Slikanje ledvic: od svetlobe do super resolucije mikroskopija

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Maria Lucia Angelotti^1,2, Giulia Antonelli^1,2Carolina Conte^1,2in Paola Romagnani^1,2

ABSTRAKTEN

Pomembni dosežki vledvicafiziološke in patofiziološke mehanizme lahko v veliki meri pripišemo napredku v tehnologiji mikroskopije. Veliko od tega, kar vemo o arhitekturiledvicatemelji na temeljnih opisih anatomskih mikroskopov z uporabo svetlobne mikroskopizacije in kasneje z ultrastrukturno analizo, ki jo zagotavlja elektronska mikroskopija. Ti dve tehniki sta bili uporabljeni za prve klasifikacijske sisteme bolezni ledvic in za njihovo stalno posodabljanje. V zadnjem času je serija novih tehnik slikanja dodala analizo v nadaljnjih dimenzijah časa in prostora. Konfokalna mikroskopija nam je omogočila zaporedno vizualizacijo optičnih odsekov vzdolž z-osi in razpoložljivost specifične analitične programske opreme, ki je zagotavljala tridimenzionalno prikazovanje debelejših tkivnih osebkov. Multifotonska mikroskopija nam jeledvicafunkcije in strukture v realnem času. Fluorescencijsko-življenjska slikovna mikroskopija nam je omogočila preučevanje prostorske porazdelitve presnovkov. Superločljivostna mikroskopija je povečala občutljivost in ločljivost do ravni nano lestvice. S cryoelekronsko mikroskopijo bi raziskovalci lahko vizualizirali posamezne biomolekule na atomskih ravneh neposredno v tkivih in razumeli njihovo interakcijo na podcelijskih ravneh. Na koncu je matrično podprta laserska desorpcija/ ionizacija mase spektrometrije dovolila meritev več sto različnih molekul hkrati na odsekih tkiv pri visoki ločljivosti. Ta pregled ponuja pregled razpoložljivihledvicas poudarkom na morebitnem vplivu najnovejših tehnoloških izboljšav.

Ključne besede:imunohistokemijo,ledvicabiopsija, podociti,Proksimalnitubule, matične celice

Cistanche herba za bolezni ledvic, kliknite tukaj, da bi dobili vzorec

UVOD

Vledvičnefascinantna strukturna kompleksnost je potrebna za izpolnjevanje svojih raznolikih fizioloških funkcij. V začetku je preučevanjeledvicamakroskopskih opažanja, njihov prispevek k diagnozi bolezni ledvic pa je bil nedvomno omejen. Opisane so bile klinične manifestacije, vendar pa niso bili znani patogenetski mehanizmi. Dosežke pri razumevanju fiziologije ledvic in patofiziologije lahko v veliki meri pripišemo nadaljevanju napredka na področju mikroskopije. Poskusiledvicaslikanja začela že davno [1]. Leta 1666 je anatom Malpighi preučilledvicatkivo s svetlobnim mikroskopom, ki je imelo moč, ocenjeno na 25–30, in prvič opisano glomerulus kot "žleza, v kateri je bil urin ločen od krvi"[2]. Ta prispevek je bil prezrt do leta 1842, ko je sir William Bowman z 10-krat močnejšim svetlobnim mikroskopom razgalil nefronske strukture. Bowman je odkril periglomerularno kapsulo (kasneje imenovano Bowman kapsulo), kot anatomsko povezano s prvim delom tubula [3]. Leta 1862 je Jacob Henle opisal segment tubule, podoben zanki, ki je vzel njegovo ime, ki povezuje kortikalni tubul in ledvično papilo.

