja feniletanoidnih glikozidov so povezani z regulacijo signalne poti Nrf2/ARE, ki vpliva na sintezo SOD, CAT, GSH-PX in drugih antioksidativnih encimov [11]. Družina Gesneriaceae, ki vsebuje 150 rodov in približno 3700 vrst, je razširjena predvsem v tropskih in zmernih regijah vzhodne in južne Azije, Oceanije, Južne Amerike, Afrike, Južne Evrope in Mehike [12]. Gesneriaceae na Kitajskem vključuje 54 rodov in približno 463 vrst. Poročalo se je, da je približno 100 vrst medicinsko učinkovitih in da je večina teh v glavnem razširjena v provincah Guangxi in Guizhou [13]. V zadnjih letih so se raziskave rastlin Gesneriaceae postopoma povečale na različnih območjih sveta in odkrili so nekatere nove sestavine s fiziološkimi aktivnostmi [14]. Paraboea martinii (Levl.) Burtt pripada skupini Parabola (Gesneriaceae) in je zelnata rastlina. Na podlagi "The Chinese Traditional Medicine Resource Records" je bilo zabeleženo, da se cela rastlina uporablja kot zdravilo. Poleg tega lahko izvaja številne farmakološke aktivnosti pri stanjih, kot so hematemeza, edem, griža, travmatska poškodba in zlom [15]. Bai je to dokazalfeniletanoidglikozidiso ena glavnih kemičnih sestavin rastlin Gesneriaceae [16]. To so ugotovili tudi nekateri raziskovalcifeniletanoidglikozidihave significant antioxidant activities [17]. Li demonstrated that phenylethanoid glycosides of Cistanche deserticola have significant antioxidant activity [18]. In addition, Ju systematically studied the neuroprotective activities of phenylethanoid glycosides using PC12 cell models. The results indicated that phenylethanoid glycosides significantly attenuate the damage induced by Aβ1-42 [19]. In our studies, we isolated eight phenylpropanoid glycosides (paraboside A, paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B, isonuomioside A) from P. martini [20]. All compounds were isolated from the genus Parabola for the first time, and the compounds paraboside A, paraboside B, p paraboside I, paraboside II, and paraboside III were new compounds [20]. In a continuing search for molecules with antioxidant properties, phenylpropanoid glycosides were examined. However, whether these phenylpropanoid glycosides from P. martini could protect against H2O2-induced PC12 cell injury was previously unclear. In this study, we examined the protective effects of phenylpropanoid glycosides on H2O2-induced damage to PC12 cells. We also examined the effects and preliminary mechanism underlying the activity of phenylpropanoid glycosides with respect to the activation of HO-1 and GCLC in vitro. Materials and methods Materials Paraboea martini (Level.) Burtt was collected from Daxin County, Guangxi Autonomous Region in August 2014 and verified by Dr. Minhui Li (Baotou Medical College). Voucher specimens were deposited at the Laboratory of Pharmacognosy and Phytochemistry. Eight phenylpropanoid glycosides (paraboside A, paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B, isonuomioside A) were extracted and separated from P. martinii (Levl.) Burtt by prof. Xiaoqin Wang [20]. The purity (>98 odstotkov) osmih fenilpropanoidnih glikozidov je bilo izmerjeno z metodo normalizacije površine vrha HPLC. Kot primer sta na sliki 1 prikazani kromatografski karti parabozida B in parabozida II, njuna relativna vsebnost pa je bila 98,23 odstotka oziroma 99,20 odstotka. Slabo diferencirana celična linija podganjega nadledvičnega feokromocitoma (PC12) je bila kupljena pri Cell Bank na Kitajski akademiji znanosti (Šanghaj, Kitajska). Dulbeccov spremenjeni Eagleov medij (DMEM) in konjski serum sta bila kupljena pri Gibco (Gaithersburg, MD, ZDA). Fetalni goveji serum (FBS) je bil kupljen pri Thermo Fisher Scientific (Hyclone, Waltham, MA, ZDA). H2O2 je bil pridobljen pri Tianjin Fu Yu Reagent Co., Ltd. (Tianjin, Kitajska). Trizol je bil kupljen pri Invitrogenu (Carlsbad, CA, ZDA). PrimeScriptTM RT reagent Kit (Perfect Real Time) je bil pridobljen od TaKaRa Biotechnology Co. (Dalian, Kitajska). Primerje za HO-1, GCLC in GAPDH je sintetiziral Sangon Biotech (Šanghaj, Kitajska). Komplet CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) je bil pridobljen od Promega Corp. (Madison, ZDA). Inhibitorje HO-1 cinkovega protoporfirina (ZnPP) smo kupili pri Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, ZDA). Uporabljeni so bili tudi Thermo311 CO2 Incubator (Thermo, ZDA), StepOnePlusTM Real-Time PCR Instrument Thermal Cycling Block (Thermo), Thermo Scientific Multiskan FC (Thermo) in xCELLigence RTCA DPlus Analyzer and E-Plate 16 (ACEA Biosciences, ZDA). .

