Imunski odzivi na zaporedno binokularno presaditev alogenskih matičnih celic mrežnice v steklasto votlino pri miših

Povzetek:

Intravitrealna presaditev alogenskih matičnih celic človeške mrežnice (RPC) je obetavna kot zdravljenje slepe degeneracije mrežnice. Predhodno delo je pokazalo, da se nevralni predniki dobro prenašajo kot alografti po enkratnih injekcijah; vendar pa zaporedna dostava alogenskih celic poveča potencialno tveganje za preobčutljivost gostitelja s kasnejšo imunsko zavrnitvijo presadkov. Trenutna študija je bila zasnovana za oceno, ali bi imunski odziv sprožili ponavljajoči se intravitrealni presadki alogenskih RPC z uporabo živalskega modela miši. Mišim prejemnicam BALB/c smo vbrizgali matične celice mišje mrežnice (gmRPC), prvotno pridobljene od darovalcev z genetskim ozadjem C57BL/6, da bi zagotovili varnostne podatke o tem, kaj se lahko pričakuje po ponavljajočem zdravljenju bolnikov z alogenskim produktom človeških celic. . Imunski odzivi na gmRPC so bili blagi, sestavljeni iz celic T, celic B, nevtrofilcev in naravnih celic ubijalk, pri čemer so jasno prevladovali makrofagi. Živali, zdravljene s ponavljajočimi se odmerki gmRPC, niso pokazale znakov preobčutljivosti niti ni bilo imunsko posredovanega uničenja presadkov. Kljub odsotnosti imunosupresivnega zdravljenja so alogenski presadki gmRPC preživeli po ponovnem odmerjanju, kar je zagotovilo podporo za predhodno ugotovitev, da bolniki s pigmentozo retinitisa tolerirajo ponavljajoče se injiciranje alogenskih RPC v steklovino.

rastlina cistanche krepi imunski sistem

Kliknite tukaj za ogled izdelkov Cistanche Enhance Imunity

【Vprašajte za več】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com/Whats App: 0086 18599088692/Wechat: 18599088692

Ključne besede: izvorne celice; imunska toleranca; imunski privilegij; zavrnitev presadka; intravitrealno injekcijo

1. Uvod

Retinitis pigmentosa (RP) zajema razred genetske degeneracije paličastega stožca in povzroči progresivno okvaro vida in morebitno slepoto. V veliki večini primerov ni na voljo dokazanih terapevtskih ukrepov za ohranitev ali povrnitev vida; vendar je ena od strategij za reševanje te neizpolnjene medicinske potrebe presaditev matičnih celic. Naša raziskovalna skupina je raziskala intravitrealno injiciranje gojenih matičnih celic človeške mrežnice (RPC) kot način poseganja v RP s terapevtskim ciljem stabilizacije napredovanja ali morda obrnitve poteka bolezni. RPG je mogoče pridobiti iz nezrelih mrežnic z darovanjem tkiva ali, v zadnjem času, iz pluripotentnih celičnih linij. Študije na živalskih modelih so pokazale, da so te celice sposobne rešiti fotoreceptorje pred degeneracijo po injiciranju v oko in se lahko diferencirajo v paličaste fotoreceptorje v očesu gostitelja. Obstaja nekaj dokazov iz študij na živalih, da lahko vbrizgani hRPC postanejo funkcionalni, integrirani fotoreceptorji in tako potencialno stabilizirajo mrežnico z neposredno zamenjavo odmirajočih celic. Tako lahko vbrizgani hRPC zdravijo RP tako na nevrotrofični način kot tudi prek mehanizma za zamenjavo celic. Kakor koli že, ta celični pristop ponuja racionalno strategijo za zdravljenje bolnikov z RP in potencialno drugimi boleznimi mrežnice.