Zahvaljujoč uvedbi svetlobne mikroskopske, histomorfološke klasifikacijeledvicaBolezni[1]. Možnost opazovanja, kaj se je dogajalo pri bolnih ledvicah, je omogočila razumeti, da so se patološke spremembe med bolniki s podobnimi kliničnimi manifestacijami precej spremenile. Vendar pa so prve študije o patoloških spremembah ledvičnih tkiv izvedli na vzorcih obdukcije, kar je vodilo predvsem v opis kroničnih bolezni. Pomanjkanje informacij o razvoju ledvičnih patologij in tehnični problem avtolitičnih pojavov, povezanih z uporabo post-mortem tkiv, omejeno poznavanje človeških bolezni. Leta 1951 je bila uvedbaledvicabiopsija je dovolila neposredno opazovanje in študijo ne le kroničnih, ampak tudi akutnih bolezni ledvic. Medtem je mikroskopija postopoma postajala bolj sofisticirana s progresivno povečano občutljivostjo in ločljivostjo do ravni nanoskale. V tem pregledu bomo zagotovili pregled temeljnih odkritij ledvic, ki jih omogoča napredek v tehnologiji mikroskopija, s poudarkom na možnostih, ki se razvijajo iz najnovejšega tehničnega razvoja.

VIZUALIZACIJA IMUNOPATOLOGIJE LEDVIC

Imunolabeliranje in fluorescenca mikroskopija

Možnost pridobitve reprezentativnega fragmenta živega tkivo je dovolila uporabo nastajajočih tehnik, ki so zahtevale čim večjo ohranitev tkiv, kot so imunohistokemične metode (najprej fluorescenčne, nato encimske). Leta 1950 je Coons razvil metodo označevanja protiteles s fluoresceinsko izocianato, torej imunofluorescenco, ne da bi uničil sposobnost, da bi se posebej odzvali z njihovimi tkivni antigeni. Od takrat je imunofluorescenca vključena v diagnostični postopek za oceno zamrznjenih vzorcev biopsijo ledvic. Te tehnike so prvič dovolile opazovanje intrarenalnih imunoglobulinov (Igs) in dopolnjevanje depozitov pri bolnikih, ki jih je prizadel glomerulonefritis, Pridonošenju diskriminaciji raznih patofiziologija na podlagi določenih nespecifičnih lezija tkiv, na primer, u crescentnom glomerulonefritisu [4]. Poleg tega je možnost opazovanja značilnega vzorca obarvanja in spojitve fluoresceina proti protitelesom, ki niso imunoglobulin G (IgG), privedla do priznavanja naslag imunoglobulina A (IgA) v nefropatiji IgA, I naslage komplementa u postinfektivnom glomerulonefritisu i membranoproliferativnom glomerulonefritisu [4].

Konfokalna mikroskopija

Fluorescenčna mikroskopija je bila v poznih 80. Ključni elementi v konfokalni mikroskopiji so točkasto osvetlitev usmerjena in skenirana nad vzorcem ter spremenljiva konfokalna apertura (pinhole) pred detektorjem, ki omogoča zbiranje svetlobe iz le tankega odseka okoli žarnice (imenovanega optični odsek). Konfokalna mikroskopija je omogočila prve in vivo študije ledvic pri poskusnih modelih ter opazovanje privzetja in transporta fluorescentnih molekul skozi tubule v neosnaženiLedvicepo mikropunkturi. To je omogočilo študije cevaste funkcije v fizioloških in patoloških razmerah [5].

Možnost zaporednih slikovnih optičnih odsekov vzdolž z-osi in razpoložljivost posebne programske opreme za analizo je omogočala tridimenzionalno (3D) prikazovanje debelejših vzorcev tkiv, ki prikazujejo pogoste nedoslednosti in zavajajoče prikaze, ki jih zagotavljajo 2D analize [6, 7] (slika 1A in a"). Poleg tega je uvedba gensko kodirajoče fluorescenčne beljakovine v transgenih miših dovolila označevanje specifičnih celic in izsleditev neposredno znotraj tkiv brez imunosti (strategija sledenja lineaž) [6, 7, 8]. Vendar konfokalna mikroskopija še vedno ni rešila podrobnosti >200 nm zaradi omejitve difrakcije vidne svetlobe, fotobleachinga in fototoksičnosti.

