Identifikacija ACOT13 in PTGER2 kot novih genov kandidatov za avtosomno dominantno policistično ledvično bolezen s sekvenciranjem celotnega eksoma

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

Na Du¹, Dan Dong³, Luyao Sun¹, Lihe Che¹, Xiaohua Li¹, Yong Liu^2*†in Bin Wang^1*†

Povzetek

Ozadje:Avtosomno dominantna policističnaledvicabolezen (ADPKD) je najpogostejša monogenaledvicamotnja. Polovica bolnikov bi počasi napredovala do končne ledvične odpovedi. Vendar potencialna tarča za zdravljenje ADPKD še vedno ni.

Metode:štiriADPKDv to študijo so bili vključeni bolniki in dva zdrava družinska člana. Vzorci periferne krvi so bili pridobljeni in testirani s sekvenciranjem celega eksoma (WES). Avtosomne ​​mutacije pri bolnikih z ADPKD so bile obdržane kot kandidatna mesta. Obogatitev genske ontologije (GO), kjotske enciklopedije genov in genomov (KEGG) in analize interakcijskega omrežja protein-protein (PPI) so bile izvedene s paketom Cluster Roller R. Nabor podatkov, ki je vseboval 18 bolnikov z ADPKD in tri normalne vzorce, je bil prenesen iz baze podatkov Gene Expression Omnibus (GEO) in analiziran s paketom limma R.

Metode:štiriADPKDv to študijo so bili vključeni bolniki in dva zdrava družinska člana. Vzorci periferne krvi so bili pridobljeni in testirani s sekvenciranjem celega eksoma (WES). Avtosomne ​​mutacije pri bolnikih z ADPKD so bile obdržane kot kandidatna mesta. Obogatitev genske ontologije (GO), kjotske enciklopedije genov in genomov (KEGG) in analize interakcijskega omrežja protein-protein (PPI) so bile izvedene s paketom Cluster Roller R. Nabor podatkov, ki je vseboval 18 bolnikov z ADPKD in tri normalne vzorce, je bil prenesen iz baze podatkov Gene Expression Omnibus (GEO) in analiziran s paketom limma R.

Sklepi:S kombinacijo analiz WES, izražanja genov in mrežnih analiz PPI smo identificirali ACOT13 in PTGER2 kot potencialnaADPKD-povezani geni.

Ključne besede:Sekvenciranje celotnega eksoma, Genske mutacije, Policističniledvicabolezen, ACOT13, PTGER2

Cistanche tubulosa preprečuje bolezni ledvic, kliknite tukaj za vzorec

Uvod

Policističniledvicabolezen (PKD) je skupina monogenih motenj in je pogost vzrok za končno odpoved ledvic. Večino odraslih bolnikov prizadene avtosomno dominantna oblika (ADPKD), medtem ko avtosomno recesivna policističnaledvicabolezen (ARPKD) je redkejša oblika, ki se običajno pojavi perinatalno ali v zgodnjem otroštvu [1]. Mutacije v PKD1 in PKD2, ki kodirajo proteina policistina 1 in 2 (PC1 in PC2), so najpogostejši vzroki ADPKD. PC2, kationski kanal, je član družine ionskih kanalčkov prehodnega receptorskega potenciala (TRP) [2]. Poročali so, da napake v PKD2 sprožijo spremembe v mitohondrijski presnovi energije [3]. vlogi kompleksa PC1 in PC1PC2 sta slabo razumljeni [4]. Čeprav se PKD deduje monogensko, je heterogen glede fenotipa, gena in alela [1] in 7 odstotkovADPKDdružine so genetsko nerešene [5]. Poleg tega so molekularni mehanizmi, na katerih temeljiledvičnadisfunkcijaki so posledica mutacij v genih PKD in fiziološke funkcije proteinov policistina so še vedno nejasne [6].

