Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Kliknite tukaj za informacije o I. delu (Uvod, materiali in metode) tega članka.

Kako kitajska zdravila, ki tonirajo ledvice, zavirajo apoptozo dopaminergičnih nevronov?

Shaogang Lin, 1 Shuifen Ye, 2 Jinmu Huang, 1 Yun Tian, ​​3 Yihui Xu, 2 Mengqi Wu, 2 Jingxia Wang, 2 Songying Wu, 4 in Jing Cai, MD, Ph.D.2

MATERIALI IN METODE

Oblikovanje

In vitro primerjalno opazovanje serumske farmakologije.

Čas in nastavitev

Poskusi so bili izvedeni v Laboratoriju za citobiologijo, Univerza za tradicionalno kitajsko medicino Fujian, Kitajska od leta 2010 do 2011.

Materiali

Živali

Skupno 60 podganjih samcev Wistar, starih 8 tednov, težkih 200–220 g, je bilo kupljenih pri SLAC Laboratory Animal Co., Ltd., Šanghaj, Kitajska (licenca št. SCXK (Hu) {{4} }). Nastanjeni so bili v Laboratory Animal Center Univerze tradicionalne kitajske medicine Fujian na Kitajskem pri 20–22 stopinjah z vlažnostjo 40–60 odstotkov in osvetlitvijo od 7:00 do 19:00. Hrano je zagotavljal Center za laboratorijske živali Univerze tradicionalne kitajske medicine Fujian. Vsi poskusni postopki so bili v skladu s predlogi smernic za nego in uporabo laboratorijskih živali, ki jih je oblikovalo Ministrstvo za znanost in tehnologijo Kitajske[33].

Cistanche za izboljšanje delovanja ledvic

Droge

Herba Epimedii, nadzemni del Epimedium sagittatum Maxim je bil iz province Sichuan na Kitajskem; Semen Cuscutae, suho zrelo seme Cuscuta Chinensis Lam., je bilo iz province Shandong na Kitajskem; in Herba Cistanches, chylocaulous luskastega lista Cistanche deserticola YCMa, je bila iz avtonomne regije Xinjiang Uygur. Vsa zdravila je zagotovilo podjetje Fujian Pharmaceutical Co., Ltd., provinca Fujian, Kitajska. Herba Epimedii, Semen Cuscutae in Herba Cistanches, po 97,2 g, smo potopili v posodo za decokcijo, ki je vsebovala 1 500 ml destilirane vode, na hitro segreli, zavreli, vzdrževali pri 100 stopinji do pustimo, da se aktivne sestavine zdravil raztopijo in kondenzirajo na 540 ml. Surova količina zdravila v raztopini zdravila je bila 0,180 g/mL. Raztopino filtriramo, damo v steklenico, zapremo, steriliziramo in shranimo pri 4 stopinjah. Selegilin, 5 mg × 10 tablet na komplet, je bil kupljen pri Nanjing Sike Pharmaceutical Co., Ltd. (provinca Jiangsu, Kitajska). Selegilin, 21,6 mg, smo raztopili v dvakrat destilirani vodi, da smo pripravili 540 ml vodne raztopine. Koncentracija raztopine zdravila je bila 0,04 mg/mL. Raztopino zdravila smo dali v steklenico, zapečatili, sterilizirali in shranili pri 4 stopinjah.

Metode

Priprava seruma, ki vsebuje zdravilo

Skupine Herba Epimedii, Semen Cuscutae, Herba Cistanches in selegilina so bile intragastrično perfundirane s serumom, ki je vseboval zdravilo, ki je vseboval 0.180 g/mL Herba Epimedii, Semen Cuscutae ali Herba Cistanches ali {{ 5}}.04 mg/mL selegilina, dvakrat na dan, v odmerku 0.1 ml/kg, 14 zaporednih dni. Skupini s slepim serumom smo dali enako količino destilirane vode. Živalim smo 12 ur po končnem dajanju odvzeli hrano in vodo. Podgane smo anestezirali z intraperitonealno injekcijo 0,3 ml/100 g ketamin hidroklorida. Kri smo odvzeli iz trebušne aorte in centrifugirali pri 1 000 vrt/min 15 minut. Supernatant smo pobrali, deaktivirali v vodni kopeli pri 56 stopinjah 30 minut, filtrirali skozi 0,22 μm mikroporozno membrano in shranili pri –20 stopinjah.