RAZUMEVANJE PREGRADE GLOMERULARNE FILTRACIJE: ELEKTRONA MIKROSKOPIJA

Prvi poskus premaganja meje ločljivosti svetlobnih in fluorescencnih mikroskopov je bil leta 1931, ko sta Ernst Ruska in Max Knoll izumila elektronski mikroskop (EM), ki uporablja snop pospešenih elektronov, Namesto snopa svetlobe, kot vira za vaganje, ima veču resilnu moč od svetlih mikroskopa (do 0,2 nm). Za to inovacijo je Ernst Ruska leta 1986 prejel Nobelovo nagrado za fiziko. Zaradi večje moči ločljivosti je kmalu postalo jasno, da glomerulus ni bil le mehanski filter, ampak izjemno kompleksen organ, sestavljen iz treh plasti: endotelijskih celic, glomerularne kletne membrane (GBM) in podocitov [9]. Prenos EM (TEM) je dovoljeval vizualizacijo glomerularnih celic od znotraj [10] in razkril, da so imele endotelialne celice tanka fenestirana celična telesa, ker su podociti imeli velika celična tela, te da su primarni i sekundarni procesi 'stopala' usidrani na GBM i povezani preko linearnih križišča (rahla prepona) (slika 1B). Poleg tega je skeniranje EM (SEM), ki zajema backscattered elektrone, dovolilo vizualizacijo glomerularnih celic z njihove zunaj površine [10] in razkrilo, da so procesi stopal sosednjih podocitov interdigitirani in pokriti GBM (slika 1C). EM je ostal močan instrument ne le za razumevanje normalne glomerularne ultrastrukture, ampak tudi za razumevanjeledvicafiziologija in patofiziologija [11]. Številne študije, opravljene na vzorcih ljudi ali v poskusnih modelih, so pokazale, da so različni procesi bolezni povezani z nizom razlikovalnih vzorcev ultrastrukturnih sprememb, kar pomeni nadaljnje posodobitve razvijajočega se klasifikacijskega sistemaledvicaBolezni. Tehnična sposobnost za vizualizacijo nadaljnje kompleksnosti ledvične ultrastrukture je podpirala specializacijo "nefro"patologov.

Nedavna tehnika SEM, ki temelji na zelo občutljivem detektorju, je omogočila študijo najglobljega dela prerezane diafragme in pokazala, da so zanjo značilne pore različnih velikosti [12]. Pri podganah je bil napotek proteinurija povezan z velikimi porami, kar je dvignilo možnost, da bi lahko bile ultrastrukturne spremembe prerezane diafragme vzročne za spremembe glomerularne permselektivnosti [12]. Kot nadaljnji tehnični napredek je blok-face SEM dovolil prehod iz 2D v 3D pogled na glomerularno filtracijo oviro z resolucijo, ki zadostuje za spremljanje nanostrukture najtanjših celičnih procesov pri zdravih miših, bolnih miših in medledvica[13, 14].

Nazadnje je stisnjenje EM na rentgenski mikroanaliza sistem (rentgenska mikroskopija) omogočilo elementarno analizo celic ali delov celic na ultrastrukturni ravni. Rentgenska mikroskopija za vzburjanje vzorca uporablja skeniranje TEM z ozkim elektronskim žarkom. Vpliv visokoenergetskih elektronov iz žarka z atomi v primerku proizvaja energijo v obliki rentgenskih fotonov. Ta rentgenski signal, zbran z detektorjem energijsko razpršenega polprevodnikov, se uporablja za identifikacijo elementov, prisotnih v vzorcu, z ločljivostjo 30 nm. Vledvicarentgensko mikroanalizo sta Beck in Thurau uspešno izkoriščena za preučevanje transepitelialnega tubule ionega transporta [15] in znotrajcelične elementarne koncentracije v tubulnih celicah [16].