Kultura in zdravljenje celic

Celice PC12 smo gojili v DMEM, ki je vseboval 5 odstotkov FBS in 5 odstotkov konjskega seruma pri 37 stopinjah v vlažni atmosferi s 5 odstotki CO2. Celice PC12 so bile razdeljene v tri skupine, kot sledi: kontrolna skupina, modelna skupina in skupina za zdravljenje. Osem fenilpropanoidnih glikozidov smo raztopili v DMSO (< 0.01%)="" and="" then="" diluted="" with="" a="" complete="" culture="" medium.="" to="" study="" the="" effects="" of="" the="" eight="" phenylpropanoid="" glycosides="" on="" h2="" o2-induced="" cell="" injury,="" pc12="" cells="" were="" cultured="" with="" the="" eight="" compounds="" at="" concentrations="" of="" 3.125,="" 6.25,="" 12.5,="" 25,="" and="" 50="" μm="" for="" 12="">

Določanje H2O2

model, Ustrezno koncentracijo H2 O2 smo določili s pomočjo celične analize v realnem času (RTCA). Celice PC12 smo zasejali v mikroploščo CIM-plate-16 pri volumnu 100 µL in jih nato inkubirali 12 ur pri 37 stopinjah v atmosferi s 5 odstotki CO2. Celice PC12 so bile razdeljene v kontrolne in modelne skupine. Nato smo modelnim skupinam dodali 10 μL H2O2 (50, 100, 200 in 400 μM), kontrolne skupine pa smo obdelali z 10 μL popolnega DMEM, nastavljenega v treh kompleksnih vdolbinicah. E-plošča 16 je bila postavljena v xCELLigence RTCA, spremljana vsakih 15 minut in rezultati so bili zabeleženi 32 ur. Učinek H2O2 na celice PC12 smo analizirali s programsko opremo za analizo podatkov xCELLigence RTCA. Za določitev optimalne koncentracije H2O2 in trajanja delovanja smo uporabili vrednost celičnega indeksa (CI).

Ekstrakcija in izolacija spojine

Frakcije smo ločili glede na njihovo polarnost z uporabo predhodno opisanih metod. Na zraku posušen, v prah zmlet P. martinii (4 kg) smo zaporedno trikrat ekstrahirali s 75-odstotno vodno raztopino etanola [20]. Dobljene ekstrakte smo nato koncentrirali z uporabo rotacijskega uparjalnika, da smo odstranili etanol, in dobili smo surove ekstrakte. Vzorce smo raztopili v deionizirani vodi in nato zaporedno ekstrahirali s petroletrom, etil acetatom, n-butanolom in vodo. Ekstrakt n-butanola (400 g) je bil frakcioniran z uporabo kolone z makroporozno smolo AB-8 in raztopine etanol-H2O2 (0, 1{{47} }, 30, 50, 70 in 95 odstotkov ). Končno smo dobili šest frakcij (frakcije 1–6). Frakciji 3 in 4 smo ločili z uporabo MCI kolone s stopenjskim gradientom MeOH-H2O2 (10–100 odstotkov). Nato smo produkte izolirali z uporabo Sephadex LH-20 s 50 odstotki MeOH kot eluenta. Spojini 1 (41,0 mg) in 6 (15,6 mg) smo izolirali iz frakcije 3. Spojine 2 (62,0 mg), 3 (34,7 mg), 7 (11,0 mg) in 8 (26,0 mg) smo dobili iz frakcije 4 z uporabo Sephadexa. LH-20 kromatografija s 50-odstotnim MeOH kot eluentom. Končne izolacije smo izvedli s semi-prep HPLC z reverzno fazo (Merck LiChrosorb, RP-18, RP-18, 250 × 10 mm) s 50-odstotnim MeOH in UV detekcijo pri 280 nm, da smo dobili spojine 4 (39,0 mg) in 5 (9,0 mg) [20].

Test viabilnosti celic

Celice PC12 so bile posejane v 96-plošče z vdolbinicami z gostoto 2 × 1{{10}}4 celic/vdolbinico pri končni prostornini 100 µL . Celice PC12 smo 12 ur inkubirali pri 37 stopinjah s 5 odstotki CO2. Nato smo celice obdelali z različnimi koncentracijami surovih ekstraktov (0.025, 0,05, 0,1, 0,2 in 0,4 mg/mL) in spojin 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 in 8 pri petih koncentracijah (3,125, 6,25, 12,5, 25 in 50 μM). Po predobdelavi 24 ur je bila viabilnost celic določena s testi MTS. Celice PC12 smo predhodno inkubirali z ali brez zaviralca HO-1 brez ZnPP (15 μM) 30 minut, nato 12 ur inkubirali z ali brez kaleolariozida B, parabozida B in parabozida II (3,125 μM) in na koncu inkubirali s 400 μM H2O2 še 6 ur. Po zdravljenju je bilo število preživelih celic določeno s testom MTS [6].