Druga ugodna lastnost RPC-jev in morda nevralnih prednikov na splošno je relativna toleranca, ki jo imajo te celice po presaditvi kot alografti, zlasti kadar so dostavljene na lokacijo, ki kaže imunski privilegij, kot je mrežnica [1,2]. Kljub temu nedavni pregledi kliničnih preskušanj, izvedenih na področju regenerativne medicine, še naprej poročajo o razširjenih in pomembnih izzivih, povezanih z vnetjem in imunsko zavrnitvijo [3,4], vključno s posegi, ki ciljajo na oko, kot so genske terapije za mrežnico [5], kot tudi nekatere, vendar ne vse celične terapije [6]. Čeprav je vrsta lokalne celice, celica pigmentnega epitela mrežnice (RPE) ni izvzeta iz težav z zavrnitvijo [7–9]; zato je imunska supresija prejemnikov trenutno standardna praksa [10,11]. Po drugi strani se zdi, da se človeški RPC-ji izjemno dobro prenašajo kot alografti [6,12–16], čeprav to ne velja za njihovo uporabo kot ksenografti, kjer je potrebna imunska supresija [17]. Osnova za trajno preživetje alogenskih RPC v očesu bo verjetno vključevala številne dejavnike, povezane z uporabljenimi celicami in mestom prejemnika [1,8,18,19]. V prejšnjem delu z uporabo pretočne citometrije smo pokazali, da človeški nevralni predniki, tako iz možganov kot iz mrežnice, izražajo antigene glavne histokompatibilnosti (MHC) razreda I, ne pa tudi razreda II [20,21]. Klasični mehanizem zavrnitve presadka vključuje nespecifično prepoznavanje tujih molekul MHC razreda II s CD4+ gostiteljskimi limfociti [20–25]. Na ta način lahko odsotnost molekul razreda II omogoči cepljenim matičnim celicam, da se izognejo imunski zavrnitvi, posredovani prek tega mehanizma. Vendar pa navidezni status "imunsko privilegiranih" intravitrealno vbrizganih hRPC ni nujno absoluten. Medtem ko potomci mišjega centralnega živčnega sistema (CNS) ne izražajo zaznavnih molekul MHC razreda I ali razreda II na začetku in kažejo očitno imunsko prednost kot alografti [1,2,20], lahko te celice v določenih okoliščinah podvržejo imunski zavrnitvi. Študije so pokazale, da je mogoče antigene MHC inducirati s stimulacijo matičnih celic CNS z interferonom gama (IFN) [1,26]. Predniki CNS se lahko zavrnejo po senzibilizaciji predhodno cepljenega gostitelja. Zato matične celice CNS (vključno z RPC) izražajo aloantigene, ki jih zazna imunski sistem gostitelja. Skupaj to pomeni, da je imunsko privilegiran status cepljenih matičnih celic začasen in podvržen modulaciji, npr. s citokini, prisotnimi v lokalnem mikrookolju, in ki se lahko spremenijo med potekom degeneracij, kot je RP. Zaradi vseh teh razlogov je imunski odziv na večkratne intravitrealne injekcije RPC težko predvideti in ga je treba posebej pregledati.

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

Če se zdravljenje z RPC izkaže za klinično uspešno pri RP, bodo pri tej dvostranski slepi bolezni obstajale močne spodbude za zdravljenje obeh očes. Vsaj zaradi varnosti bi se zdravljenje z binokularjem običajno izvajalo zaporedno, s precejšnjim zamikom med obema injekcijama. Omeniti velja, da lahko ta zaporedna dostava alogenskih celic povzroči preobčutljivost gostitelja kot odgovor na prvo injekcijo, kar lahko sproži imunsko zavrnitev kot odgovor na drugo injekcijo. To lahko povzroči izgubo presadkov v obeh očesih. Predhodna poročila o preučevanju enkratnega subretinalnega odmerjanja s hRPC v RP [27] ali ponovnega odmerjanja s človeškimi nevralnimi predniki pri živalih [28, 29] so vključevala imunsko supresijo. Zato je bila naslednja študija zasnovana kot translacijska raziskava mišjih RPC kot zaporednih alograftov v imunsko kompetentnem mišjem sevu z različnim genetskim ozadjem. Čeprav ni vključevalo človeških izdelkov RPC, je bilo to delo opravljeno kot del študij, ki omogočajo IND, da bi zagotovili podatke o živalih, ki obravnavajo varnost, tj. ali bi bila imunska supresija potrebna za bolnike, ki prejemajo ponavljajoče se zdravljenje z alograftom RPC v preskušanjih, registriranih pri FDA.

2. Rezultati

Za preučevanje imunoloških posledic obojestranskega injiciranja RPC pri alogenskih miših so gmRPC (gensko ozadje C57BL/6) injicirali intravitrealno v eno oko prejemnikov BALB/c in drugi odmerek RPC injicirali v drugo oko 2 tedna kasneje. 2-tedenski časovni interval je bil izbran tako, da zadostuje, da omogoči prvemu presadku inducirati prirojene in adaptivne imunske odzive. Nobena od poskusnih živali ni prejela nobenih imunosupresivnih zdravil, da bi lahko opazovali naravne fiziološke imunske odzive.

2.1.Klinično opazovanje in oftalmološki pregled nista pokazala nenormalnosti

Teže poskusnih živali so bile izmerjene ob vsaki injekciji gmRPC. Vse poskusne živali so pokazale povečanje telesne mase med prvo in drugo injekcijo, kar je skladno s splošnim dobrim zdravjem. Živali, ki so bile končane na dan 14 in dan 28 ± 1 po drugi injekciji gmRPC, so bile pregledane skozi kirurški mikroskop. Ocenjeno je bilo, da sta sprednji in zadnji segment večine pregledanih oči "v mejah normale" (WNL). V skupinah, ki niso bile zdravljene, lažno zdravljene ali zdravljene z gmRPC, ni bilo znakov vnetja ali drugih vidnih nepravilnosti, kar kaže, da intravitrealna injekcija gmRPC ni povzročila nezakonitih vnetnih odzivov ali fizične poškodbe tkiva, ki bi jo bilo mogoče zaznati s to metodo. Skupki celic, ki so sestavljali presadek, so bili vidni v steklovini tako 14. dan kot 28. dan ± 1 po drugi injekciji gmRPC (slika 1). Ponavljajoče se injiciranje gmRPC ni povzročilo opaznih sprememb v velikosti celičnih grozdov, kar je skladno s trajnim preživetjem donorskih celic. Huda patologija je bila ovrednotena tudi na končni končni točki in niso opazili povečanih očesnih zrkel (ki kažejo na nastanek tumorja) ali drugih nepravilnosti.