VIZUALIZACIJA LEDVIČNE FIZIOLOGIJE Z MULTIFOTONSKO MIKROSKOPIJO

Multifotonska mikroskopija (MPM) je zagotovila nadaljnji napredek priledvicaraziskave, torej možnost hkratnega preiskovanja ledvične funkcije in strukturnih odnosov v realnem času [17]. Od običajnih svetlobnih mikroskopov je dvofatsko razburjenje odvisno od hkratne absorpcije dveh fotonov z dvojno valno dolžino, ki je potrebna za razburjenje fluorofora v klasičnem eno-fotonu (slika 1D). Uporaba komercialno razpoložljivih impulzovnih infrardečih, nizkoenergetskih razburljivih laserjev je povečala globoko penetracijo v tkivo in čim bolj zmanjšala fototoksičnost (slika 1D). To je raziskovalcem omogočilo vizualizacijo dinamičnih celičnih procesov neposredno pri živih živalih, kar je značilnost, ki prej ni bila dosegljiva z nobeno drugo tehniko. MPM dovoljuje kvantifikacijo osnovnih ledvičnih funkcij in patoloških sprememb, kot so glomerularna prežemanost, žilni pretok krvi, hitrost enonefronske glomerularne filtracije in tubularni pretok [17] (slika 1E in F). Poleg tega MPM dovoljuje študijo znotrajceličnih procesov kot odziv na poškodbe, vključno s smrtjo celic in raztovarjanjem, valjanjem levkocitov ter zaposlovanjem in motnjami GBM [17]. Nadaljnje tehnične izboljšave so v več dneh do tednov dovoljele podaljšano intravitalno slikanje [18], ki so se v kombinaciji s transgenimi mišmi, ki izražajo fluorescenčne beljakovine, uporabljale za sledenje usode posameznih celic neposredno in vivo v zdravih in poškodovanih ledvicah [19] ter za boljše razumevanje mehanizmov prometa in regeneracije ledvičnih celic.

Tehnike slikanja brez nalepk so bile možne tudi z MPM, ki so izkoriščale naravno avtofluorescenco nikotinamid adenin dinukleotidnega hidrata (NADH) za preučevanje redoksnega stanja tubularnih celic po poškodbi [20]. Poleg tega je bila druga harmonična generacija fibrilarnega kolagena uporabljena za količinsko dotok kolagena, označevalnik ledvične fibroze [21]. Druga harmonična generacija je ne linearan optični proces, v katerem dva fotona za razburjenje z enako valovno dolžino medsebojno sodelujeta z necentrosimetričnimi strukturami v bioloških tkivih, kot so kolagen ali mikrotubuli, in ustvarita nov foton s polovico valovne dolžine.

Nedavna novost intravitalne mikroskopske slike je bila uvedba miniaturiziranega multifotonskega endoskopa, ki se uspešno uporablja za slikanje ledvic pri živih anestetiziranih miših [22]. To minimalno invazivno MPM lahko utire pot za diagnozo in vivo v realnem času, brez odstranjevanja tkiv, in v zelo kratkem času.

LEDVICA V 3D: TEHNIKE RAZČISTITVE TKIV IN RAZŠIRITVENA MIKROSKOPIJA

Kljub tehnološkim izboljšavam je ena od glavnih omejitev za globlje volumetrično slikanje motnost ledvičnegaledvicaeden od optično najbolj zahtevnih organov. To je razlog, zakaj so tehnike za kliiranje tkiv dvignile veliko zanimanja [23]. Cilj teh pristopov je pretvoriti neprozorno tkivo v pregledno, ohranjanje beljakovin in sčasoma fluorescenčne markerje, za sliko debele rezine tkiv. Kombinacija optične klisiranje z najmodljo mikroskopijo zagotavlja možnost morfometrične analize, kot je kvantifikacija glomerularnega volumna in števila, v debelih tkivih ali celo v neohajani ledvici [24]. Druge aplikacije vključujejo analizo ločenih segmentov tubul [25], njihove funkcije [26] in količinsko izgubo podocita [27].

Da bi slikali velike količine tkiv in hkrati rešili fine strukturne podrobnosti, je bil pred kratkim uveden nov tehnični pristop, to je ekspanziona mikroskopija (ExM). Ideja je fizično razširiti celoten organ 4- do 5-krat, hkrati pa ohraniti celotno arhitekturo in 3D proteomsko vsebino. Z uporabo širitvenega polimera, neposredno sintetiznega znotraj vzorca, so molekule bližje od difrakcijo meje svetlobe izotropno ločene v prostoru do večjih razdalj in jih je zato mogoče optično razrešiti tudi s konvencionalnim fluorescentnim mikroskopom. Poleg tega ExM zagotavlja večjo optično preglednost in zmanjšuje raztresenost svetlobe, kar omogoča, da vizualizirajo večjo prostornino tkiv. Z uporabo tega pristopa je mogoče lokalizacijo več beljakovin v prerezani diafragmi in GBM seciti tudi z običajnim konfokalnim mikroskopom [28]. Na primer, lahko razkrije izliv procesov stopala pri proteinuričnih miših, tako v 2D kot 3D, pri ločljivosti nanometra, ki še nikoli ni bila dosežena [29]. Pred kratkim exM je bil uporabljen za klinično histopatološko oceno parafina vdelanih osebkov, ki so že maže s hematoksilinom in eozinom [30]. Ta tehnika lahko vizualizira izliv stopala na ravni nanoscale, ki je bila prej mogoča samo z EM. Napredek pri volumetrični slikanju dovoljuje visoko ločljivost 3D analizo celotnega organa na način, da je glavna omejitev globokega slikanja zdaj predstavljena z zmogljivostjo, da protitelesa prodrejo v tkivo.