1 in 2 (PC1 in PC2) proteini so najpogostejši vzroki ADPKD. PC2, kationski kanal, je član družine ionskih kanalčkov prehodnega receptorskega potenciala (TRP) [2]. Poročali so, da napake v PKD2 sprožijo spremembe v mitohondrijski presnovi energije [3]. vlogi kompleksa PC1 in PC1PC2 sta slabo razumljeni [4]. Čeprav se PKD deduje monogensko, je heterogen glede fenotipa, gena in alela [1], 7 odstotkov družin ADPKD pa je genetsko nerešenih [5]. Poleg tega so še vedno nejasni molekularni mehanizmi, na katerih temelji ledvična disfunkcija, ki je posledica mutacij v genih PKD, in fiziološke funkcije proteinov policistina [6].

Tu smo izvedli WES z uporabo vzorcev krvi štirih bolnikov z ADPKD in dveh zdravih družinskih članov, da bi analizirali variacije njihovih genov. Poleg tega je bil iz baze podatkov Gene Expression Omnibus (GEO) pridobljen nabor podatkov o izražanju genov, ki vsebuje 18 bolnikov z ADPKD in tri normalne vzorce. Z integriranimi analizami genske mutacije, izražanja genov, obogatitve genske funkcije in interakcije protein-protein (PPI) smo identificirali dva gena (ACOT13 in PTGER2), ki sta bila potencialno povezana s patogenezo ADPKD.

Materiali in metode

Klinične informacije

To študijo je odobril lokalni odbor za etiko (številka odobritve: 2019-307). Bolnika z ADPKD smo zdravili v naši bolnišnici in pet članov te družine je bilo vključenih v to študijo. Ta bolnik je imel v preteklosti policistično bolezenledvica bolezen, policistična bolezen jeter in ledvični kamni 13 let (dodatna datoteka 1: tabela S1). Rodovnik te družine je prikazan na sliki 1A. Te N_2 je bil ta proband. Te N_4, N_5 in N_6 so bili vsi bolniki z ADPKD (črnci), medtem ko sta bili N_3 in N_1 zdravi ljudje (belci) . Skupaj so bili v naši študiji štirje bolniki z ADPKD in dve zdravi kontrolni osebi. Klinični simptomi tega probanda so vključevali vročino, bolečine v hrbtu in hematurijo. Preiskava z računalniško tomografijo (CT) N_2 je pokazala več cist v jetrih in obojestransko policistično ledvico. Nekatere lezije so bile kompleksne ciste s spremembami v desnem perirenalnem izločku, ki je imel zamegljene obrise in povečano gostoto (slika 1B).

Sekvenciranje celotnega eksoma

DNK genoma smo ekstrahirali iz vzorcev periferne krvi s kompletom za ekstrakcijo DNK (Tiangen Biotech, Peking, Kitajska), eksome pa smo zajeli s kompletom Agilent SureSelect Human All Exon V6 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) v skladu z navodili. kompletov. Sekvenciranje celotnega eksoma je bilo izvedeno z uporabo instrumentov Illumina Novaseq6000 s seznanjenimi odčitki sekvenciranja 150-bp. Neobdelani odčitki zaporedja so bili predhodno obdelani za odstranitev nizkokakovostnih baz in odčitkov z uporabo hitrega [11], ultra hitrega vse-v-enem predprocesorja FASTQ, in sprejeti so bili privzeti parametri. Odčitki zaporedja so bili usklajeni s človeškim genomom (Build-UCSC hg19) z uporabo programske opreme BWA (Burrow–Wheeler Aligner, http://bio-bwa.sourceforge.net/). S programsko opremo SAMtools (http://samtools.sourceforge.net/) je bil identificiran deset polimorfizem enega nukleotida (SNP) in vstavitev/izbris (Indel). Z uporabo programske opreme ANNOVAR (http://annovar.openbioinformat ics.org/en/latest/user-guide/download/) je bila izvedena funkcionalna opomba za identificirani SNP in Indel, da se raziščejo njihove genomske lokacije in informacije o variacijah (dodatna datoteka 2 : tabela S2).