Slika 1. Presajeni gmRPC-ji, vizualizirani in vivo s fotografijo fundusa skozi kirurški mikroskop (vse=levo oko, OS). (A, B), navidezno zdravljene živali (lažno/lažno, S/S); (C, D), kontrolne živali z navidezno zdravljenim desnim očesom, ki mu je sledilo levo oko, zdravljeno z gmRPC (navidezno/celica, S/C), in živali z obema očesoma, ki sta bili zaporedno zdravljeni z gmRPC (celica/celica, C/C) opazovati in slikati skozi kirurški mikroskop. Zgornja plošča (A, C, E) prikazuje slike OS, posnete 14. dan po drugi injekciji; spodnja plošča (B, D, F) prikazuje slike operacijskega sistema, posnete 28. dan po drugi injekciji. Alografti so bili vidni kot bledo obarvane celične grude (puščice), vidne v steklovini levega očesa, v katerega so bile vbrizgane celice (S/C, C/C) na obeh časovnih točkah (14. dan: (C, D); in 28. dan: ( E, F)). Razen presadkov ni bilo vidnega nobenega očitnega vnetja ali dodatne nenormalnosti v sprednjem in posteriornem segmentu, gledano aksialno na ta način.

2.2. Imunofluorescentno označevanje je pokazalo imunske celice v steklovini

Imunofluorescentno označevanje za pet glavnih vrst imunskih celic (makrofage, nevtrofilce, naravne celice ubijalke, celice T in celice B) je bilo izvedeno na očesnih kriosekcijah in je pokazalo pozitivno infiltracijo imunskih celic v očesu po injiciranju gmRPC (slika 2A–F). Celice T (CD3), celice B (CD45R), nevtrofilci (Ly-6G) in naravne celice ubijalke (CD49b) so pokazale omejeno prisotnost v očeh, ki so jim vbrizgali gmRPC, medtem ko so bili aktivirani makrofagi (Iba-1 ) so bile glavne imunske celice, ki so se odzvale na intravitrealne presadke. Primerljivo tkivo nezdravljenih in lažno zdravljenih živali ni pokazalo imunskih celic v očesnih kriosekcijah, kar kaže na to, da je bila opažena infiltracija imunskih celic odziv na presadke gmRPC. V skladu s tem opažanjem so bile imunske celice locirane na območju, ki obdaja cepiče gmRPC ali znotraj samih gruč gmRPC.

Slika 2. Imunsko označevanje infiltriranih imunskih celic po zdravljeni skupini. Imunofluorescenčne slike (A) kontrolnih odsekov (samo sekundarno protitelo), (B) anti-Iba-1 (marker aktiviranih makrofagov in mikroglije), (C) anti-Ly-6G (marker nevtrofilcev), (D) anti-CD49b (naravni marker celic ubijalk), (E) protitelesa proti CD3 (marker celic T) in (F) anti-CD45R (marker celic B) so prikazani na sliki. Prisotni omejeni rdeči signali kažejo na pozitivno označevanje protiteles za markerje levkocitov, zeleni signali označujejo presadke gmRPC, modri signali pa označujejo jedro DAPI. Rumena je nespecifično prekrivanje signalov, najbolj očitno v zunanjih segmentih fotoreceptorjev, ki kažejo avtofluorescenco. Skupine zdravljenja: nezdravljeni (UT), obe očesi nezdravljeni; S/S, obe očesi lažno obdelani (zaporedoma) z nosilcem; S/C, desno oko, vbrizgano z vehiklom, nato levo oko s 50,000 gmRPC in; C/C, v obe očesi vbrizganih 50000 gmRPC (zaporedoma) po razporedu v razdelku 4

Najvišje število vsake imunske celice v očesu se je razlikovalo glede na tip celice (slika 3A–E). V nasprotju s tem dvosmerna ANOVA ni pokazala razlik v infiltraciji imunskih celic pri primerjavi živali, ki so prejele posamezne injekcije gmRPC (navidezne/celice), s tistimi, ki so prejele dvostranske injekcije (celice/celice). To je veljalo za infiltracijo makrofagov (obarvanje proti Iba-1) (slika 3A), nevtrofilce (obarvanje proti Ly-6G) (slika 3B), naravne celice ubijalke (obarvanje CD49b) ( Slika 3C), celice T (obarvanje s CD3) (slika 3D) in celice B (obarvanje s CD45R) (slika 3E).

