Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Izboljšanje proizvodnje feniletanoidnih glikozidov z elicitorjem gliv v kulturi celične suspenzije Cistanche deserticola

Cui-tao Lu¹,∗ & Xing-guo Mei²

Ključne besede Cistanche deserticola, sproščalec gliv,feniletanoidni glikozid, kultura rastlinskih celic

Povzetek
Ko se 15. dan rasti pojavi elicitor izFusarium solanije bilo dodano 40 mg l^-1 doCistanche deserticolacelične suspenzijske kulture, vsebnost ehinakozida, akteozida in skupnegafeniletanoidni glikozidi(PeG) v gojenih celicah se je v naslednjih 27 dneh povečalo za več kot 100 odstotkov na 15 mg g^-1suha teža, 9 mg g-1 suha teža in 57 mg g^-1 suhe teže oz. Končna biomasa (1,3 mg suhe mase ml^-1) ni bil prizadet.

Cistanche deserticola

Uvod

Cistanche deserticolaMa. (Orobanchaceae), avtohtono zelišče s Kitajske, se pogosto uporablja v tradicionalni medicini za različna zdravljenja, vključno z uporabo kot pomirjevalo ali ojačevalec imunskega odziva (Hsu et al. 1995, Chang et al. 1995).Feniletanoidni glikozidi(PeG) so glavni bioaktivni metaboliti vCistanche deserticola(Xiong et al. 2000) in so sestavljeni iz številnih sestavin, kot so ehinakozid, akteozid, cizakteozid, izoakteozid, 2-acetilakteozid, cistanozid A in osmantusid B (Wang et al. 2000). Z naraščajočim povpraševanjem po teh izdelkih in hitrim upadomCistanche deserticolarastlin, bi bila celična kultura privlačno alternativno sredstvo pridelave. Številni elicitatorji (zlasti glivični elicitatorji) lahko povečajo proizvodnjo presnovkov v kulturi rastlinskih celic (Wang et al. 2001). Li et al. (1998) so ugotovili, da je glivni povzročitelj Fusarium solani izoliran iz koreninskega sistema obehCistanche deserticolain njegov gostitelj, Halaxylon ammodendron, bi lahko izboljšal vsebnost aminokislin v kalusihCistanche deserticolaToda spremembe vsebnosti PeG v tej liniji kalusa v njihovi študiji niso bile omenjene. V tem prispevku so proučevali učinke elicitorja iz F. solani na biosintezo skupnih PeG in dveh glavnih bioaktivnih PeG (ehinakozid in akteozid) ter na spremembe celične rasti v suspenzijski kulturiCistanche deserticola.

Materiali in metode

Kulture rastlinskih celic
Kalus je nastal iz luskCistanche deserticolain vzdrževan na Gamborgovem mediju B5 (1968), dopolnjenem z 0.5 mg indol-3-ocetne kisline l^-1, 2 mg kinetina l^-1,in 1 g hidrolizata kazeina l^-1. Pred sterilizacijo smo pH naravnali na 6. Vsi poskusi so bili izvedeni v 250 ml stresalnih bučkah, od katerih je vsaka vsebovala 100 ml medija na rotacijskem stresalniku (120 vrt/min in 25 stopinj) v temi. Inokulum je bil približno 100 g svežega wt l^-1.

učinkovita vsebina cistanche deserticola--feniletanoidni glikozid

Priprava elisitorja gliv

Ločevanje seva glive, Fusarium solani, in pripravo glivičnega elicitorja smo izvedli, kot je opisano prej (Li et al. 1998, Yu et al. 2001). Različne količine (ekvivalentov ogljikovih hidratov) glivičnega elicitorja smo dodali kulturam v stresalni bučki 15. dan (skupno obdobje kulture je bilo 42 dni).

