HPLC za hkratno določanje štirih feniletanol glikozidnih komponent v delčkih decoctiona Cistanche Herba in izvlečkih Cistanche Tubulosa

Povzetek: Cilj te študije je ugotoviti atekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC)metoda za sočasno določanje štirih feniletanolnih glikozidov vKoščki decoction Cistanches HerbainIzvlečki Cistanche tubulosa. Pri kromatografskih pogojih je bila uporabljena kolona Inertsil ODS{{0}} (250 mm × 4,6 mm, 5 µm), z mobilno fazo, sestavljeno iz acetonitrila - 0.1 % mravljinčne kisline raztopina z uporabo gradientne elucije. Hitrost pretoka je bila nastavljena na 1.0 mL/min, temperatura kolone je bila vzdrževana pri 30 stopinjah, valovna dolžina detekcije pa je bila 330 nm z injekcijskim volumnom 1{ {27}} µL. Linearnost površine vrha s koncentracijami je bila od 2,53 do 201,60 µg/mL za različne glikozide, s korelacijskimi koeficienti (r) nad 0,9993. Meje detekcije (LOD) in kvantifikacije (LOQ) so bile med 0,2249 do 1,1004 µg/mL oziroma 0,3101 do 0,8161 µg/mL. Metoda je pokazala dobro natančnost, stabilnost in ponovljivost z vrednostmi RSD manj kot 3,0 %. Povprečne stopnje izkoristka so bile od 97,70 % do 100,95 %, kar kaže na natančnost in učinkovitost metode za hkratno kvantifikacijo teh komponent v vzorcih.

Ključne besede:Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti,Cistanči Herba, decoction koščki,Izvlečki Cistanche tubulosa, feniletanolni glikozidi, določitev vsebine.

HETIAN DICHENMIKROBIALNA MEJNA SOBA

Cistanche, znan tudi kot Rou Cong Rong in Desert Ginseng, spada v družino Orobanchaceae in se uporablja v tradicionalni medicini zaradi svojih mesnatih stebel, pokritih z luskami. Parazitira na koreninah rastlin Chenopodiaceae, kot sta Haloxylon in Tamarix, in ga najdemo predvsem v sušnih regijah Notranje Mongolije, Qinghai, Xinjiang in Ningxia na Kitajskem. Prvič je bilo navedeno v klasičnem zeliščnem besedilu "Shennong Bencao Jing" kot vrhunsko zelišče. Cistanche ima sladek in slan okus, je po naravi topel in je povezan z meridiani ledvic in debelega črevesa. Znan je po svojih koristih pri krepitvi ledvic in janga, vlaženju črevesja in lajšanju zaprtja, zaščiti jeter, upočasnjuje staranje, boju proti utrujenosti in krepitvi imunosti. Klinično se pogosto uporablja za zdravljenje bolezni, kot so pomanjkanje janga v ledvicah, zaprtje zaradi pomanjkanja krvi, neplodnost pri ženskah, šibka kolena in hrbet ter upad spomina. Cistanche je cenjen kot "puščavski ginseng" in "dragoceno zdravilo".

Rastlina vsebuje feniletanol glikozide, iridoidne terpene, alkaloide, lignane in druge sestavine, pri čemer sta ehinakozid in akteozid reprezentativna feniletanol glikozida, znana po svojih učinkih pri krepitvi janga, proti staranju, antioksidativnih lastnostih in izboljšanju spomina. Te sestavine so primarna osnova za zdravilne učinke Cistanche in so tudi ključni indikatorji za oceno in nadzor kakovosti v izdaji Kitajske farmakopeje iz leta 2020.