2.3. ELISPOT ni pokazal odzivov na odpoklic antigena

ELISPOT je način za testiranje aktivacije T-celic, ki proizvaja antigen specifičnega IFN. Zdravljenje s forbol 12-miristat 13-acetatom (PMA) je bila pozitivna kontrola, ki je posnemala drugi prenašalec sporočil, DAG, za aktiviranje poti T-celičnega receptorja in nato povzročilo aktivacijo T-celic. Na sliki 4A–D so skupine, zdravljene s PMA, pokazale veliko večje število točk IFN v primerjavi s kontrolnimi skupinami s samimi odzivnimi celicami (tj. limfociti iz CLN, splenociti iz vranice). Ko so odzivne celice gojili skupaj s splenociti C57BL/6 (B6 SPL), so bili vzorci 14. dne primerljivi s skupinami samih odzivnih celic, z le nekoliko višjim številom točk IFN, kar kaže na pomanjkanje aktivacije celic T (slika 4A, B).

Slika 3. Kvantifikacija infiltracije imunskih celic po presaditvi gmRPC. Infiltrirane imunske celice so bile vizualizirane kot rdeči fluorescenčni signali v slikovnem polju po injiciranju gmRPC za vsak poskusni pogoj, preštete z uporabo ImageJ in narisane v stolpčnih grafih. Podatki iz Iba-1 (označevalec aktiviranih makrofagov in mikroglije) (A), anti-Ly-6G (označevalec nevtrofilcev) (B), anti-CD49b (označevalec naravnih celic ubijalk) (C), protitelesa anti-CD3 (marker celic T) (D) in anti CD45R (marker celic B) (E) sta bila prikazana na sliki. Dvosmerni testi ANOVA so bili uporabljeni za testiranje pomembnosti med skupinami navideznih/celic in celic/celic; vrednosti p so bile: (A) p < {{10}}.4492, (B) p < 0.9376, (C) p < 0.119{{18 }}, (D) p < 0,6411 in (E) p < 0,7201 (nobena ni bila pomembna).

Pri testiranju alogenskih donorskih celic s tem testom odzivne celice živali, ki so jim bile intraperitonealno injicirane gmRPC (skupina IP), niso imele odzivov na odpoklic antigena, saj vzorci niso pokazali večje aktivacije celic T s številom točk IFN v primerjavi z lažnimi živalmi, ki niso bile nikoli izpostavljene. na gmRPC (navidezno/navidezno). Prav tako živali, ki so jim intravitrealno injicirali gmRPC, niti enkrat (navidezno/celica) niti večkrat (celica/celica), niso pokazale nobenih odzivov na odpoklic antigena. V enem primeru so bili odzivi na ponavljajoče se odmerjanje gmRPC bolj prigušeni (slika 4B). Ti rezultati skupaj kažejo, da imajo gmRPC zelo nizko antigenost. Upoštevajte, da so bili splenociti C57BL/6 usklajeni z genetskim ozadjem gmRPC. Nepričakovano so alternativne stimulatorske celice, gmRPC, povečale število točk IFN v vseh poskusnih skupinah v primerjavi z negativnimi kontrolnimi skupinami (slika 4A–D). Potencialna razlaga so lahko gmRPC, ki povzročajo visoko ozadje v tem testu. Pomembno je, da ni bilo nobene razlike med nezdravljenimi, lažno zdravljenimi skupinami z enkratno injekcijo gmRPC in skupinami s ponavljajočimi se injekcijami gmRPC, kar je ponovno pokazalo odsotnost odzivov na odpoklic antigena.

Slika 4. Kvantifikacija ELISPOT po presaditvi gmRPC. Testi ELISPOT so bili določeni kot naslednje skupine: kontrola, samo odzivne celice (limfociti ali splenociti, ki vsebujejo celice T, izolirane iz vratnih bezgavk (CLN) ali vranice (SPL) poskusnih živali; PMA, odzivne celice, zdravljene s forbolom {{1} }miristat 13-acetat (PMA) in Ca ionofor; B6 SPL, odzivne celice, pomešane s splenociti, izoliranimi iz živali C57BL/6; gmRPC, iste odzivne celice, pomešane z gmRPC. (A), odzivne celice so bile splenociti iz poskusnih živali, ki so bile žrtvovane 14. dan po drugi injekciji gmRPC. (B) Odzivne celice so bile limfociti iz CLN poskusnih živali, ki so bile žrtvovane 14. dan po drugi injekciji gmRPC. (C) Odzivne celice so bili splenociti poskusnih živali, ki so bili žrtvovani 29. dan po drugi injekciji gmRPC. (D) Odzivne celice so bili limfociti iz CLN poskusnih živali, ki so bili žrtvovani 29. dan po drugi injekciji gmRPC. Dvosmerni testi ANOVA so bili uporabljeni za testiranje pomembnosti (*) med skupinami navideznih/celic in celic/celic; vrednosti p so bile: (A) p < 0.5332, (B) p < 0.0001 (pomembno), (C) p < 0,0207 ( pomembno) in (D) p < 0,3355.