Zaščitni učinki surovih ekstraktov in monomernih spojin na celice PC12, obdelane s H2O2-

Celice smo gojili v {{0}}plošči z vdolbinicami pri končni prostornini 100 µL. Obdelani skupini so dodali serijske razredčitve surovih ekstraktov (0.025, 0,05, 0,1, 0,2 in 0,4 mg/mL). Po 12-urni predobdelavi smo obdelani skupini in skupini H2O2 vsake vdolbinice za 6 ur dodali 400 μM raztopine H2O2 (optimalna koncentracija). V vsako vdolbinico smo nato dodali raztopino MTS in plošče inkubirali 3 ure pri 37 stopinjah C. Plošče smo nihali pri nizki hitrosti 5 minut pri sobni temperaturi, dokler niso bili vsi kristali popolnoma raztopljeni. Zaščita celic je bila določena na podlagi rezultatov testa MTS v skladu s proizvajalčevim 2204 X. GONG ET AL. Prenesel s https://academic.oup.com/bbb/article/83/12/2202/6044145 gost 27. avgusta 2021. Navodila. Optično gostoto smo določili pri valovni dolžini absorbance 490 nm. Nadalje smo sledili aktivnosti spojin 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 in 8, izoliranih iz frakcij 3 in 4. Serijske razredčitve spojin 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 in 8 (3,125, 6,25, 12,5, 25 in 50 μM) smo dodali zdravljeni skupini, da bi določili njihove ustrezne zaščitne učinke na celice PC12, ki jih povzroča H2O2-.

Kvantitativni PCR v realnem času (qRT-PCR)

Celice PC12 smo pobrali 12 ur po obdelavi s 3,125 μM kaleolariozida B, parabozida B in parabozida II. Celotno RNA smo ekstrahirali z uporabo TRIzol-reagenta in alikvote celotne RNA smo reverzno prepisali z uporabo Primescript RT Master Kit v skladu z navodili proizvajalca. Za poskuse so bili uporabljeni naslednji primerji v skladu s prejšnjim poročilom [21]. HO-1: naprej 5′ -GC CTGCTAGCCTGGTTCAAG-3′, vzvratno 5′ -AGC GGTGTCTGGGATGAACTA-3′; GCLC: naprej 5' - GTCCTCAGGTGACATTCCAAGC-3', vzvratno 5' -TG TTCTTCAGGGGCTCCAGTC-3'; GAPDH: naprej 5′-AAGCTGGTCATCAACGGGAAAC-3′, vzvratno 5′- GAAGACGCCAGTAGACTCCACG-3′. Alikvote pridobljenih cDNA smo nato pomnožili s PCR. Reakcijski pogoji so bili naslednji: začetna denaturacija pri 95 stopinjah (30 s), ki ji je sledilo 40 ciklov pri 95 stopinjah (5 s), 60 stopinjah (34 s) in 72 stopinjah (35 s). Vsi primerji so bili testirani in zaznan je bil fluorescenčni signal FL; nato je bila izračunana vrednost △Ct in relativne vrednosti primerjane z vrednostmi kontrolne skupine z uporabo naslednje enačbe: △Ct=Ct (vzorec) − Ct (endogena kontrola), △△Ct {{36} } △Ct (vzorec) −△Ct (neobdelan) in pregibna sprememba=2−△△Ct. Kot notranji nadzor je bila uporabljena gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza (GAPDH).

Ekstrakcija beljakovin

Celice PC12 so bile posejane na 100- mm posode pri 1 × 107 celic/posodo. Po pritrditvi smo celice 12 ur obdelali s kaleolariozidom B, parabozidom B in parabozidom II (3,125 µM). Glikozide smo nato odstranili in celice inkubirali s H2O2 še 6 ur. Po inkubaciji smo celice dvakrat sprali s hladnim PBS in postrgali iz posod z 1 ml PBS. Celične homogenate centrifugiramo pri 1500 obratih na minuto 10 minut. Po obdelavi smo celične proteine ​​ekstrahirali z uporabo pufra za lizo celic Beyotime RIPA z 1 mM PMSF v skladu z navodili proizvajalca. Poleg tega so bili izolirani citoplazemski in jedrski proteini, kot je opisano v protokolu kompleta za jedrsko in citoplazemsko ekstrakcijo Beyotime. Koncentracije beljakovin v vzorcih so bile odkrite s kompletom za analizo beljakovin Beyotime BCA in vsi vzorci so bili shranjeni pri -80 stopinjah za Western blotting analizo [6].