Obstajajo poročila o določanju vsebnosti feniletanol glikozida v vrstah Cistanche z uporabo tekočinske kromatografije visoke ločljivosti (HPLC), vendar so bila ta omejena na surove materiale in rezine Cistanche. Trenutno ni nacionalnih standardov za izvleček Cistanche tubulosa in ni bilo poročil o določitvi njegove vsebnosti. Naša predhodna raziskava je pokazala, da Cistanche tubulosa iz Xinjianga vsebuje predvsem štiri reprezentativne feniletanolne glikozide: ehinakozid, izoakteozid, akteozid in tubulozid A. Ta študija je vzpostavila metodo HPLC za hkratno določanje teh štirih komponent tako v delcih decoction Cistanche kot v izvlečkih Cistanche tubulosa, s ciljem bolje oceniti kakovost decoction decoction kosov Cistanche in pomagati vzpostaviti standarde kakovosti za njene izvlečke. Poročilo je naslednje.

1 Instrumenti in reagenti

1.1 Instrumenti

• Tekočinski kromatograf visoke ločljivosti LC-20AT, vključno z detektorjem niza diod (Shimadzu, Japonska)

• Elektronska tehtnica AB135-S (Mettler Toledo, Švica)

• KQ-500DE ultrazvočni čistilec (Kunshan Ultrasonic Instruments Co., Ltd.)

• Sistem ultra čiste vode Aike (Chengdu Tangshi Corning Science and Technology Development Co., Ltd.)

1.2 Reagenti

• Standardne snovi pinorezinola diglukozida (številka serije S-003-01904003), izomukronulatol 7-O-glukozida (številka serije Y-073-11803024), mukronulatola 7-O-glukozida (številka serije M{ {6}}) in tubulozid A (številka serije G-066-11812016), vsi kupljeni pri Beijing Inlay Technology Development Co., Ltd., s čistostjo nad 98 %.

• Acetonitril in metanol kromatografske čistosti, mravljinčna kislina analitske čistosti, voda je bila ultra čista.

• Štiri serije decokcij Cistanches Herba (koda S1, S2 iz Notranje Mongolije; koda S3, S4 iz Xinjianga) so bile vse kupljene v štirih lekarnah v Urumqiju.

• Izvlečki Cistanche tubulosa (koda S5, z encimi inaktivirana suha rezina vodna ekstrakcija; koda S6, z encimi inaktivirana suha rezina alkoholna ekstrakcija; koda S7, z encimi inaktivirana suha rezina z alkoholom vezana ekstrakcija) so bili vsi kupljeni pri Xinjiang Hetian Dichen Pharmaceutical Biotechnology Co. ., doo

2 Metode in rezultati

2.1 Kromatografski pogoji

• Kromatografska kolona: kolona Inertsil ODS-3 (250 mm × 4,6 mm, 5 µm)

• Mobilna faza: Acetonitril (A) - 0.1 % vodna raztopina mravljinčne kisline (B) z gradientno elucijo (od 17 % A do 20 % A v 0-12 min, 20 % A do 22 % A nad 12-30 min, 22 % A do 17 % A nad 30-35 min)

• Hitrost pretoka: 1.0 ml/min

• Valovna dolžina detekcije: 330 nm

• Temperatura kolone: ​​30 stopinj

• Injekcijski volumen: 10 µL

  

Fizikalno-kemijski laboratorij Hetia Dichen

2.2 Priprava raztopine

• Mešana standardna raztopina: Natančno stehtajte vsakega od štirih standardov in prenesite v ločene 10 ml merilne bučke, dopolnite prostornino s 50 % metanola, da dobite posamezne standardne raztopine s koncentracijami 1,008, 1,011, 1,012 in 1,012 mg/L za pinorezinol diglukozid, tubulozid A, mukronulatol 7-O-glukozid oziroma izomukronulatol 7-O-glukozid. Izmerite ustrezno količino vsakega, združite v 10 ml merilno bučko, dopolnite s 50 % metanolom do oznake, dobro premešajte, da pripravite mešano standardno raztopino s koncentracijami 201,60, 50,55, 101,20 oziroma 50,60 µg/mL, in filtrirajte. skozi 0,45 µm membranski filter.