Priprava 50×Satove raztopine

Mešanica 60 mL DMEM/F12 (Gibco, Carlsbad, CA, ZDA), 15 mg govejega insulina (Sigma, St. Louis, MO, ZDA), 15 mg transferina (Sigma), 145,8 mg natrijevega piruvata (Biosharp, Koreja), 12 mg putrescina (Solarbio, Peking, Kitajska), 25 μl natrijevega selenita (1 mg/ml, 100 mg/100 ml H2O; Sigma) in 100 μl progesterona (0,315 mg). /mL, 15,75 mg/50 ml; Biosharp) smo 1,5 ure izpostavili ultrazvoku v ledeni kopeli, filtrirali skozi 0,22 μm filter, alikvotirali in shranili pri –20 stopinjah.

Cistanche za zdravljenje delovanja ledvic

Kultura celic

Celice so bile zasejane v DMEM/F12, dopolnjenem s 5 odstotki (v/v) fetalnega govejega seruma (Gibco), 1 odstotkom (v/v) glutamina (Sigma), 2 odstotki (v/v) 50×Sato's. raztopino in 2 odstotka (v/v) penicilina/streptomicina. Celice smo nato inkubirali v 5 odstotkih (v/v) CO2 in vzdrževali pri nasičeni vlažnosti pri 37 stopinjah. Celice smo tripsinizirali z 0,25 odstotka (m/v) tripsina in jih pasirali. Celice v logaritemski fazi so bile zbrane za nadaljnje poskuse.

Vpliv H2O2 na rast celic MES23.5

Celice so bile posejane v 96-plošče za kulture vdolbinic (5 × 105 celic/vdolbinico), inkubirane s 50, 100, 150, 200, 300 in 400 μmol/L raztopine kulture H2O2 (Shanghai Shiyi Chemicals Reagent Co., Ltd. ., Šanghaj, Kitajska) po 24 urah za 1, 3, 6, 9, 12, 24 ur, čemur je sledil MTT (Sigma) za 4 ure. Raztopino v vdolbinicah smo zavrgli in dodali 150 μL dimetil sulfoksida (Sigma). Kulturno ploščo smo stresali 10 minut in določili absorbanco vzorcev pri 570 nm z uporabo avtomatskega bralnika mikroplošč (EXL800; Biotek, Winooski, VT, ZDA). Kot negativno kontrolo smo uporabili sveže pripravljeno raztopino kulture DMEM/F12. V vsaki časovni točki sta bili postavljeni dve vzporedni vdolbinici. Poskusi so bili izvedeni v treh izvodih.

Vpliv seruma, ki vsebuje zdravilo v različnih koncentracijah, na rast celic MES23.5, obdelanih s H2O2-

Celice smo zasejali in za 24 ur izpostavili serumu, ki je vseboval zdravilo in je vseboval 5, 10, 15, 20, 25 in 30 odstotkov (v/v) Herba Epimedii, Semen Cuscutae, Herba Cistanches in selegilin ali slepi serum. Celice smo nadalje gojili z raztopino kulture, ki je vsebovala 100 μmol/L H2O2 3 ure, čemur je sledil MTT 4 ure. V vsaki skupini so bile postavljene tri vzporedne vdolbinice. Kot negativno kontrolo smo uporabili sveže pripravljeno raztopino kulture DMEM/F12. Celice, gojene v raztopini kulture, ki vsebuje 100 μmol/L H2O2 in slepi serum, so služile kot modelna skupina, celice, gojene samo v slepem serumu, pa so služile kot slepa serumska skupina. Poskusi so bili izvedeni v treh izvodih. Povprečna vrednost absorbance vsake skupine je bila izračunana kot stopnja preživetja celic.