3. Razprava 

Obstaja veliko zanimanje za tehnologijo matičnih celic kot sredstvo za zdravljenje degenerativnih bolezni mrežnice in naša skupina je raziskovala uporabo alogenskih hRPC v RP. Da bi zbrali podatke o morebitnih imunskih posledicah, ko se z intravitrealno injekcijo daje več kot en odmerek alogenskega produkta humanega RPC, smo izvedli to študijo na živalih z uporabo gmRPC iz ozadja C57BL/6 kot presadkov in miši BALB/c kot gostiteljev. Ta različna genetska ozadja so bila uporabljena za modeliranje zaporednega zdravljenja z alogenskimi hRPC in zagotavljanje predhodnih podatkov o varnosti pred testiranjem pri ljudeh.

Za popolno oceno odzivov živali gostiteljice niso prejele nobenega imunosupresivnega zdravljenja. Primerjali smo imunske odzive, ki jih ustvari ena sama injekcija gmRPC, z zaporednim dvostranskim odmerjanjem v skladu z opisanim urnikom injiciranja. Oftalmološki pregledi niso odkrili vnetja ali kakršnih koli drugih opaznih razlik med skupinami živali, ki so prejele 1 odmerek gmRPC ali 2 odmerka gmRPC, kar kaže na to, da prejemniki niso bili senzibilizirani z začetnimi zdravljenji z gmRPC ali pa je bila preobčutljivost subtilna. Rezultati imunskega označevanja so pokazali, da je vseh pet pregledanih tipov imunskih celic, in sicer celice T (CD3), celice B (CD45R), makrofagi (Iba-1), nevtrofilci (Ly-6G) in naravne celice ubijalke ( CD49b), se je infiltriral v oko in ciljal na presadke RPC po presaditvi. Kljub temu je bila ta infiltracija razmeroma zmerna in čeprav je bilo mogoče zaznati druge vrste celic, je bila pretežno sestavljena iz Iba-1 pozitivnih makrofagov. Prisotnih je bilo zelo omejeno število celic T, celic B, nevtrofilcev in naravnih celic ubijalk. Zanimivo je, da je bilo preživetje, dokazano z enojnimi in ponavljajočimi se presadki RPC, enakovredno, brez izgube presadkov v obeh primerih, kljub prisotnosti makrofagov. Na splošno to nakazuje, da sta bila tako prirojeni kot adaptivni imunski odziv na genetsko različne RPC zmerna, čeprav imunska supresija ni bila uporabljena. Poleg tega rezultati testa ELISPOT niso pokazali odzivov na odpoklic antigena v skupinah, zdravljenih z gmRPC, kar je skladno s trditvijo, da celice T ne igrajo pomembne vloge pri zavrnitvi presadkov gmRPC iz miši C57BL/6. Spet so opazili infiltracijo makrofagov v presadke gmRPC, čeprav to ni bilo povezano s pomembnim uničenjem presadka, kot je povezano s klasično imunsko zavrnitvijo [22–24].

koristi cistanche za moške - krepitev imunskega sistema

Ta opažanja skupaj razkrivajo situacijo, ki se jasno razlikuje od splošno priznanih mehanizmov alogenske zavrnitve presadka, posredovanih s celicami T in B, ki jih vidimo v drugih tkivih. K tej situaciji lahko prispeva več dejavnikov. Na eni strani obstaja predstava o očesu kot o "imunsko privilegiranem" mestu, čeprav je obseg, do katerega si steklovina deli takšne značilnosti z roženico in mrežnico, manj raziskan in morda bolj sporen. Po drugi strani pa se zdi, da sami RPC kažejo zmanjšano imunogenost kot alografti v primerjavi s pogosteje raziskanimi tipi celic. Kot smo že pokazali, mišji RPC-ji nimajo izhodiščne ekspresije antigenov MHC razreda I in razreda II, čeprav jih je mogoče inducirati s stimulacijo s citokini. Ta odsotnost izražanja MHC lahko prispeva k preživetju teh celic po presaditvi. Kljub temu prisotnost imunskih celic v presadkih podpira koncept, da toleranca presadka v tem okolju ni pasivna in je posledica aktivnega imunoregulacijskega pojava. Pri tem je treba poudariti, da je bila ista vrsta infiltracije imunskih celic prisotna že po posameznih injekcijah in je ni poslabšalo ponavljajoče se odmerjanje, kar potrjuje naš zaključek, da infiltracija imunskih celic v presadke, zlasti z makrofagi, ni bila posledica predhodnega preobčutljivost gostitelja. Znotraj parametrov tega poskusa se zdi, da ponavljajoče se odmerjanje ni zmanjšalo splošne sposobnosti preživetja presadka, kar je bilo skladno z možnostjo trajne učinkovitosti v terapevtskih kontekstih. Nadomestni parametri, kot so različni intervali med injiciranjem, lahko povečajo ali zmanjšajo aktivnost imunskih celic do obsega, ki bi bil pomemben za klinično uporabo. Ni jasno, ali bi celične sestavine infiltratov, vključno s prevlado makrofagov, veljale tudi za ljudi. Poleg tega preživetje teh alograftov morda ni odvisno od normalne mrežnice z zdravo krvno-mrežnično pregrado. Tu uporabljeni prejemniki BALB/c so albini in dovzetni za svetlobne poškodbe [30]. Poleg tega je bilo trajno preživetje večkrat opaženo v prejšnjem delu z različnimi modeli degeneracije mrežnice (npr. [31]).