• Raztopina vzorca: Približno 1.0 g praška decoctiona Cistanches Herba (presejenega skozi sito št. 4) se natančno stehta in prenese v 1{{10}}0 ml jantarno merilno bučko . Dodamo natančno 50 mL 50% metanola, stehtamo, ultrazvočno ekstrahiramo 40 minut z močjo 250 W in frekvenco 35 kHz, ohladimo, ponovno stehtamo in dopolnimo izgubljeno maso s 50% metanolom. Dobro premešamo, filtriramo in zberemo filtrat. Pojdite skozi 0,45 µm membranski filter, da dobite raztopino vzorca Cistanches Herba. Podobno pripravite raztopino vzorca izvlečka Cistanche tubulosa s približno 0,2 g praška izvlečka.

1. Ehinakozid 2. Tubulozid A 3. Akteozid 4. Izoakteozid A. Mešana referenčna raztopina B. Preskusna raztopina decokcijskih kosov Cistanches Herba C. Preizkusna raztopina izvlečka Cistanche Tubulosa

2.3 Metodološki pregled

Preskus primernosti sistema: Ustrezne količine treh raztopin iz razdelka 2.2 so bile vzorčene pod kromatografskimi pogoji, opisanimi v razdelku 2.1, in posneti so bili kromatogrami. Rezultati so pokazali, da teoretično število plošč za vrh ehinakozida ne sme biti manjše od 3000, s stopnjami ločevanja, večjimi od 1,5, kar kaže na dobro izhodiščno ločevanje. Za podrobnosti glejte sliko 1.

Vrednotenje linearnosti: Natančne količine mešane referenčne raztopine iz razdelka 2.2 (0.5, 1.0, 2.5, 5.0 in 10.0 ml ) smo prenesli v 10 ml merilne bučke, dopolnili do oznake s 50 % metanolom, dobro premešali in uporabili za ustvarjanje serije mešanih referenčnih raztopin. Natančno 10 µL teh raztopin smo vbrizgali pod kromatografskimi pogoji iz razdelka 2.1. Zabeležene so bile površine vrhov in izvedena je bila linearna regresija z uporabo koncentracij komponent (X, µg/mL) kot neodvisne spremenljivke in površin vrhov (Y) kot odvisne spremenljivke. Regresijske enačbe in razpon linearnosti najdete v tabeli 1.

Meje zaznavnosti in kvantifikacije: Odvzete so bile natančne količine mešane referenčne raztopine iz razdelka 2.2, ustrezno razredčene in analizirane pod kromatografskimi pogoji iz razdelka 2.1. Koncentracije, ki ustrezajo razmerju med signalom in šumom 3:1 oziroma 10:1, so bile uporabljene kot meje zaznavanja oziroma kvantitativne meje. Rezultati so predstavljeni v tabeli 1.

Preskus natančnosti: Ustrezen volumen mešane referenčne raztopine iz razdelka 2.2 je bil analiziran šestkrat zapored pod kromatografskimi pogoji iz razdelka 2.1. Vrednosti RSD za površine vrhov ehinakozida, tubulozida A, akteozida in izoakteozida so bile 1,31 %, 0,91 %, 1,58 % oziroma 0,58 % (n {{12} }), kar kaže na dobro natančnost instrumenta.

Preskus stabilnosti: Raztopine preskusnih vzorcev smo pripravili in pustili pri sobni temperaturi 0, 2, 4, 6, 8, 12 in 24 ur, preden smo jih analizirali pod pogoji iz razdelka 2.1. Vrednosti RSD za površine vrhov ehinakozida, tubulozida A, akteozida in izoakteozida so bile 1,84 %, 2,18 %, 1,05 % oziroma 1,55 % (n=7), kar kaže, da so bile preskusne raztopine stabilne pri sobni temperaturi. temperatura do 24 ur.