PREUČEVANJE PRESNOVNEGA PROFILA: FREKVENČNI-DOMENSKI FLUORESCENČNI-DOŽIVLJENJSKO SLIKOVNO MIKROSKOPIJO

Vledvicaje presnovni organ z visoko vsebnostjo mitohondrije. Zmanjšana oblika NADH in drugih presnovkov je naravno fluorescentna in to avtofluorescenco lahko uporabimo kot indeks stanja redoksa [20]. Vendar pa se emisijski spektri teh endogenih fluoroforov prekrivajo in ločeno prepoznavanje je bilo nemogoče. Vendar se je ugotovilo, da je fluorescencijsko življenje (torej časovno propadanje fluorescencence) bistveno drugačno. Zato fluorescencijsko-življenjska slika mikroskopija (FLIM) omogoča študijo presnovnih profilov [31]. V zadnjem času je z uporabo kombinacije MPM in FLIM postalo mogoče opredeliti presnovne podpise specifične za celice in spremljati metabolične spremembe v vivo medledvicabolezni [32]. Od flim se pričakuje, da bo zagotovil nadaljnje vpoglede vledvicain vivo pri zdravju in boleznih.

POTISKANJE RESOLUCIJE PREKO MEJA: SUPER-RESOLUCIJA SLIKA LEDVICE

Standardna svetlobna mikroskopija se sooča z mejo optične ločljivosti, ki presega 200 nm. Nove tehnologije, ki se imenujejo slikanje super-ločljivosti, zdaj omogočajo fluorescentno mikroskopijo, da slika preko svoje meje difracije kot izhodišče v obdobju nanoskopije [33]. Ti pristopi združujejo nanoskopsko ločljivost s prednostmi označevanja večbarvnega fluorescenčnega postopka. V znak priznavanja morebitnega vpliva teh inovacij je bila Nobelova nagrada za kemijo 2014 podeljena Ericu Betzigu, Stefanu Peklu in Williamu Moernerju "za razvoj super rešene fluorescenčna mikroskopija. Za obravnavanje različnih bioloških vprašanj je mogoče uporabiti različne strategije slikanja super resolucije. Ti pristopi se lahko združijo v dve glavni kategoriji, odvisno od tega, ali se superrelucijo izkorišča na ravni posameznih molekul ali v ansamblih [33].

Tehnike na osnovi ansambla

Tehnike, ki temeljijo na ansamblu, prelomijo mejo difracije s temporalno in prostorsko modulacijo svetlobnega žarka. Med njimi, super-resolucija spodbuja izčrpanost emisij (STED) slikanje uporablja dva laserja, razburljiv laser in superimposed, rdeče-preusmerjen, izčrpanost laser (STED laser), s krof obliko, za zatiranje fluorescenčne emisije iz fluoroforov, ki se nahajajo v središču razburljivega. To zatiranje se doseže s spodbujano emisijo in omogoča zbiranje samo signala, ki izvira iz središča mesta z dimenzijo pod mejo difrakcije (slika 2A). SLIKANJE STED je bilo uporabljeno za slikanje prerezane diafragme v optično očisledvicatkiv (slika 2B–c)) in dovoljena lokalizacija prostorske porazdelitve podocina in nefrena na nanometrski lestvici do najmanj 30 lm globine [34]. Poleg tega lahko možnost opazovanja in kvantifikacije izliva procesov stopal v poskusnem modelu naredi STED sliko uporabno za študije glomerularne filtracije [34].