Preverjanje kandidata SNP/Indel za ADPKD

Najprej smo odstranili mutacije s frekvencami, višjimi od 1 odstotka, v vsaj eni od štirih zbirk podatkov (1000g_vse, esp6500si_vse, gnomAD_VSE in gnomAD_ EAS). Deset, ohranjenih je bilo mutacij v eksonskih ali spajajočih (10 bp pred in dol od eksona) položajih. Majhni fragmenti (<10 bp)="" non-frameshifting="" indel="" mutations="" in="" the="" repeat="" region="" were="" also="" removed.="" in="" addition,="" mutations="" that="" met="" one="" of="" the="" following="" conditions="" were="" retained:="" (a)="" te="" sites="" that="" were="" considered="" as="" harmful="" by="" at="" least="" half="" of="" the="" four="" software="" sift="" [12],="" polyphen="" [13],="" mutationtaster="" [14],="" and="" cadd="" [15]="" basing="" on="" the="" scores;="" (b)="" mutations="" that="" were="" predicted="" to="" affect="" the="" splicing="" by="" dbscsnv="" [16].="" ten,="" the="" genetic="" mutations="" that="" were="" classified="" into="" pathogenic="" and="" likely="" pathogenic="" ones="" according="" to="" the="" criteria="" and="" guidelines="" for="" grading="" clinical="" significance="" of="" single-gene="" mutations="" of="" american="" college="" of="" medical="" genetics="" and="" genomics="" (acmg,="" https://www.acmg.net/)="" were="" selected="" as="" candidate="" sites.="" for="" the="" screening="" of="" dominant="" genetic="" pattern,="" on="" the="" basis="" of="" mutation="" site="" filtering,="" the="" sites="" showing="" autosomal="" mutations="" in="" adpkd="" patients,="" which,="" however,="" could="" not="" be="" detected="" in="" normal="" controls="" were="" retained="" as="" candidate="">

Funkcionalna obogatitev in analize PPI

Podatki o profilu ekspresije mRNA GSE7869 [18] so bili preneseni iz baze podatkov GEO (https://ncbi.nlm. nih.gov/geo), ki je bila zaznana na podlagi Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array. . Nabor podatkov GSE7869 je vseboval 18 vzorcev ADPKD in tri običajne vzorce. Podatki o profilu izražanja mRNA so bili analizirani s paketom funkcij limma v R [19]. Diferencialno izraženi geni (DEG) so bili izbrani z uporabo pragov absolutne vrednosti diferencialne ekspresije (|Log2FC|) > 0.5 in P-vrednosti <>

Statistična analiza

Statistične analize so bile izvedene s programsko opremo R v3.5.2. P-vrednost < 0.05="" je="" veljala="" za="" statistično="" pomembno="" v="" vseh="" statističnih="">

Results

Mutatinaal landscape

Skupno število SNP-jev v šestih vzorcih je bilo koncentrirano med 100 000 in 150 000 in so bili večinoma locirani v intronski regiji, eksonski regiji in intergenski regiji (slika 2A). Skupno število Indelov v šestih vzorcih je bilo koncentrirano med 15,000 in 20,000, in ti Indeli so bili večinoma porazdeljeni v intronski in intergenski regiji (slika 2B). Nato smo raziskali pokrajino mutacij, ki so se nahajale v kodirni regiji. Posledično so SNP-ji šestih vzorcev v kodirni regiji večinoma vključevali anonimne mutacije, mutacije missense in stop-loss, katerih skupno število je bilo skoraj 21, 000 (slika 2C). Indeli šestih vzorcev v kodirni regiji so bili v glavnem sestavljeni iz brisanja_brez okvirja in vstavljanja_brez premika (slika 2D)

Potencialne mutacije in geni za ADPKD

Šest mutantnih genov, vključno z AGRN, ACOT13, ADCY4, HEATR5A, PTGER2 in ADAM21, je bilo pregledanih z uporabo dominantnega genetskega vzorca. V vzorcih ADPKD so bili heterozigotno mutirani, v normalnih vzorcih pa niso bili mutirani. Za večino teh genov ni bilo poročil, da bi bili povezani s pojavom ADPKD. Medtem je bilo izbranih tudi 19 genov glede na škodljivost mutacije, vključno z MUTYH, USH2A, HBS1L, GLI3, SBDS, SND1, ABCA2, RPS6KA4, FLVCR1, ATIC, SCN11A, ATP6V1A, GLRA1, PRMT8, PKD1, INSL3, SUPT5H, NCF4 in GPR143. Da bi preučili razmerje med temi genskimi mutacijami in ADPKD, smo najprej analizirali učinke genskih mutacij na beljakovine. Posledično so imeli vsi ti geni vsaj eno mutacijo, ki bi lahko vplivala na kodiranje beljakovin, kar kaže na možne vloge teh mutacij (tabela 1).