V primerjavi s preživetjem presadka je sposobnost preživetja celic znotraj presadkov bolj zapletena situacija. Znana je izguba matičnih celic osrednjega živčevja, do katere pride hitro po presaditvi, verjetno zaradi številnih dejavnikov, ki lahko vključujejo nenaden odvzem rastnega faktorja. Ko se disociirane celice enkrat naselijo v očesu, se združijo v kroglaste agregate, katerih centri se zdi, da zagotavljajo neoptimalno mikrookolje za rast, morda zaradi pomanjkanja vaskularizacije in izzivov za difuzijo hranil. Navidezni tropizem makrofagov za presadke RPC bi lahko bil nespecifičen odziv na prisotnost teh neživih celic v notranjosti presadkov, pri čemer makrofagi delujejo kot čistilci celičnih ostankov. Druga možnost je, da popolnoma sposobni RPC-ji aktivno pritegnejo makrofage, npr. preko izražanja kemo-privlačnih citokinov, nakar bi gostiteljske celice sekundarno naletele na ostanke neživih donorskih celic. Pomembno je, da se zdi, da stopnja infiltracije makrofagov, opažena v teh posebnih nastavitvah, nima negativnih posledic za presadek ali gostiteljsko mrežnico, v nasprotju z odzivi na celične alogenske presadke na neimunskih privilegiranih mestih [4]. Nazadnje je treba omeniti, da lahko tukaj navedeni rezultati, čeprav so omejeni na mišji model, vplivajo na delo pri ljudeh. V nasprotju z miško vemo, da gojeni človeški RPC izražajo močne ravni antigenov MHC razreda I na začetku; zato je primerjava resda okvirna. Kljub temu je zanimivo omeniti, da je klinično testiranje subretinalnih presadkov hRPC, ki ga je izvedla skupina na Kitajskem [13], kot tudi intravitrealna presaditev hRPC, ki jo je opravila naša skupina, pozneje pokazalo trajno preživetje alogenskih presadkov pri bolnikih brez imunosupresije z RP (JC -01, [32], neobjavljeni podatki). Tako je bilo tudi po zaporedni injekciji obeh očes (podaljšek JC-01, neobjavljeni podatki), analogno delu, predstavljenemu tukaj. Poleg tega so preživetje presadka opazili v nadaljnji študiji o JC-02 [33], v kateri so zaporedne ponavljajoče se odmerke dajali istemu očesu [34]. Te ugotovitve skupaj kažejo, da imunska supresija ni vedno potrebna pri presaditvi nevralnih prednikov, zlasti v očesu, čeprav je treba omejitve tega pojava in temeljne regulativne mehanizme še pojasniti.

4. Materiali in metode

4.1. Celična kultura

Prej opisani gmRPC [31] so bili izbrani kot donorske celice za to alogensko študijo. Prvotno so bili gmRPC izolirani iz GFP-transgenih miši C57BL/6, gensko spremenjenih za izražanje izboljšanega zelenega fluorescenčnega proteina (GFP). Ekspresija proteina GFP v gmRPC je bila zanimiva, ker omogoča vizualizacijo presadkov po injiciranju brez potrebe po dodatnem označevanju. Za trenutno študijo so gmRPC gojili v Advanced DMEM/F12, dopolnjenem z dodatkom N-2 (1:100, Life Technology, Carlsbad, CA, ZDA), Glutamax-1 (1:100, Life Technology , Carlsbad, CA, ZDA) in EGF (20 ng/mL, rekombinantni, Human, Life Technologies, Carlsbad, CA, ZDA) in inkubirali pri 37 ◦C in 5 % CO2. Celice smo vzdrževali v mešani suspenziji/rahlo pritrjenih kolonijah v neprevlečenih bučkah s tkivno kulturo. Celice smo pasirali s tripsinizacijo s TrypLE Select CTS (Life Technologies, Carlsbad, CA, ZDA), razredčenim 1:5 v PBS za eno minuto in nevtralizirali z 10-kratnim volumnom dodanega tripsina. Mešanico celic in tripsina smo centrifugirali pri 140 g 2 minuti pri sobni temperaturi, odstranili supernatant in celične pelete resuspendirali v svežem mediju pred zasejanjem v bučke za tkivne kulture pri želeni koncentraciji. Koncentracijo in sposobnost preživetja celic smo določili z barvanjem s tripan modrim; štetja sta opravila Countess (Life Technologies, Carlsbad, CA, ZDA) in hemocitometer.