Western blot analiza

Elektroforeza SDS-PAGE je bila izvedena po ekstrakciji in kasnejši denaturaciji celotnega proteina iz različnih skupin. Po elektroforezi smo protein prenesli na PVDF membrane, ki smo jih nato 4 ure blokirali s 5-odstotnim posnetim mlekom v prahu. Po pranju primarno protitelo (kunčje poliklonsko protitelo GAPDH (1:10, 000 razredčitev), kunčje poliklonsko protitelo HO-1 (1:1000 razredčitev) ali zajčje poliklonsko protitelo GCLC (1:1000 razredčitev) smo dodali membranam, ki smo jih inkubirali čez noč pri 4 stopinjah. Naslednji dan smo membrane PVDF trikrat sprali v TTBS. Nato smo dodali sekundarno protitelo (konjugirani afinitetni čisti kozji anti-kunčji IgG (razredčitev 1:1000), označen s hrenom membranam smo dodali peroksidazo, ki smo jo nato inkubirali pri sobni temperaturi 2 uri.PVDF membrane smo sprali in izpostavili ECL kemiluminiscenčnemu detekcijskemu reagentu za signalizacijo izpostavljenosti na rentgenskem filmu, ki je bil nato fiksiran in skeniran [22].

Statistična analiza

Podatki so bili analizirani s programom SPSS 19.0, rezultati pa so predstavljeni kot srednje vrednosti s standardnim odklonom (SD) treh neodvisnih poskusov. Šteje se, da vrednosti p < 0.05="" kažejo="" na="" statistično="" pomembne="">

Rezultati Vzpostavitev modela H2O2

Kot je prikazano na sliki 2, H2O2 pri 50, 100 in 200 μM ni povzročil ustrezne ravni celične smrti. Vendar pa je 400 μM H2O2 delovalo na celice PC12 v 2–6 urah in oksidativna poškodba celic je bila stabilna. Zato smo menili, da je bila indukcija s H2O2 pri koncentraciji 400 μM za 6 ur primerna za posnemanje poškodbe celic PC12, ki jo povzroča oksidativni stres.

Zaščitni učinki surovih ekstraktov na celice PC12, obdelane s H2O2

V primerjavi s tistim v modelni skupini H2O2 (slika 3), ekstrakt n-butanola pri koncentracijah 0.05, 0.1, {{10} }.2 in 0.4 mg/mL sta znatno izboljšala oksidativno poškodbo celic PC12, ki jo je povzročil H2O2 (p < 0.05)="" na="" način,="" odvisen="" od="" koncentracije.="" ti="" podatki="" kažejo,="" da="" je="" frakcija="" n-butanola="" vsebovala="" močnejšo="" zaščitno="" aktivnost.="" vendar="" sta="" ekstrakta="" petrol="" etra="" in="" etil="" acetata="" pokazala="" zaščitno="" aktivnost="" le="" pri="" visokih="" koncentracijah="" (petrol="" eter:="" 0.1="" in="" 0.2="" mg/ml,="" p="">< 0.{{31}="" }5;="" etil="" acetat:="" 0,2="" in="" 0,4="" mg/ml,="" p="">< 0,05).="" poleg="" tega="" različne="" koncentracije="" ekstraktov="" vodne="" faze="" niso="" pokazale="" zaščitnih="" učinkov="" (p=""> 0,05). Poleg tega smo v dodatno datoteko dodali podatke iz validacijske študije z uporabo celičnih linij človeškega nevroblastoma SH-SY5Y (SH-SY5Y). Zdravljenje z 250 μM H2O2 je povzročilo zmanjšano viabilnost celic; vendar je zdravljenje s kaleolariozidom B, parabozidom B in parabozidom II (3,125, 6,25, 12,5, 25 in 50 µM) znatno oslabilo celično smrt SH-SY5Y. Rezultati poskusa so dokazali, da kaleolariozid B, parabozid B in parabozid II ščitijo celice SHSY5Y pred celično poškodbo, ki jo povzroči H2O2-.