Znatno obogatene poti KEGG in izrazi GO potencialnih genov, povezanih z ADPKD

Rezultati analiz obogatitve z GO in KEGG 25 potencialnih genov, povezanih z ADPKD, so prikazani na sliki 3A (biološki proces), sliki 3B (celična komponenta), sliki 3C (molekularna funkcija) in sliki 3D (KEGG). . Analiza GO je pokazala, da je bilo teh 25 genov znatno obogatenih v bioloških procesih (BP) celičnega procesa posameznega organizma in odziva na dražljaje, celičnih komponent (CC) plazemske membrane in celične periferije ter molekularne funkcije (MF) vezave anionov. Poleg tega je analiza poti KEGG pokazala, da je bilo teh 25 genov v glavnem obogatenih s signalnimi potmi cikličnega adenozin monofosfata (cAMP) in potmi pri raku.

ACOT13 in PTGER2 sta lahko kandidata za gena, povezana z ADPKD

Analiza omrežja PPI je bila izvedena, da bi raziskali povezavo med 25 potencialnimi geni, povezanimi z ADPKD. Kot je prikazano na sliki 3E, je bila večina teh genov neodvisnih v omrežju. ACOT13 je imel neposredno interakcijo s SBDS in ATIC; Predvideno je bilo, da bodo PTGER2, ADCY4 in INSL3 medsebojno delovali (slika 3E). Še več, ACOT13, PTGER2 in ADCY4 so bili geni, ki so mutirali samo pri bolnikih z ADPKD. , smo na podlagi podatkov o izražanju, prenesenih iz baze podatkov GEO, primerjali nivoje izražanja ACOT13, PTGER2 in ADCY4 med bolniki z ADPKD in običajnimi kontrolami. V primerjavi z normalnimi kontrolami je bila stopnja izražanja ACOT13 bistveno nižja pri bolnikih z ADPKD (slika 4A), medtem ko je PTGER2 predstavljal višjo raven izražanja pri bolnikih z ADPKD (slika 4B). ADCY4 ni pokazal pomembne razlike v izražanju med bolniki z ADPKD in normalnimi vzorci (slika 4C). Z združevanjem informacij smo špekulirali, da bi lahko bili ACOT13 in PTGER2 kandidatni geni, povezani z ADPKD.

Diskusija

ADPKD je posledica mutacije v enem od dveh genov-78 odstotkov primerov je posledica mutacije v PKD1 na kromosomu 16 in 15 odstotkov primerov je posledica mutacije v PKD2 na kromosomu 4 [20]. Cistične bolezni ledvic imenujemo tudi ciliopatije. Proteini PC1 in PC2, kodirani s PKD1 in PKD2, se nahajajo na primarnih migetalkah in delujejo kot senzorji pretoka v ledvicah [21]. V tej študiji so škodljivo mutacijo v PKD1 in drugih 18 znanih škodljivih genov odkrili v vzorcih bolnikov z ADPKD. Še več, šest mutantov, vključno z AGRN, ACOT13, ADCY4, HEATR5A, PTGER2 in ADAM21, je bilo pregledanih z uporabo prevladujočega genetskega vzorca in večina od njih prej ni bila prepoznana kot patogeni geni, povezani z ADPKD.