Pretočna citometrija za izražanje FasL, Fas, kaspaze-3 in Bcl-2 v celicah MES23.5

Celice smo posejali in obdelali kot prej. Celice, gojene samo v 100 μmol/L H2O2, so veljale za modelno skupino. Protitelo FasL, označeno s fikoeritrinom, in kontrolo izotipa FasL (po 5 μL) smo dodali v dve epruveti (BD, San Jose, CA, ZDA), enakomerno pomešali s celicami, shranili pri sobni temperaturi v temi 15 minut, centrifugirali pri 1 000 vrt/min 5 minut po dodatku 2 mL PBS. Supernatant smo zavrgli in celice resuspendirali z uporabo 500 μL PBS. Valovna dolžina laserske naprave za pretočno citometrijo (Facscalibur; BD) je bila 488 nm. Hitrost izražanja FasL-pozitivnih celic je bila analizirana in izračunana s programsko opremo Cell Quest (BD). Hitrost izražanja Fas-, kaspaza-3- in Bcl-2-pozitivnih celic je bila odkrita z isto metodo.

ELISA za vsebnost živčnega rastnega faktorja, nevrotrofnega faktorja, pridobljenega iz možganov, in nevrotrofnega faktorja, pridobljenega iz celične linije glije, v celicah

Celice smo posejali in obdelali, kot je opisano prej. Supernatant smo pobrali in izmerili vsebnost živčnega rastnega faktorja, nevrotrofnega faktorja, pridobljenega iz možganov, in vsebnost nevrotrofičnega faktorja, pridobljenega iz celične linije glije, v skladu z navodili proizvajalca (BD). Absorbanco smo izmerili pri 450 nm z avtomatskim bralnikom mikroplošč (EXL800; Biotek, Winooski, VT, ZDA).

Statistična analiza

Rezultati so bili izraženi kot povprečje ± SD. Podatki so bili analizirani s programsko opremo SPSS 18.0 (SPSS, Chicago, IL, ZDA). Izvedena je bila enosmerna analiza variance, ki ji je sledila večkratna primerjava najmanj pomembnih razlik. Vrednost P < 0.05="" je="" veljala="" za="" statistično="">

Cistanche za delovanje ledvic

Zahvala

Zahvaljujemo se Chen B, Laboratoriju za nevrobiologijo, Medicinska univerza Capital, za prijazno zagotavljanje MES23.5dopaminergičniživčne celice.

Opombe pod črto

Financiranje: to študijo sta podprla Razvojni sklad Chen Keji Integrative Medicine, št. CKJ2010025 in Ključna podlaga za razvoj družbe v provinci Fujian, št. 2013Y0059.

Nasprotja interesov: Niso navedena.

Etična odobritev: Ta študija je prejela dovoljenje Odbora za etiko živali Univerze tradicionalne kitajske medicine Fujian, Kitajska.

(Recenzirali Diwakarla S, Norman C, Cheng HY, Wang JM)

(Uredili Wang LM, Su LL, Li CH, Song LP, Liu WJ, Zhao M)

REFERENCE

[1] Zhang ZX, Roman GC, Hong Z, et al. Parkinsonova bolezen na Kitajskem: razširjenost v Pekingu, Xianu in Šanghaju. Lanceta. 2005;365(9459):595–597. [PubMed] [Google Scholar]

[2] He JC, Wang WW. Učinek Tianma Gauteng Yin naapoptozaoddopaminergičninevronov pri modelih podgan s Parkinsonovo boleznijo. Zhongyi Zazhi. 2010; 51 (11): 1024–1027. [Google Učenjak]