Test ponovljivosti: Vzorec (ID: S2) je bil natančno stehtan in razdeljen na šest delov. Vsak delež je bil pripravljen kot raztopina preskusnega vzorca v skladu z metodo iz oddelka 2.2 in analiziran pod kromatografskimi pogoji iz oddelka 2.1. Povprečne vsebnosti ehinakozida, tubulozida A, akteozida in izoakteozida so bile 0,779 %, 0.020%, 0,155 % oziroma 0,074 %. , z vrednostmi RSD 1,21 %, 3,12 %, 2,65 % in 2,96 % (n=6), kar kaže na dobro ponovljivost metode.

Preizkus izkoristka: Odvzeta je bila znana količina vzorca (ID: S2) in razdeljena na devet delov. Vsakemu obroku so dodali nizke, srednje ali visoke koncentracije posameznih referenčnih raztopin, pripravljenih po metodi iz razdelka 2.2, in analiziranih pod kromatografskimi pogoji iz razdelka 2.1. Zabeležene so bile površine vrhov in izračunane stopnje okrevanja. Rezultati so prikazani v tabeli 2.

HPLC laboratorij Hetian DiChen

2.4 Določanje vsebine vzorca

Ustrezne količine vsake serije vzorcev so bile pripravljene kot preskusne raztopine v skladu z metodo iz oddelka 2.2, nato pa analizirane pod kromatografskimi pogoji iz oddelka 2.1. Vsak vzorec je bil testiran v trojniku, zabeležene so bile površine vrhov in izračunana vsebnost vzorcev. Rezultati so prikazani v tabeli 3.

3 Razprava

V tej študiji je bil uporabljen detektor niza diod, skeniranje mešanih referenčnih raztopin in raztopin testnih vzorcev pa je bilo izvedeno v območju valovnih dolžin od 200 do 450 nm. Rezultati so pokazali, da imata ehinakozid in akteozid največjo absorpcijo pri 330 nm, tubulozid A pri 331 nm in izoakteozid pri 327 nm. Poleg tega je bilo pri sklicevanju na izdajo kitajske farmakopeje iz leta 2020, ki določa valovno dolžino zaznavanja 330 nm za ehinakozid in akteozid, ugotovljeno, da ima veliko komponent znatne kromatografske vrhove in visoke vrednosti odziva pri 330 nm, kar je vodilo k izbiri 330 nm kot končno merilno valovno dolžino.

Iz rezultatov določanja vsebnosti decoction kosov Cistanches Herba je bilo ugotovljeno, da imata ehinakozid najvišjo vsebnost tako v Cistanche tubulosa kot v desertni Cistanche, ki ji sledi akteozid, medtem ko imata tubulozid A in izoakteozid relativno nižjo vsebnost. Vsebnost štirih feniletanol glikozidnih komponent je bila precejšnja variabilnost, ta variabilnost pa je bila izrazita tudi med različnimi serijami z iste lokacije ali različnih lokacij. To variacijo lahko pripišemo dejavnikom, kot so geografsko okolje, temperatura, podnebje in postopki nabiranja surovin, ki vplivajo na kopičenje kemičnih sestavin v rastlinah. Čeprav so kemične sestavine zdravila Cistanche iz različnih izvorov podobne, se koncentracije teh komponent razlikujejo, kar vodi do razlik v njihovih učinkih. Zato je za doseganje boljših kliničnih rezultatov primerno izbrati surovine na podlagi njihove učinkovitosti.

Če povzamemo, metoda, uvedena v tej študiji, je preprosta, hitra, natančna in učinkovita. Uporablja se lahko za hkratno določanje štirih feniletanol glikozidnih komponent v decoction delcih Cistanches Herba in izvlečkih Cistanche tubulosa. Rezultati določanja vsebnosti lahko odražajo ravni kakovosti različnih serij in različnih izvlečkov z iste ali različnih lokacij, kar zagotavlja teoretično podlago za vzpostavitev ustreznih standardov kakovosti.