Patogene beljakovine pri ADPKD so v glavnem odgovorne za prenos informacij iz zunanjega okolja v celice [22]. Analizirali smo potencialne funkcije 25 identificiranih genov z obogatitvenimi analizami GO in KEGG. Rezultati so pokazali, da so bili BP celičnega procesa enega organizma, odziv na dražljaj, kot tudi CC plazemske membrane in celične periferije znatno obogateni. Poleg tega lahko celice ADPKD preusmerijo svoj način proizvodnje energije z oksidativne fosforilacije na druge poti in te spremembe v celičnem metabolizmu so se izkazale kot znak ADPKD [6]. Spremembe v modulaciji proizvodnje in porabe energije pri ADPKD so odvisne od več notranjih celičnih signalnih poti, kot so AMP-aktivirana proteinska kinaza (AMPK), kalcijeva signalizacija na membranah, povezanih z mitohondriji, tarča rapamicinskega kompleksa 1 (mTORC1) pri sesalcih, cAMP in transport ionov, posredovan s transmembranskim regulatorjem prevodnosti cistične fibroze (CFTR) [23, 24]. Tukaj je bila signalna pot cAMP identificirana kot znatno obogatena v teh vzorcih ADPKD. Ti rezultati podpirajo zanesljivost mutacij, ki smo jih pregledali. Medtem, kljub funkcionalnim informacijam, ki so bile delno razkrite z analizo obogatitve, je več podrobnosti o 25 identificiranih genih zaslužilo nadaljnje raziskovanje v ADPKD v prihodnosti.

Analize PPI in diferencialne ekspresije so pokazale, da sta bila v primerjavi z normalnimi ljudmi ACOT13 in PTGER2 mutirana in različno izražena pri bolnikih z ADPKD in sta lahko potencialna gena, povezana z ADPKD. Protein ACOT13 je član encimov acil-CoA tioesteraz (Acts), ki katalizirajo reakcijo hidrolize maščobnih molekul acil-CoA v proste maščobne kisline in CoASH. ACOT13 je obogaten z oksidativnimi tkivi in ​​je povezan z mitohondriji [25]. Lin et al. poročali, da je PC1 vplival na morfologijo in delovanje mitohondrijev, kar bi lahko imelo ključno vlogo pri uravnavanju delovanja mitohondrijev in celičnega metabolizma [26]. Kolikor vemo, ni bilo poročil o razmerju med ACOT13 in ADPKD. Izražanje PTGER2 vpliva na biološko obnašanje različnih vrst malignih tumorjev [27–29], kar bi moralo biti povezano z obogatitvijo poti pri raku v analizi KEGG. Sicer pa je bila vloga prostaglandina E (2) (PGE2) v cistogenezi v genetsko neortolognih modelih ADPKD že raziskana. Liu et al. ugotovili, da lahko PGE2 aktivira nenormalne signalne poti v PC-1-pomanjkljivem epiteliju ter posreduje pri proliferaciji in izločanju klorida v ADPKD cističnem ledvičnem epiteliju [30]. Elberg et al. so nakazali vlogo PTGER2 pri posredovanju učinka PGE2 na indukcijo tvorbe cist s kombiniranimi biokemičnimi, farmakološkimi in funkcionalnimi analizami pri ADPKD [31]. To dodatno potrjuje zanesljivost našega pristopa k presejanju patogenih genov pri ADPKD, ki se lahko uporablja pri drugih boleznih. Prav tako posredno podpira zanesljivost ACOT13 kot potencialnega gena, povezanega z ADPKD. Vendar osnovna biološka funkcija ACOT13 pri ADPKD še vedno zahteva nadaljnje študije.

Sklepi

V tej študiji smo identificirali dva potencialna gena, povezana z ADPKD, vključno z ACOT13 in PTGER2, z analizo rezultatov WES štirih bolnikov z ADPKD in dveh zdravih družinskih članov v kombinaciji s podatki o izražanju genov iz baze podatkov GEO. Naši rezultati so lahko koristni za nadaljnje študije osnovnih patoloških vzrokov ADPKD. Vendar pa zaradi majhnega števila bolnikov v naši študiji ostaja nekaj negotovosti glede možne vloge ACOT13 in PTGER2, kar še vedno upravičuje nadaljnje študije.

Reference

1. Bergmann C, Guay-Woodford LM, Harris PC, Horie S, Peters DJM, Torres VE. Policistična bolezen ledvic. Primeri Nat Rev Dis. 2018;4(1):50. https://doi. org/10.1038/s41572-018-0047-y.

2. Grieben M, Pike AC, Shintre CA, Venturi E, El-Ajouz S, Tessitore A, Shrestha L, Mukhopadhyay S, Mahajan P, Chalk R, et al. Struktura TRP kanala policistične ledvične bolezni Policistin-2 (PC2). Nat Struct Mol Biol. 2017; 24 (2): 114–22.