SteD mikroskopija zahteva posebne protokole za pripravo vzorca, posebne fluorofore in tehnično usposabljanje. Zaradi tega je bila v zadnjih nekaj letih več pozornosti namenjana še eni tehniki superločbe, strukturirani osvetlitveni mikroskopi (SIM), ki lahko razširi mejo difracije za faktor dveh tako lateralno kot oksizično. SIM uporablja širokopoljsko nastavitev mikroskopa z vzorcem fine črte za osvetlitev, kar omogoča zajemanje visoko frekvenčnih informacij (ki ustrezajo finim podrobnostim v vzorcu) na nižjih prostorskih frekvencah. S pridobivanjem več slik z vzorci osvetlitve različnih faz in usmeritev je mogoče rekonstruirati sliko visoke ločljivosti (slika 3A). SIM je združljiv s standardnimi fluoroforji, ne zahteva posebne priprave vzorca in dovoljuje 3D vizualizacijo. Glede na vse te prednosti so bile izvedene različne študije za oceno možnosti uporabe sim kot hitrega diagnostičnega orodja [35], na primer z morebitnim krajšim časom obrata kot EM. Nedavno so 3D SIM in avtomatizirano obdelavo slik uporabljali kot hitro diagnostično orodje za izliv procesov stopal z uporabo rutinskih parafinskih odsekov iz biopsij bolnikov z minimalno spremembo bolezni [36] (slika 3B in C). Ta sposobnost za uspešno prepoznavanje sprememb pri boleznih, za katere je znano, da razstavljajo nanoscale patologijo potrdil SIM kot obetavno orodje za rutinsko diagnostiko.

Metode slikanja z eno molekulo na osnovi lokalizacije

Te tehnike se zanašajo na možnost ciklične vključitve in izklopa posameznih fluorescentnih molekul, ki so preveč blizu, da bi jih bilo mogoče razrešiti. V teh pristopih se molekule znotraj difrakcijo omejene regije lahko aktivirajo v različnih časovnih točkah, tako da jih je mogoče individualno slikati in nato lokalizirati z nanometrsko natančnostjo z računsko iskanjem svojih centrov (slika 3D). Med temi pristopi je bila stohastična optična rekonstrukcijska mikroskopija (STORM) prvič uvedena vledvicaraziskave leta 2013 s študijo, ki je pokazala zapleteno molekularno organizacijo GBM na nanometrski natančnost, vključno z usmerjenostjo molekul v [37]. V mišjem modelu redkega prirojenega nefrotskega sindroma je ZDRAVILO STORM razkrilo integracijo in pravilno usmerjenost laminina 521 znotraj GBM po intravenskem injiciranju, kar je odprlo pot za napredne terapevtske možnosti za bolnike [38]. V drugi študiji je bila opisana organizacija aktin citoskelet v podocitih pri ločljivosti molekularne lestvice [39] (slika 3E–I). Kot novo ugotovitev, podociti vsebujejo krčil aktin svežnjev, povezanih z neprektilni aktin svežnjev v stopalnih procesih. V modelih poškodb podocita se je struktura aktina v procesih stopala razčlenjena, kar je povzročilo zlom konstrukcije za krdelo v glavnem organu [39].

VIZUALIZACIJA 3D STRUKTUR TEMELJNIH BIOMOLEKULOV NA ATOMSKI RAVNI: CRYO-ELECTRON MICROSCOPY

Do nedavnega je bila možnost preučevanja strukture temeljnih biomolekulov omejena na elektronsko mikroskopijo, z ločljivostjo nekaj nanometrov. Tehnične ovire, kot so poškodbe vzorca z intenzivnim elektronskim žarometom, nizko slikovnim kontrastom in premiki molekul po interakciji z elektroni ali težave pri ohranjanju vode v bioloških vzorcih v sekumu, ki se uporablja znotraj EM komore, zaradi česar je nemogoče razrešiti molekule pod to velikostjo. Hlajenje vzorca lahko zmanjša izhlapevanje vode in škodo, ki jo povzroči elektron [40]. Iz te ideje je bila v 50. Pred nekaj leti je uvedba novega detektorja enoelekronskega štetja končno potisnila resolucijo preko prejšnjih meja. Leta 2017 je bila Nobelova nagrada za kemijo podeljena Jacquesu Dubochetu, Joachimu Franku, in Richardu Hendersonu za "razvoj cryoelekronske mikroskopizacije za določitev strukture visoke ločljivosti biomolekulov v raztopini". Ta napredek zdaj omogoča strukturno določanje biomolekulov v raztopini [41].