Za intravitrealne injekcije smo celično peleto resuspendirali pri 50 K celic/µL v BSS PLUS®. Koncentracijo in sposobnost preživetja celic so ocenili pred in po injekcijah. Vbrizgani odmerek je bil 50 000 celic na oko na injekcijo. Odmerek in nosilec sta bila izbrana na podlagi naših prejšnjih študij.

4.2. Poskusne živali

Namen trenutne študije je bil raziskati potencialne alogenske imunske odzive, povzročene s ponavljajočo intravitrealno injekcijo alogenskih RPC. Prejemne živali so bile miši BALB/c, ki se genetsko razlikujejo od miši C57BL/6, iz katerih so bili izolirani gmRPC. Šteje se, da je uporaba najmanj treh živali na tretirano poskusno skupino za vsako časovno točko potrebna, da se omogoči ocena statistične pomembnosti med skupinami glede spremenljivk izida in možnih izgub živali v poskusnem obdobju. Nadalje, glede na številne dodatne dejavnike, ki bi lahko vplivali na izid eksperimenta, kot je neuspešen postopek vbrizgavanja celic ali morebitno izčrpanost zaradi bojev z živalmi, so bili postopki vbrizgavanja izvedeni na petih živalih na skupino, da bi dodatno zagotovili izpolnjevanje minimalnega števila, potrebnega za statistično analizo.

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

Tabela 1 prikazuje štiri skupine živali, pripravljene za vsako od štirih časovnih točk (4, 7, 14 in 28 dni), na katerih bi se izvajale ocene histopatologije, vključno z imunofluorescenco. Dve dodatni skupini živali, ki sta jim intraperitonealno injicirali 10ˆ6 gmRPC, sta bili pripravljeni kot pozitivni kontroli za vsako od dveh časovnih točk vrednotenja ELISPOT (14 in 28 dni). Tabela 2 povzema ocene, predvidene za vsako skupino.

Tabela 1. Eksperimentalne skupine.

Tabela 2. Časovne točke ocenjevanja.

4.3. Intravitrealna injekcija

GmRPC so dajali z intravitrealno injekcijo. Po anesteziji sta bila Mydriacyl (1 % očesna raztopina Tropikamida) in Phenylephrine (2,5 % oftalmološka raztopina) nanesena na obe očesi živali, ki jo je treba injicirati. Ko je bila dosežena ustrezna midriaza, so žival ročno zadržali in glavo živali zavrteli, da bi poravnali očesno os očesa, ki ga je treba injicirati, z optiko kirurškega mikroskopa, da bi vizualizirali posteriorni segment očesa (tj. steklovino in mrežnico). . Oko je bilo nežno ročno predlagano s pritiskom na veke in uporabljena je bila igla 31G na insulinski brizgi za nežno prebadanje beločnice, ki meji na limbus v spodnjem nosnem kvadrantu. Polirana steklena konica mikropipete, ki je vsebovala donorske celice (ali kontrolo nosilca), je bila pomaknjena skozi rez v votlino steklastega telesa pod neposredno vizualizacijo. Pazili smo, da ne porušimo celovitosti leče ali struktur zadnjega segmenta. Same celice ali nosilce smo vbrizgali v prostornini 1 mikrolitra. Po nekaj trenutkih premora, da se omogoči uravnoteženje intraokularnega tlaka, je bila konica pipete postopoma odstranjena iz očesa, vse pod neposredno vizualizacijo. Opažena je bila kakršna koli intraokularna krvavitev skupaj z lokacijo. Po injiciranju je bila žival postavljena v čisto kletko, obloženo s svežo blazinico za enkratno uporabo, usmerjeno z vpojno stranjo navzgor/plastično stranjo navzdol, da si opomore. Okrevanje je bilo olajšano z uporabo grelne blazine in preverjeno s sposobnostjo živali za premikanje. Po prebujanju je bila žival premeščena v pooperativno kletko z ad libitum dostopom do vode. Živali smo vizualno spremljali dnevno po operaciji. Opazili so minimalne ali nobenih znakov, povezanih z intraokularno injekcijo.

Po posegu so pri živalih opazovali drgnjenje operiranega očesa, nabrano dlako ali dolgotrajno letargijo, vse to pa je bilo razlog za takojšnjo evtanazijo. Dve živali sta bili usmrteni zaradi ran, zadobljenih v boju. Vse druge živali so bile uničene na načrtovanih končnih točkah. Evtanazija je bila izvedena z vdihavanjem CO2.

4.4. Oftalmološki pregled

A Leica Ultimate Red Reflex Surgical Microscope was used for ophthalmic examination and photography of experimental mice. Sedation was performed with a Ketamine Hydrochloride/Xylazine Hydrochloride mixture (50–100 mg/mL Ketamine, 5–10 mg/mL Xylazine) administered by intraperitoneal injection. After sedation, topical mydriatics (Tropicamide, Phenylephrine) were applied to the eye(s) to be imaged in 5 min intervals until adequate mydriasis was achieved, as determined via pupil diameter (>2,5 mm) in odziv na svetlobno stimulacijo. Kot nadomestilo za izgubo mežikanja smo raztopino hipromeloze (Gonak) lokalno nanesli na obe očesi, da bi preprečili izsušitev roženice. Za postopek slikanja so bile anestezirane živali položene na grelno blazino in ležeče na prsnici. Ob koncu postopka je bila dosežena delna razveljavitev anestezije z intraperitonealno injekcijo atipamezola (0.1–1 mg/kg).