Strukture spojin, izoliranih iz frakcije n-butanola

Da bi potrdili, da ekstrakt n-butanola vsebuje aktivne sestavine, smo dodatno frakcionirali osem spojin iz ekstrakcije. Strukture spojin 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 in 8 so bile identificirane z različnimi spektralnimi podatki (1H-NMR, 13C-NMR in ESI-MS) na podlagi primerjav z objavljenimi podatki za parabozid A. , parabozid B, parabozid I, parabozid II, parabozid III, nuomiozid A, kaleolariozid B oziroma izonuomiozid A [20]. Na primer, podatki za parabozid B so bili naslednji: rjava guma; ½ 20 D −55,7 (c 0,05, CH3OH) [20]; UVMeOH max nm (logε): 220 (3,61), 291 (3,54), 330 (3,66) [20]; IRKBr max cm−1 : 3392, 2943, 2885, 1699, 1683, 1606, 1521, 1361, 1282, 1163, 1114, 1039, 995, 817 cm−1 [20]; za 1H in 13C NMR spektroskopske podrobne podatke, prikazane v referenci 20; HR-ESI-MS (negativno) m/z 741,2231 [MH]- (izrač. za C33H41O19, 741,2242) [20]. Podatki za parabozid II so bili naslednji: beli amorfni prahovi; ½ 20 D -80,5 (c 0,05, CH3OH) [20]; UVMeOH max nm (logε): 229 (3,74), 322 (3,73) [20]; IRKBr max cm−1 : 3419, 1699, 1625, 1596, 1515, 1456, 1419, 1263, 1159, 1139, 1068, 1022, 808 cm−1 [20]; za 1H in 13C NMR spektroskopske podrobne podatke, prikazane v referenci 20; ESI-MS (negativno) m/z 637

Zaščitni učinki izoliranih spojin proti toksičnosti, ki jo povzroča H2 O2-, v celicah PC12

Testi MTS so bili uporabljeni za raziskovanje učinka izoliranih spojin na sposobnost preživetja celic PC12, izpostavljenih toksičnosti, ki jo povzroča H2O2-. Kot je prikazano na sliki 5, so celice PC12, predhodno obdelane s petimi različnimi koncentracijami kaleolariozida B, parabozida B, parabozida II ali parabozida A, v primerjavi s tistimi v kontrolni skupini (3,125, 6,25, 12,5, 25 in 50) µM) 24 ur ni pokazala pomembnih razlik v viabilnosti celic (p > 0,05). Tako predobdelava celic PC12 s kaleolariozidom B, parabozidom B in parabozidom II ni povzročila citotoksičnosti. Kot je prikazano na sliki 6, je 400 µM H2O2 znatno zmanjšalo viabilnost celic v primerjavi s tisto v kontrolni skupini. Poleg tega se je viabilnost celic PC12, obdelanih s H2O2-, izrazito povečala po predhodni obdelavi celic PC12 z različnimi koncentracijami kaleolariozida B, parabozida B in parabozida II; poleg tega je bila viabilnost celic največja po zdravljenju s 50 µM kaleolariozidom B, 50 µM parabozidom B in 12,5 µM parabozidom II. Ostalih pet spojin ni pokazalo pomembnih zaščitnih učinkov na celice PC12, obdelane s H2O2-. Za ponazoritev te ugotovitve razpravljamo o enem od teh kot primeru, medtem ko drugi niso opisani v rokopisu.

Ravni transkripcije HO-1 in GCLC

Nato smo testirali transkripcijske ravni HO-1 in GCLC v celicah PC12, obdelanih s kaleolariozidom B, parabozidom B in parabozidom II. Celotno mRNA smo 12 ur zbirali iz obdelanih in neobdelanih celic PC12 in nato podvrgli ekspresijski analizi s qRT-PCR. Kot je prikazano na sliki 7(a,c,e), so se transkripcijske ravni HO-1 znatno povečale po

Celice PC12 so bile predhodno obdelane z navedenimi koncentracijami kaleolariozida B, parabozida B in parabozida II 12 ur (p < 0.{{10}}5).="" kot="" je="" prikazano="" na="" sliki="" 7(b),="" so="" se="" transkripcijske="" ravni="" gclc="" znatno="" povečale="" tudi="" v="" celicah="" pc12,="" predhodno="" obdelanih="" z="" navedenimi="" koncentracijami="" kaleolariozida="" b="" 12="" ur.="" vendar="" so="" se="" ravni="" gclc="" v="" celicah="" pc12,="" predhodno="" obdelanih="" s="" parabozidom="" b="" 12="" ur,="" znatno="" zmanjšale="" v="" primerjavi="" s="" tistimi="" v="" modelni="" skupini="" (p=""><0,05; slika="" 7(d)).="" poleg="" tega="" pri="" zdravljenju="" s="" parabozidom="" ii="" ravni="" gclc="" v="" celicah="" pc12="" niso="" bile="" bistveno="" drugačne="" v="" primerjavi="" s="" tistimi="" v="" modelni="" skupini="" (p=""> 0,05; slika 7(f)).