Test kopičenja biomase in sposobnosti preživetja
Celice iz stresalne bučke smo sprali z destilirano vodo in liofilizirali do konstantne teže. Tako smo določili suho maso. Viabilnost celic (odstotek živih celic v celični populaciji) je bila določena z redukcijo 2,3,5-trifenil tetrazolijevega klorida (Towill & Mazur 1975).

feniletanoidni glikozidodcistanche deserticola

Določanje vsebnosti ehinakozida, akteozida in skupnegafeniletanoidni glikozidi(PeGs)
Ekstrakcija PeG je bila izvedena po metodi Du & Liu (1993). LiofiliziranoCistanche deserticolacelice smo ekstrahirali s 70 odstotki (v/v) etanola. Etanolno frakcijo smo koncentrirali, razmastili z etil acetatom, nasičenim z vodo, in nato izlužili z n-butanolom, nasičenim z vodo. Frakcijo n-butanola smo koncentrirali, raztopili v vodi, naložili v kolono smole z makroporami (AB-8, kemični produkt univerze Nankai, Tianjin, Kitajska) in zaporedoma eluirali z vodo in metanolom. Zbrali smo metanolno frakcijo in določili skupno vsebnost PeGs z uporabo ehinakozida kot standarda pri 334 nm. Ehinakozid in akteozid smo določali s kolono Nova Pak C18 (250 × 4,6 mm) v sistemu HPLC (vode) z UV detektorjem (334 nm).

Rezultati

Vpliv glivičnega elicitorja na kopičenje biomase in celotno biosintezo PeGs Učinki glivičnega elicitorja na celično biomaso in skupno kopičenje PeGs so bili odvisni od dodanega odmerka (ekvivalentov ogljikovih hidratov). Kot je prikazano na sliki 1, so bili nižji odmerki elicitorja ugodni za suho masoCistanche deserticolacelice. Vrh je bil z elicitorjem pri 20 mg l^-1(kar daje 1,76 mg suhe mase ml^-1).
Celotno kopičenje PeGs je bilo znatno povečano z glivičnim elicitorjem med 20 mg l^-1in 80 mg l^-1. Elicitor pri 40 mg l-1 je dosegel največji izkoristek (57 mg g^-1), kar je bilo več kot dvakrat več kot v kontrolni kulturi brez elicitorja. Nadaljnji poskus je uporabil elicitor gliv pri 40 mg1^-1.

Slika 1. Masa suhe celice in skupno kopičenje PeG v suspenzijski celični kulturiCistanche deserticolakot odziv na različne odmerke glivičnega povzročitelja. Gljivični elicitor je bil dodan v gojišče 15. d. Vzorci so bili odvzeti po nadaljnjih 27 d. ▲, končna teža suhe celice; ◆, skupna vsebnost PeG. Vrednosti so povprečja trojnih rezultatov, vrstice napak pa predstavljajo standardna odstopanja.

Časovni potek celične rasti in biosinteze PeG
Slika 2 prikazuje časovni potek celične viabilnosti in biosintezo PeG (ehinakozid in akteozid) suspenzijskih celic, potem ko so bile kulture izpostavljene 40 mg l^-1glivični elicitor na 15. d. V naslednjih 27 dneh kulture sta bila ehinakozid in akteozid, dva glavna bioaktivna PeG vCistanche deserticola, oboje se je precej povečalo. 39. dan sta bila oba dosežena največja kopičenja, ki sta dosegla 14,7 mg g^-1suha teža in 8,9 mg g^-1 suhe teže oz. Pomembne razlike v viabilnosti celic med kulturami, obdelanimi z elicitorjem, in kontrolo niso opazili.

Slika 2. Preživetje celic in biosinteza ehinakozida in akteozida v suspenzijski celični kulturiCistanche deserticolapo zdravljenju s 40 mg l^-1povzročitelj gliv. Gljivični elicitor je bil dodan v medij 15. d.◆, Ehinakozid obdelan z elicitorjem; ◇, nadzor nad ehinakozidom; ●, z akteozidom obdelan z elicitorjem;○,

nadzor nad akteozidom; ▲, viabilnost celic, obdelana z elicitorjem;△ , kontrola viabilnosti celic. Vrednosti so povprečja trojnih rezultatov, vrstice napak pa predstavljajo standardna odstopanja.

Diskusija

Številne sestavine, pridobljene iz gliv (fragmenti celične stene, polisaharidi, oligosaharidi, glikoproteini itd.), so bile uporabljene kot različni elicitatorji gliv pri sekundarni proizvodnji metabolitov pri številnih vrstah rastlinskih celic. V tem prispevku je homogenat (v glavnem sestavljen iz polisaharidov) iz seva glive Fusarium solani, izoliran iz koreninskega sistemaCistanche deserticolaHalaxylon ammodendron pa se je izkazal za učinkovitega spodbujevalca biosinteze PeG v celični kulturiCistanche deserticola. Uporaba tega elicitorja za stimulacijo sinteze PeGs v celicah ni bila le pomembna, ampak je bila prikazana kmalu po elicitaciji. Ta sklep se je strinjal z nekaterimi prejšnjimi študijami o kulturi rastlinskih celic (Wang et al. 2001).