3. Chumley P, Zhou J, Mrug S, Chacko B, Parent JM, Challa AK, Wilson LS, Berryhill TF, Barnes S, Kesterson RA, et al. Skrajšanje PKHD1 in

Mutacije PKD2 spreminjajo presnovo energije. Am J Physiol Renal Physiol. 2019; 316 (3): F414–25.

4. Kim DY, Park JH. Genetski mehanizmi ADPKD. Adv Exp Med Biol. 2016; 933: 13–22.

5. Cornec-Le GE, Olson RJ, Besse W, Heyer CM, Gainullin VG, Smith JM, Audrezet MP, Hopp K, Porath B, Shi B, et al. Monoalelne mutacije na DNAJB11 povzročajo atipično avtosomno dominantno policistično bolezen ledvic. Am J Hum Genet. 2018; 102 (5): 832–44.

6. Padovano V, Podrini C, Boletta A, Caplan MJ. Presnova in mitohondriji pri raziskavah in zdravljenju policistične bolezni ledvic. Nat Rev Nephrol. 2018; 14 (11): 678–87. https://doi.org/10.1038/s41581-018-0051-1.

7. Bergmann C. Nedavni napredek v molekularni diagnozi policistične bolezni ledvic. Strokovnjak Rev Mol Diagn. 2017; 17 (12): 1037–54. https://doi. org/10.1080/14737159.2017.1386099.

8. Yang Y, Muzny DM, Xia F, Niu Z, Person R, Ding Y, Ward P, Braxton A, Wang M, Buhay C, et al. Molekularne ugotovitve med bolniki, napotenimi na klinično sekvenciranje celotnega eksoma. JAMA. 2014;312(18):1870–9.

9. Mallawaarachchi AC, Hort Y, Cowley MJ, McCabe MJ, Minoche A, Dinger ME, Shine J, Furlong TJ. Sekvenciranje celotnega genoma premaga psevdogeno homologijo za diagnosticiranje avtosomno dominantne policistične bolezni ledvic. Eur J Hum Genet. 2016; 24 (11): 1584–90. https://doi.org/10.1038/ejhg.2016.48.

10. Braun DA, Schueler M, Halbritter J, Gee HY, Porath JD, Lawson JA, Airik R, Shril S, Allen SJ, Stein D, et al. Sekvenciranje celotnega eksoma identificira vzročne mutacije v večini sorodniških ali družinskih primerov s povečano ledvično ehogenostjo v otroštvu. Kidney Int. 2016; 89 (2): 468–75.

11. Chen S, Zhou Y, Chen Y, Gu J. hitro: izjemno hiter predprocesor FASTQ vse v enem. Bioinformatika. 2018;34(17):i884–90.

12. Kumar P, Henikof S, Ng PC. Napovedovanje učinkov kodiranja nesinonimnih variant na delovanje beljakovin z uporabo algoritma SIFT. Nat Protoc. 2009; 4 (7): 1073–81.

13. Flanagan SE, Patch AM, Ellard S. Uporaba SIFT in PolyPhen za napovedovanje mutacij izgube funkcije in pridobitve funkcije. Genet Test Mol Biomarkers. 2010; 14 (4): 533–7.

14. Schwarz JM, Rodelsperger C, Schuelke M, Seelow D. MutationTaster ocenjuje potencial povzročitelja bolezni zaradi sprememb zaporedja. Nat metode. 2010; 7 (8): 575–6.

15. Itan Y, Shang L, Boisson B, Ciancanelli MJ, Markle JG, Martinez-Barricarte R, Scott E, Shah I, Stenson PD, Gleeson J, et al. Prerez pomena mutacije: pragovi na ravni genov za napovedi različic. Nat metode. 2016; 13 (2): 109–10.

16. Liu X, Wu C, Li C, Boerwinkle E. dbNSFP v3.0: baza podatkov s funkcionalnimi napovedmi in opombami na enem mestu za človeška nesinonimna SNV in SNV na mestu spajanja. Hum Mutat. 2016;37(3):235–41.