Izraz HO-1 in GCLC

HO{{0}} in GCLC sta pomembna celična antioksidantna encima in oba sta Nrf2-regulirana gena na nižji stopnji. Po zdravljenju so opazili tudi ekspresijo beljakovin HO-1 in GCLC [6]. Slika 8 prikazuje ravni beljakovin HO-1 in GCLC v celicah PC12 po obdelavi s 400 μM H2O2; rezultati so pokazali, da so bile fluorescentne intenzivnosti FL HO-1 v skupinah s kaleleolariozidom B in parabozidom B večje od tistih v skupinah, zdravljenih s H2O2- (slika 8(a,c)). Vendar pa spojine niso bistveno spremenile izražanja GCLC, razen za kaleolariozid B (slika 8(b)). Nato so bili kemični inhibitorji HO -1 uporabljeni za nadaljnjo oceno vloge antioksidativnih encimov pri uravnavanju zaščitnih učinkov, ki jih izvajajo kaleolariozid B, parabozid B ali parabozid II proti citotoksičnosti, ki jo povzroča H2O2-. Kaleolariozid B, parabozid B in parabozid II (3,125 µM) so preprečili citotoksičnost, ki jo povzroča H2O2-, vendar je te zaščitne učinke obrnil zaviralec HO-1 ZnPP (p < 0,01)="" pri="" 15="" µm="" (slika="" 8).="">

Diskusija

Staranje prebivalstva je resen svetovni problem. Številne bolezni so povezane s senilnostjo, kot sta AD in PB, ki resno ogrožata javno zdravje. AD in PB sta postali tretji najbolj smrtonosni bolezni na svetu, takoj za srčno-žilnimi boleznimi in rakom. Zato je nevrodegeneracija postala nujna raziskovalna tema po vsem svetu. Vendar pa je patogeneza AD in PD, nevrodegenerativnih bolezni centralnega živčnega sistema, do danes ostala nejasna. Poleg tega obstaja le nekaj zdravil, ki lahko učinkovito zdravijo AD ali PD zaradi njihovih kompleksnih patogenih mehanizmov [23]. Prejšnje študije so pokazale, da so ROS, kot sta superoksidni anion (O2−) in H2O2, glavni dejavniki, ki prispevajo k nevrodegenerativnim boleznim. Patološke spremembe med PD vključujejo nevronsko degeneracijo in smrt substancije nigre in striatnega dopamina [24, 25]. Skladno s tem je pomembno razviti učinkovita antioksidantna zdravila za zdravljenje PB in takšno odkrivanje zdravil je postalo pomembna raziskovalna smer [26]. Trenutno se zdi, da je signalna pot Nrf2/ARE najpomembnejša pot endogenega antioksidativnega stresa [27]. ARE se nahajajo v 5′-flflonkirnih regijah genov, kot sta HO-1 in GCLC [28,29]. HO-1 in GCLC sta gena, povezana z Nrf2-, ki sta regulirana navzdol od tega proteina [6]. ARE lahko posledično vplivajo na ravni antioksidantov in aktivirajo nižjo ekspresijo HO-1 in drugih zaščitnih genov, kar bi lahko povečalo aktivnosti zaščite celic [30,31]. Poleg tega so ugotovitve pokazale, da se zaščitni učinki resveratrola proti toksičnosti, ki jo povzroči A 1-42- v celicah PC12, pojavijo s povečano ekspresijo HO-1 prek aktivacije znotrajcelične signalne poti Nrf2 [32].