Tab. 2 Rezultati preizkusa obnovitve (n=9)

Tab. 3 Rezultati določanja vsebnosti štirih feniletanoidnih glikozidov v vzorcih(%,n=3)

Koristi Cistanche

Reference:

1. 中文 (kitajščina): 国家药典委员会．中华人民共和国药典(一部)［M］．北京:中国医药科技出版社,2020:{ {1}}.
   英文 (angleščina): Nacionalna komisija za farmakopejo. Farmakopeja Ljudske republike Kitajske (zv. 1) [M]. Peking: China Medical Science and Technology Press, 2020: 140-141.

2. 中文 (kitajščina): 朱乃亮,徐荣,吴海峰,等. 荒漠肉苁蓉和管花肉苁蓉指纹图谱比较研究［J］. 中国药学杂志,2016,51(13):1116-1119.
   英文 (angleško): Zhu Nailiang, Xu Rong, Wu Haifeng, et al. Primerjalna študija o prstnih odtisih Cistanche deserticola in Cistanche tubulosa [J]. Kitajska farmacevtska revija, 2016, 51(13): 1116-1119.

3. 中文 (kitajščina): 闫暾,齐海平,李旻辉,等. 肉苁蓉和管花肉苁蓉的对比［J］. 包头医学院学报,2019,35(1):120-121.
   英文 (angleško): Yan Tun, Qi Haiping, Li Minhui, et al. Primerjava Cistanche deserticola in Cistanche tubulosa [J]. Journal of Baotou Medical College, 2019, 35(1): 120-121.

4. 中文 (kitajščina): 吴波,顾少菊,傅玉梅,等. 肉苁蓉和管花肉苁蓉通便与补肾壮阳药理作用的研究［J］. 中医药学刊,2003,21(4):539-548.
   英文 (angleško): Wu Bo, Gu Shaoju, Fu Yumei, et al. Študija o odvajalnih in tonificirajočih učinkih Cistanche deserticola in Cistanche tubulosa na ledvice-jang [J]. Journal of Chinese Medicine and Pharmacy, 2003, 21(4): 539-548.

5. 中文 (kitajščina): 范亚楠,黄玉秋,贾日柱,等. 肉苁蓉炮制前后对衰老模型大鼠抗衰老及免疫功能的影响［J］. 中华中医药学刊, 2017,35(11):2882-2885.
   英文 (angleško): Fan Yanan, Huang Yuqiu, Jia Tianzhu, et al. Učinki Cistanche deserticola pred in po predelavi na delovanje proti staranju in imunsko funkcijo pri starajočih se modelih podgan [J]. Kitajski časopis za tradicionalno kitajsko medicino in farmacijo, 2017, 35(11): 2882-2885.

6. 中文 (kitajščina): 吴波,付玉梅. 肉苁蓉总苷对亚急性衰老小鼠抗脂质过氧化作用的研究［J］. 中国药理学通报, 2005,21(5):639.
   英文 (angleščina): Wu Bo, Fu Yumei. Študija učinka glikozidov Cistanche na peroksidacijo lipidov na subakutnem staranju miših [J]. Kitajski farmakološki bilten, 2005, 21(5): 639.

7. 中文 (kitajščina): 胡余明,胡怡秀,刘秀英,等. 苁蓉总苷对正常小鼠学习记忆功能的影响研究［J］. 中国预防医学杂志, 2007,8(4):370-373.
   英文 (angleško): Hu Yuming, Hu Yixiu, Liu Xiuying, et al. Študija o vplivu glikozidov Cistanche na učenje in spominsko funkcijo pri normalnih miših [J]. Kitajski časopis za preventivno medicino, 2007, 8(4): 370-373.