Vledvicaso bile strukture temeljnih beljakovin določene na atomski ravni [42, 43]. Med njimi je struktura človeškega polycystin-2, katerih mutacije so odgovorne za avtosomno dominantno polycysticledvicabolezni [44], in strukturo prehodnih receptorjev potencialnih canonical 6 ionskih kanalov, katerih mutacije povzročajo FSGS pri ljudeh [43], so bili določeni z ločljivostjo nekaj angstromov [44].

RAZUMEVANJE MOLEKULARNE PODLAGE ZA BOLEZNI LEDVIC: INTEGRATIVNA LEDVIČNA MIKROSKOPIJA

V zadnjih nekaj letih se je povečalo zanimanje za pristope brez oznak, ki bi lahko posebej in hkrati preslikali skupni spekter molekul v tkivih [45]. Med njimi matrix-as-sisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry (MALDI-IMS) omogoča merjenje več sto različnih molekul hkrati neposredno na odsekih tkiv pri visoki ločljivosti. V maldi-IMS eksperimentu je del tankega tkiv, zamrznjen ali parafinsko vgrajen, obložen z matriko, ki absorbira lasersko energijo in spodbuja ionizacijo tkivnih analitov. Analiza v masnem spektrometru ustvari spekter za vsako x/y koordinato. Po meritvi MALDI se lahko isti del tkiv obarva s tradicionalnimi histokemičnih in imunohistokemičnih postopkih za integracijo molekularnega vzorca s histološkimi podrobnostmi. Pri raziskavah ledvic se zdravilo MALDI-IMS uporablja za preučevanje zdravil, presnovkov, lipidov, peptidov in beljakovin v normalnih in bolnih tkivih [45].

Ena najpogostejših aplikacij MALDI-IMS je identifikacija molekularnih označevalcev za razvrščanje karcinoma ledvičnih celic [46] in določitev prave marže med rakavim in normalnim tkivom na molekularni in histološki ravni [47]. MALDI-IMS se je uspešno uporabljal tudi za preučevanje toksičnosti za ledvična zdravila za zgodnje odkrivanjeledvicamehanizmi škode, ki so jih posredovani s strani farmacevtskih kandidatov [48]. Poleg tega se zdravilo MALDI-IMS uporablja za preučevanje lipidov in njihove vloge pri ledvičnih patologijah, kot so diabetična nefropatija [49], akutna poškodba ledvic [50] inledvicabolezni [51], in tudi za razkrivanje endogenih presnovnih profilov za globlje razumevanje mehanizmov, povezanih z boleznijo [52]. Opredelitev molekularnih profilov je bila dokončana tudi za možne biomarkerje, ki bi lahko bili novi potencialni diagnostični in prognostični biomarkerji [53, 54].

ZAKLJUČKI IN PRIHODNJE PERSPEKTIVE

Nenehno izboljševanje tehnik slikanja je postopoma rešilo številne kritične tehnične ovire vledvicaomogoča dinamično prikaz strukture in delovanja v normalnih in bolnih ledvicah. Dejansko je pojav novih tehnologij mikroskopije omogočil temeljna znanstvena odkritja in nato spremenil naš pogled na fiziologijo ledvic in patofiziologijo, ki jo je zdaj mogoče vizualizirati v 3D in celo posneti v videoposnetkih, kjer čas predstavlja četrto dimenzijo. Z nedavno tehnološko inovacijo super-resolucije mikroskopijo in napredkom molekularnih tehnik slikanja, lahko raziskovalci zdaj ponazorijo posamezne bio-molekule neposredno v tkivih in določijo, kako interakcijo na celični in podcelični ravni.

Možnost uporabe teh orodij za patološkeledvicaprimerki, ki se osredotočajo na molekularne in subceliularne podrobnosti v kliničnih biopsijah, bi morali pomagati pri ponovno razvrstitvi bolezni. Če in, ko bo to ustvaril vpliv na diagnozo bolezni ledvic ali celo na zdravljenje bolnikov, je trenutno nejasno.