Celice PC12 so sprejet model živčnih celic in se v veliki meri uporabljajo v študijah nevroprotektivnega učinka [33]. H2O2 zlahka prehaja skozi celično membrano in se združi z železom, da tvori visoko aktivne proste radikale, ki povzročajo oksidativni stres in poškodbe celic [34]. H2O2 je pomemben ROS, prosti radikali pa se zlahka ustvarijo in so relativno stabilni, zato se običajno uporabljajo za vzpostavitev modela oksidativnega stresa z uporabo celic PC12 [5]. V tej študiji je predhodna obdelava celic PC12 z netoksičnimi koncentracijami rastlinskega izvlečka zaščitila celice pred H2O2-inducirano citotoksičnost z zmanjšanjem nastajanja ROS. Feniletanoidni glikozidi vsebujejo veliko fenolnih hidroksilnih skupin, ki delujejo antioksidativno in preprečujejo staranje. V tej študiji smo ugotovili, da ekstrakcija n-butanola zagotavlja boljšo zaščito kot druge frakcije polarnosti (slika 3). Tako smo nadalje pregledali zaščitne aktivnosti osmih spojin, izoliranih iz frakcije n-butanola. Rezultati so prvič pokazali, da Slika 8. Analiza ravni beljakovin HO-1 in GCLC na celicah PC12. (a) Western blotting analiza ekspresije HO -1 ter GCLC in GAPDH je bila uporabljena kot kontrola obremenitve. (b) Western blot analiza Ekspresija proteina GCLC. (c) Western blot analiza Ekspresija proteina HO{{20}}. (d) HO-1 inhibitor ZnPP je zmanjšal nevroprotektivni učinek. Podatki so predstavljeni kot srednje vrednosti ± SD, n=3. ***p < 0.001="" v="" primerjavi="" s="" kontrolno="" skupino;="" #p="">< 0.05="" v="" primerjavi="" s="" skupino="" h2o2="" (brez="" obdelane="" z="" znpp),="" ##p="">< 0,01="" v="" primerjavi="" s="" skupino="" h2o2="" (brez="" obdelane="" z="" znpp),="" ###p="">< 0,001="" v="" primerjavi="" s="" skupino="" h2o2="" (brez="" znpp="" zdravljeni);="" in="" p="">< 0,01="" v="" primerjavi="" s="" skupino="" h2o2="" (z="" obdelano="" z="" znpp)="" in="" &p="">< 0,001="" v="" primerjavi="" s="" skupino="" s="" h2o2="" (z="" obdelano="" z="" znpp).="" (kontrolna="" skupina;="" modelna="" skupina:="" h2o2;="" negativna="" skupina="" znpp:="" kaleolariozid="" b="" plus="" h2o2,="" parabozid="" b="" plus="" h2o2,="" parabozid="" ii="" plus="" h2o2;="" pozitivna="" skupina="" znpp:="" znpp="" plus="" kaleolariozid="" b="" plus="" h2o2,="" znpp="" plus="" parabozid="" b="" plus="" h2o2,="" znpp="" plus="" parabozid="" ii="" plus="" h2o2).="" 2210="" x.="" gong="" et="" dru.="" prenesel="" gost="" 27.="" avgusta="" 2021.="" kaleolariozid="" b,="" parabozid="" b="" in="" parabozid="" ii="" imajo="" pomembne="" zaščitne="" učinke="" proti="" oksidativnim="" poškodbam="" celic="" pc12,="" ki="" jih="" povzroča="" h2o2-.="" rezultati="" so="" tudi="" pokazali,="" da="" je="" zdravljenje="" s="" h2o2="" povzročilo="" znatno="" poškodbo="" celic="" pc12="" in="" zmanjšalo="" sposobnost="" preživetja="" celic,="" medtem="" ko="" je="" zdravljenje="" s="" kaleolariozidom="" b,="" parabozidom="" b="" in="" parabozidom="" ii="" znatno="" ublažilo="" te="" učinke="" (slika="" 6).="" prejšnja="" študija="" je="" poročala,="" da="" je="" pot="" nrf2/are="" ena="" najpomembnejših="" endogenih="" antioksidativnih="" poti="" in="" lahko="" poveča="" izražanje="" nižjih="" markerjev,="" kot="" je="" ho="" -1,="" za="" zaščito="" celic="" [7].="" rezultati="" qrt-pcr="" in="" western="" blotting="" analiz="" so="" pokazali,="" da="" so="" kaleolariozid="" b,="" parabozid="" b="" in="" parabozid="" ii="" znatno="" povečali="" ravni="" ho-1.="" vendar="" so="" se="" transkripcijske="" ravni="" gclc="" znatno="" povečale="" v="" celicah="" pc12,="" predhodno="" obdelanih="" s="" kaleolariozidom="" b,="" vendar="" so="" se="" zmanjšale="" pri="" tistih,="" predhodno="" obdelanih="" s="" parabozidom="" b,="" v="" primerjavi="" s="" tistimi="" v="" modelni="" skupini.="" poleg="" tega="" arabinozid="" ii="" ni="" spremenil="" izražanja="" tega="" markerja="" v="" primerjavi="" s="" tistim="" v="" modelni="" skupini="" (sliki="" 7="" in="" 8="" (a–c)).="" poleg="" tega="" so="" bili="" zaščitni="" učinki="" kaleolariozida="" b,="" parabozida="" b="" in="" parabozida="" ii="" proti="" poškodbi="" celic="" pc12,="" ki="" jo="" povzroča="" h2o2-,="" obrnjeni="" z="" zaviralcem="" ho-1="" znpp="" (slika="" 8(d)).="" skratka,="" feniletanoidni="" glikozidi="" caleo="" larioside="" b,="" arabinoside="" b="" in="" paraboside="" ii="" so="" učinkovito="" zaščitili="" celice="" pc12="" pred="" oksidativno="" škodo,="" ki="" jo="" povzroči="" h2o2-.="" v="" skladu="" s="" tem="" lahko="" te="" spojine,="" izolirane="" iz="" p.="" martini,="" predstavljajo="" potencialne="" kandidate="" za="" zdravila="" za="" zdravljenje="" nevrodegenerativnih="">

Avtorski prispevkiLM in ZC sta zasnovala in oblikovala poskuse. GX, RK in BX so izvedli poskuse. GX in XY sta napisala nalogo. GX, XY, RK, BX, ZC in LM so razpravljali o rezultatih in komentirali rokopis. Vsi avtorji so prebrali in odobrili končni rokopis.