8. 中文 (kitajščina): 屠鹏飞,姜勇,郭玉海,等. 发展肉苁蓉生态产业推进西部荒漠地区生态文明［J］. 中国现代中药,2015,17(4):297-301.
   英文 (angleško): Tu Pengfei, Jiang Yong, Guo Yuhai et al. Razvoj ekološke industrije Cistanche deserticola za spodbujanje ekološke civilizacije v zahodnih puščavskih območjih [J]. Sodobna kitajska medicina, 2015, 17(4): 297-301.

9. 中文 (kitajščina): 覃文婷,宿美凤,雒晓梅,等. 定性分析不同产地荒漠肉苁蓉苯乙醇苷类及多糖类成分［J］. 辽宁中医药大学学报,2018,20(7):77-81.
   英文 (angleško): Qin Wenting, Su Meifeng, Luo Xiaomei et al. Kvalitativna analiza feniletanoidnih glikozidov in polisaharidov v Cistanche deserticola različnih izvorov [J]. Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, 2018, 20(7): 77-81.

10. 中文 (kitajščina): 王力伟,曹瑞,房永雨,等. 超高效液相色谱-串联3重4极杆质谱联用法测定肉苁蓉中有效成分的含量［J］. 中药材,2017,40(2):295-300.
    英文 (angleško): Wang Liwei, Cao Rui, Fang Yongyu, et al. Določanje aktivnih sestavin v Cistanche deserticola s tekočinsko kromatografijo ultrazmogljivosti-tandemska trojna kvadrupolna masna spektrometrija [J]. Journal of Chinese Medicinal Materials, 2017, 40(2): 295-300.

11. 中文 (kitajščina): 初侨,席兴军,杨丽. 肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷闪提工艺研究［J］. 食品研究与开发,2015,36(16):49-52.
    英文 (angleško): Chu Qiao, Xi Xingjun, Yang Li. Študija o tehnologiji bliskovite ekstrakcije ehinakozida in verbaskozida v Cistanche deserticola [J]. Raziskave in razvoj hrane, 2015, 36(16): 49-52.

12. 中文 (kitajsko): 余逸凡. 肉苁蓉属植物化学成分及药理活性研究进展［J］. 化工管理, 2019(13):111-112.
    英文 (angleščina): Yu Yifan. Napredek raziskav o kemičnih sestavinah in farmakološkem delovanju Cistanche [J]. Kemijski management, 2019(13): 111-112.

13. 中文 (kitajščina): 王小新,骆婷婷. 肉苁蓉对小鼠抗疲劳及记忆力的影响［J］. 内蒙古中医药, 2014,33(22):102–103.
    英文 (angleščina): Wang Xiaoxin, Luo Tingting. Vpliv Cistanche deserticola na preprečevanje utrujenosti in spomin pri miših [J]. Inner Mongolia Journal of Traditional Chinese Medicine, 2014, 33(22): 102-103.

14. 中文 (kitajščina): 随家宁,李芳婵,郭勇秀,等. 肉苁蓉化学成分,药理作用研究进展及其质量标志物预测分析［J］. 辽宁中医药大学学报,2021,23(1):191-196.
    英文 (angleško): Sui Jianing, Li Fangchan, Guo Yongxiu et al. Napredek raziskav o kemičnih sestavinah in farmakoloških učinkih Cistanche deserticola ter analiza napovedi njenih označevalcev kakovosti [J]. Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, 2021, 23(1): 191-196.

15. 中文 (kitajščina): 刘涛, 殷松娜, 栾昕. 肉苁蓉对卵巢早衰大鼠免疫因子和凋亡相关蛋白的影响［J］. 中国临床药理学杂志, 2019,35(23):3084-3087.
    英文 (angleško): Liu Tao, Yin Songna, Luan Xin. Vpliv Cistanche deserticola na imunske dejavnike in z apoptozo povezane beljakovine pri podganah s prezgodnjo odpovedjo jajčnikov [J]. Kitajski časopis za klinično farmakologijo, 20