FINANCIRANJA

Financiranje je zagotovil Evropski raziskovalni svet v okviru programa Evropske unije za raziskave in inovacije Obzorje 2020 (sporazum o nepovratnih sredstvih 648274).

SKLICEVANJA

1. Weening JJ, Jennette JC. Zgodovinski mejniki v ledvični patologiji. Virchows Arch 2012; 461: 3–11

2. Malpighi M. De Viscerum Structura exercitatio anatomica. Bologna1666

3. Bowman W. O strukturi in uporabi malpighskih organovledvica, z opazovanji o obtoku skozi to žlezo. Philos Trans R Soc A 1842;132:57–80

4. D'Agati VD, Mengel M. Porast ledvične patologije v nehrologiji: struktura osvetli funkcijo. Am JLedvicaDis 2013; 61: 1016–1025

5. Ohno Y, Birn H, Christensen EI. In vivo konfokalna laserska mikroskopija in mikropunktura pri neokuženih podganah. Nephron Exp Nephrol 2005; 99: e17–e25

6. Romoli S, Angelotti ML, Antonelli G. CXCL12 blokada prednostno regenerira izgubljene podocite v kortikalnih nefronih s ciljno usmerjenim intrinsic podocyte-progenitor povratni mehanizem.LedvicaInt 2018; 94:1111–1126

7. Lazzeri E, Angelotti ML, Paired A et al. Hipertrofija cevnih celic, povezana z endocikli in propenitorjem, po akutnemledvicaPoškodbe. Nat Commun 2018; 9: 1344

8. LeHir M, Kriz W. Nova spoznanja o strukturnih vzorcih, na katere se srečujejo pri glomerulosklerozi. Curr Opin Nephrol Hipertens 2007; 16: 184–191 9. Tisher CC. Funkcionalna anatomijaledvica. Hosp Pract 1978; 13

10. Liapis H. Elektronska mikroskopija vledvicaraziskave: videti je verjeti. Ultrastruct Pathol 2013; 37: 340–345

11. Močan ML, Evers P. Tretja dimenzija pri ledvični diagnozi. Skeniranje elektronskih mikroskopij normalnih in nenormalnih ledvic. S Afr Med J 1979; 55:174–177

12. Gagliardini E, Conti S, Benigni A et al. Slikanje porozne ultrastrukture glomerularne epitelne filtracije. J Am Soc Nephrol 2010; 21:2081–2089

13. Lausecker F, Tian X, Inoue K et al. Vinculin je potreben za ohranjanje glomerularne celovitosti pregrad.LedvicaInt 2018; 93: 643–655

14. Ichimura K, Kakuta S, Kawasaki Y et al. Morfološki proces razvoja podocita, ki ga razkriva blok-face skeniranje elektronski mikroskopija. J Cell Sci 2017; 130: 132–142

15. Rick R, Dorge A, Beck FX et al. Rentgenska rentgenska mikroanaliza transepitelialnega ionega transporta. Ann N YAcad Sci 1986; 483: 245–259

16. Thurau K, Dorge A, Mason J et al. Znotrajcelične elementarne koncentracije v ledvičnih tubularnih celicah. Analiza mikroprobnih elektronov. Klin Wochenschr 1979;57: 993–999

17. Peti-Peterdi J, Kidokoro K, Riquier-Brison A. Novela in vivo tehnike za vizualizacijoledvicaanatomiji in funkciji. Ledvična int 2015; 88: 44–51

18. Schuh CD, Haenni D, Craigie E, et al. Multifotonsko razburljivo dolgo valovno dolžino je koristno za intravitalnoledvicaSlikanje.LedvicaInt 2016; 89: 712–719

19. Hackl MJ, Burford JL, Villanueva K et al. Sledenje usodi glomerularnih epitelnih celic in vivo z uporabo serijskega multifotonskega slikanja v novih modelih miške s fluorescentno linearno oznako. Nat Med 2013; 19: 1661–1666

20. Hall AM, Unwin RJ, Parker N, et al. Multifotonsko slikanje razkriva razlike v mitohondrijskem delovanju med segmenti nefronov. J Am Soc Nephrol 2009; 20: 1293–1302