Izjava o razkritjuAvtorji niso poročali o morebitnem navzkrižju interesov. Financiranje To delo so podprli raziskovalni skladi Baotou Medical College [številka dotacije: BYJJ-YF 201727] in posebna subvencija za javno zdravstveno službo kitajske medicine za leto 2018 »četrta raziskava o kitajskem viru materia medica« [številka dotacije: Finance Society [2018 ] 43].

Reference

[1] Butterfield DA. Pogledi na oksidativni stres pri Alzheimerjevi bolezni in napovedi poudarkov prihodnjih raziskav. J Alzheimer Dis. 2018; 64: 1–11.

[2] Chignon C, Tomas M, Bonnefontrousselot D, et al. Oksidativni stres in amiloid-beta peptid pri Alzheimerjevi bolezni. Redox Biol. 2018; 14: 450–464.

[3] Guo JD, Zhao X, Li Y, et al. Poškodba dopaminergičnih nevronov z oksidativnim stresom pri Parkinsonovi bolezni (pregled). Int J Mol Med. 2018; 41: 1817–1825.

[4] Bai Y, Dong LH, Huang XH et al. Povezava polimorfizmov rs823128, rs1572931 in rs823156 z zmanjšanim tveganjem za Parkinsonovo bolezen. Nevroporočilo. 2017; 27: 936–941.

[5] Han XH, Zhu SL, Wang BX et al. Antioksidativno delovanje 7,8-dihidroksiflflavona ščiti celice PC12 pred citotoksičnostjo, ki jo povzroča 6-hidroksidopamin. Neurochem Int. 2014; 64: 18–23.

[6] Li MQ, Xu T, Zhou F et al. Nevroprotektivni učinki štirih feniletanoidnih glikozidov na apoptozo, ki jo povzroči H2O2- na celicah PC12 preko poti Nrf2/ARE. Int J Mol Sci. 2018; 19: 1135.

[7] Buendia I, Michalska P, Navarro E et al. Pot Nrf2-ARE: nastajajoča tarča proti oksidativnemu stresu in nevrovnetju pri nevrodegenerativnih boleznih. Pharmacol Therapeut. 2016; 157: 84–104.

[8] Jia XJ, Yan XS, Cai ZP et al. Učinki feniletanoidnih glikozidov, pridobljenih iz Herba cistanche, na kognitivne pomanjkljivosti in antioksidativne aktivnosti pri samcih miši SAMP8. J Toxicol Env Heal A. 2017; 80: 1180–1186.

[9] Tsvetkov DE, Dmitrenok AS, Tsvetkov YE, et al. Feniletanoidni glikozidi iz grč tikovega lesa in njihova antioksidativna aktivnost. J Biol Active Prod Nat. 2016; 6: 272–281.

[10] Zhang YQ, Gao EY, Liang CQ et al. Antioksidativna aktivnost kafeoil feniletanoidnih glikozidnih spojin iz Lindernia ruellioides in vitro. Cent South Pharm. 2017; 15: 1687–1690.

[11] Wu ZH, Ma YF, Zhao L, et al. Vloga poti Nrf2-ARE pri poškodbah zaradi oksidativnega stresa in njen odnos z drugimi signalnimi potmi. Anim Husbandry Feed Sci. 2016; 37: 42–48.

[12] Zheng XK, Li J, Feng WS et al. Napredek pri preučevanju Gesneriaceae. Chin J Novo zdravilo. 2003; 12: 261–263.

[13] Wen F, Li ZD. Napredek raziskav o rastlini Gesneriaceae. Vir divjih rastlin Chin. 2006; 25: 1–6.

[14] Yan WY, Chen L, Wang JM, et al. Napredek raziskav triterpenoidov rastlin Gesneriaceae. Nat Prod Res Dev. 2012; 24: 698–701.

[15] Kitajsko podjetje za zeliščna zdravila. Zapisi virov kitajske tradicionalne medicine. Kitajska: Science Press; 1994.

[16] Bai ZF, Wang XQ, Xiao PG et al. Porazdelitev feniletanoidnih glikozidov v zdravilnih rastlinah Gesneriaceae. Chin J Chin Mater Med. 2013; 38: 4267–4270.

[17] He ZD, Lau KM, Xu HX et al. Antioksidativna aktivnost feniletanoidnih glikozidov iz Brandisia hancei. J Etnofarmakol. 2000; 71: 483–486.

[18] Li L, Shi DF, Gui YG et al. Študija o antioksidativnih aktivnostih feniletanoidnih glikozidov iz Cistanche deserticola. J Anhui Agri Sci. 2009; 32: 15835–15836.

[19] Ju BW, Yang JH, Yan Y, et al. Zaščitni učinki glikozidov cistanche na poškodbe celic PC12 PARABOLA MARTINI ŠČITI CELICE PC12 PRED H2O2-IZVZROČENO POŠKODBO 2211