[3] Perier C, Bové J, Vila M. Mitohondriji in programirana celična smrt pri Parkinsonovi bolezni:apoptozain naprej. Antioksidni redoks signal. 2012;16(9):883–895. [PubMed] [Google Scholar]

[4] Gallagher DA, Schapira AH. Etiopatogeneza in zdravljenje Parkinsonove bolezni. Curr Top Med Chem. 2009;9(10):860–868. [PubMed] [Google Scholar]

[5] Rangasamy SB, Soderstrom K, Bakay RA, et al. Terapija z nevrotrofičnim faktorjem za Parkinsonovo bolezen. Prog Brain Res. 2010; 184: 237–264. [PubMed] [Google Scholar]

[6] Zuccato C, Cattaneo E. Nevrotrofični faktor, pridobljen iz možganov pri nevrodegenerativnih boleznih. Nat Rev Neurol. 2009;5(6):311–322. [PubMed] [Google Scholar]

[7] Cai DF, Chen XQ, Gao Y. Vpliv recepta grmovja yangban na nigrostriatalno funkcijo pri podganah s parkinsonskim modelom po dolgotrajnem zdravljenju z levodopo. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 2002; 22 (1): 43–46. [PubMed] [Google Scholar]

[8] Yang MH, Wang HM, Liu Y. Učinek decokcije Bushen Huoxue na receptor sirote in tirozin hidroksilazo v možganih podgan s Parkinsonovo boleznijo. Chin J Integr Med. 2011;17(1):43–47. [PubMed] [Google Scholar]

[9] Li SD, Liu Y, Yang MH. Učinki grmovja Huo Xue yin na vsebnost NF-kB in NO v možganih pri miški modelu Parkinsonove bolezni. J Tradit Chin Med. 2012;32(1):67–70. [PubMed] [Google Scholar]

[10] Tian Y, Cai J, Chen XZ et al. Zaščitni učinki kitajske prehraneledvicazelišča na nevronih striatnih nevronov pri mišjem modelu Parkinsonove bolezni. Zhongguo Laonian Xue Zazhi. 2011;31(3):440–443. [Google Učenjak]

[11] Yu H, Li YH, Feng XL, et al. Identifikacija in analiza aktivnosti tirozin hidroksilaze v celicah MES23.5. Zhongguo Shengwu Huaxue yu Fenzi Shengwu Xuebao. 2004;20(1):95–100. [Google Učenjak]

[12] Wang XR. Peking: Ljudska medicinska založba; 2007. Toksikološke eksperimentalne metode in tehnologija. [Google Učenjak]

[13] Lv SJ. Peking: China Medical Science Press; 2010. Klinični imunološki test. [Google Učenjak]

[14] Eriksen JL, Wszolek Z, Petrucelli L. Molekularna patogeneza Parkinsonove bolezni. Arch Neurol. 2005;62(3):353–357. [PubMed] [Google Scholar]

[15] Christen Y. Oksidativni stres in Alzheimerjeva bolezen. Am J Clin Nutr. 2000;71(2):621S–629S. [PubMed] [Google Scholar]

[16] Blandini F, Armenteros MT, Fancellu R, et al. Nevroprotektivni učinek razagilina pri glodavskem modelu Parkinsonove bolezni. Exp Neurol. 2004; 187 (2): 455–459. [PubMed] [Google Scholar]

[17] Zhang XN, Wang HH, Wang ZQ et al. Zaščitni učinek ikariina naapoptozaprimarno kultiviranih podganjih nevronov, induciranih s peptidom Aâ{0}}. Zhejiang Daxue Xuebao: Yixue Ban. 2007;36(3):224–228. [PubMed] [Google Scholar]

[18] Wang LH, Bu PC, Bao YM. Nevroprotektivni učinek izvlečkov Cuscuta Chinensis Lam na nevronsko diferencirane poškodbe celic PC12, ki jih povzročajo reaktivne kisikove vrste. Xibao Shengwu Xue Zazhi. 2005; 27: 69–72. [Google Učenjak]