V prejšnji študiji Li et al. (1998), ko je bil gojišču dodan glivni elicitor iz F. solani, je kalus, induciran iz semenCistanche deserticolabi lahko ostal živ v kasnejši dolgoročni subkulturi in proizvodnja iridoidov bi se lahko povečala. Pokazalo se je, da lahko kultivirane celice sintetizirajo sekundarne metabolite odpornosti proti boleznim, ko jih napadejo mikroorganizmi. Čeprav iridoidi niso bili določeni v našem poskusu, smo pokazali, da bi lahko polisaharide iz F. solani uporabili kot učinkovite elicitatorje gliv pri proizvodnji PeG zCistanche deserticolacelice.

učinkovita vsebina cistanche deserticola--feniletanoidni glikozid

Od: ' Izboljšanjefeniletanoidni glikozidiproizvodnja z glivičnim elicitorjem v kulturi celične suspenzijeCistanche deserticola' avtorja Cui-tao Lu¹,∗ & Xing-Guo Mei²

----Biotechnology Letters 25: 1437–1439, 2003. © 2003 Kluwer Academic Publishers. Tiskano na Nizozemskem.

Reference

Chang Y, Wu H, Wang SN, Cheng HC (1995) Študija močnih učinkovCistanche deserticolaMa., Cistanche salsa (CA Mey) G. Beck. in Cistanche tubulosa (Schenk) R Wight. Kitajska J. Chin. Mater. Med. 26: 143–146.
Du NS, Liu JL (1993) Določitevfeniletanoidni glikozidivCistanche deserticolas spektrofotometrijo z makrovezikularno smolo. Nat. Prod. Res. Razviti. 5: 30–33.

Gamborg OL, Miller RA, Ojima K (1968) Zahteve po hranilih suspenzijskih kultur koreninskih celic soje. Exp. Cell Res. 50: 151–158.

Hsu WH, Chu SH, Sheng LC, Yuan KW, Mao CN (1995) Študija kemičnih sestavin in farmakoloških učinkovCistanche deserticolaMa. in Cistanche salsa (CA Mey) G. Beck. brada. Tradicija. Zelišče. Droge 26: 143–146.

Li S, Wu X, Dong XC, Zheng X, Zheng JH, Lou ZC (1998) Učinek elicitorja Fusarium solani na vsebnost aminokislin vCistanche deserticolakalus. China J. Northwest Pharm. 13: 247–248.
Towill LE, Mazur P (1975) Študije redukcije 2,3,5-trifeniltrazolijevega klorida kot test sposobnosti preživetja za kulture rastlinskih tkiv. Lahko. J. Bot. 53: 1097–1102.
Wang CG, Wu JY, Mei XG (2001) Izboljšanje proizvodnje in izločanja taksola v celični kulturi Taxus Chinensis z izzivanjem gliv in obnovo medija. Appl. Microbiol. Biotehnologija. 55: 404–410.
Wang YM, Zhang SJ, Luo GA, Hu YN, Hu JP, Liu L, Zhu Y, Wang HJ (2000) Analizafeniletanoidni glikozidv izvlečku zelišč Cistanchis z LC/ESI-MS/MS. Acta Pharm. greh 35: 839–842.
Xiong QB, Yasuhiro Tezukay, Takuji Kaneko, Li HY, Le Quan Tran, Koji Hase, Tsuneo Namba, Shigetoshi Kadota (2000) Zaviranje dušikovega oksida s feniletanoidi v aktiviranih makrofagih. EUR. J. Pharm. 400: 137–144.
Yu LJ, Lan WZ, Qin WM, Xu HB (2001) Učinki salicilne kisline na membransko lipidno peroksidacijo, ki jo povzroči glivični elicitor, in proizvodnjo taksola v celičnih suspenzijskih kulturah Taxus Chinensis. Proc. Biochem. 37: 477–482.