[19] Sun SL, Wang B, Peng HS. Zaviranje izvlečkov Dodder na srčni miocitapoptozapri starajočih se miših. Zhongguo Laonian Xue Zazhi. 2011; 31: 642–644. [Google Učenjak]

[20] Yang JH, Hu JP, Rena K, et al. Razmerja med strukturo in aktivnostjo feniletanoidnih glikozidov v rastlinah Cistanche salsa na antioksidativno aktivnost. Zhong Yao Cai. 2009;32(7):1067–1069. [PubMed] [Google Scholar]

[21] Wu Y, Li L, Wen T, et al. Zaščitni učinki ehinakozida na hepatotoksičnost, ki jo povzroča ogljikov tetraklorid pri podganah. Toksikologija. 2007;232(1-2):50–56. [PubMed] [Google Scholar]

[22] Cheng SD. Peking: Ljudska medicinska založba; 2006. Parkinsonova bolezen. [Google Učenjak]

[23] Yang T. Peking: Ljudska medicinska založba; 2010. Biologija celice. [Google Učenjak]

[24] Baba N, Koji T, Itoh M, et al. Recipročne spremembe v izražanju Bcl-2 in Bax v hipoglosalnem jedru po aksotomiji pri odraslih podganah: možna vpletenost v indukcijo smrti nevronskih celic. Brain Res. 1999;827(1-2):122–129. [PubMed] [Google Scholar]

[25] Zuccato C, Cattaneo E. Nevrotrofični faktor, pridobljen iz možganov pri nevrodegenerativnih boleznih. Nat Rev Neurol. 2009;5(6):311–322. [PubMed] [Google Scholar]

[26] Peterziel H, Unsicker K, Krieglstein K. TGFbeta inducira odzivnost GDNF v nevronih z rekrutiranjem GFRalpha1 na plazemsko membrano. J Cell Biol. 2002;159(1):157–167. [PMC brezplačen članek] [PubMed] [Google Scholar]

[27] Hong M, Mukhida K, Mendez I. GDNF terapija za Parkinsonovo bolezen. Strokovnjak Rev Neurother. 2008; 8 (7): 1125–1139. [PubMed] [Google Scholar]

[28] Chaturvedi RK, Shukla S, Seth K, et al. Faktor rasti živcev poveča preživetjedopaminergičnipresadka, rešuje nigralne dopaminergične nevrone in obnavlja funkcionalne pomanjkljivosti pri podganjem modelu Parkinsonove bolezni. Neurosci Lett. 2006;398(1-2):44–49. [PubMed] [Google Scholar]

[29] Kavanagh ET, Loughlin JP, Herbert KR, et al. Funkcionalnost celic PC12, zaščitenih z NGF, po izpostavljenosti 6-hidroksidopaminu. Biochem Biophys Res Commun. 2006;351(4):890–895. [PubMed] [Google Scholar]

[30] Baquet ZC, Bickford PC, Jones KR. Nevrotrofični faktor, pridobljen iz možganov, je potreben za vzpostavitev ustreznega številadopaminergičninevroni v substantia nigra pars compacta. J Neurosci. 2005; 25 (26): 6251–6259. [PMC brezplačen članek] [PubMed] [Google Scholar]

[31] Hung SY, Liou HC, Fu WM. Mehanizem delovanja hem oksigenaze-1 je vključen v povečanje izražanja nevrotrofičnega faktorja. Nevrofarmakologija. 2010;58(2):321–329. [PubMed] [Google Scholar]

[32] Duarte EP, Curcio M, Canzoniero LM, et al. Nevrozaščita z GDNF v ishemičnih možganih. Rastni dejavniki. 2012;30(4):242–257. [PubMed] [Google Scholar]

[33] Ministrstvo za znanost in tehnologijo Ljudske republike Kitajske. Predlogi smernic za nego in uporabo laboratorijskih živali. 30. september 2006; [Google Učenjak]