4.5. Histopatologija

Imunski odziv pri živalih, ki so prejele dva zaporedna presadka (enega v vsako oko), so ovrednotili s histopatologijo obeh očes 4. dan, 7. dan, 14. dan in 28. dan ± 1 po injiciranju drugega očesa. Miši, ki so bile zdravljene v skladu s tabelo 1, so bile uničene na podlagi navedenega urnika v tabeli 2. Živali so bile evtanazirane z vdihavanjem ogljikovega dioksida. Na poskusnih živalih smo izvajali srčne perfuzije z 2% paraformaldehidom (PFA) v fiziološki raztopini s fosfatnim pufrom (PBS). Nato so zbrali vsa zrkla in jih pustili namakati v 2% PFA/PBS 48 ur pri 4 °C. Fiksna zrkla so bila obdelana s saharoznim gradientom (10 % saharoze v PBS 1 uro pri sobni temperaturi, 20 % saharoze v PBS 1 uro pri sobni temperaturi in 30 % saharoze v PBS pri 4 °C čez noč), preden so bila vdelana v OCT mediji za kriosekcije. Kriosekcije (10 µm) oči so bile obarvane s Harrisonovim hematoksilinom in eozinom (H&E), da bi vizualizirali mikroanatomijo mrežnice in locirali vbrizgane celice darovalca.

Za skupine, zdravljene z gmRPC, so bile kriosekcije ovrednotene z uporabo imunofluorescence za celice GFP+ (donor). Identifikacija specifičnih tipov imunskih celic, prisotnih v očeh, je bila izvedena z označevanjem s specifičnimi primarnimi protitelesi za naslednje: CD3 (marker limfocitov T) [35], CD45R (marker limfocitov B) [36], Iba-1 (marker aktiviranih makrofagov in mikroglije) [37], Ly-6G (marker nevtrofilcev) [38] in CD49b (marker naravnih celic ubijalk) [39]. Kriosekcije so bile trikrat sprane v PBS pri sobni temperaturi in blokirane z 0.03% Triton X-100 in 10% normalnim kozjim serumom v PBS (NGS; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, ZDA) za 1 h pri sobni temperaturi. Podganji protimišji CD3 (razredčitev 1:100, BD Biosciences, San Jose, CA, ZDA), podganji protimišji CD45R (1:100, BD Biosciences, San Jose, CA, ZDA), zajčji protimišji Iba{{ 26}} (razredčitev 1:400, Wako Chemicals, Richmond, VA, ZDA), podganji protimišji Ly-6G (razredčitev 1:100, BD Biosciences, San Jose, CA, ZDA) in podganji proti -mišji CD49b (razredčitev 1:100, BD Biosciences, San Jose, CA, ZDA) smo nanesli na vzorce in jih inkubirali čez noč pri 4 stopinjah. Vzorce smo ponovno sprali v PBS 3-krat pri sobni temperaturi. Sekundarna protitelesa, konjugirana z Alexa-Fluor (kozja protipodganja Alexa-Flour-568 in kozja anti-kunčja Alexa-Flour-568, Life Technologies, Carlsbad, CA, ZDA) so bila nanesena na vzorce za 1 uro pri sobni temperaturi. Vse vzorce smo nato še trikrat sprali v PBS pri sobni temperaturi. Pokrovnice so bile nameščene z uporabo DAPI Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL, ZDA), stekelca pa so se sušila čez noč pri sobni temperaturi.

4.6. ELISPOT in MLR testi

RPC-specifične spominske celice T so spremljali 2 in 4 tedne po prvi namestitvi presadka z encimsko vezanim imunosorbentnim testom (ELISPOT). Eksperimentalne skupine so bile sestavljene, kot je prikazano v tabelah 1 in 2 za vsako časovno točko. Test ELISPOT zajame izločene beljakovine na mikroploščo, obloženo s specifičnimi protitelesi, in ga je mogoče uporabiti za določanje aktivacije T-celic spomina z odkrivanjem izločanja IFN v T-celicah. Eksperimentalni odčitek je število točk IFN na mikroplošči. Število prisotnih točk IFN kaže na število aktiviranih celic T. Pogostnost aloreaktivnih celic T so ocenili z izvedbo 48-urne reakcije mešanih levkocitov (MLR) na ploščah z 96-vdolbinicami Multiscreen-IP (Millipore, Burlington, MA, ZDA). Odzivne celice so bili limfociti/splenociti, ki so vsebovali celice T, očiščene iz vratnih bezgavk (CLN) in vranice poskusnih živali, stimulatorske celice pa so bile gmRPC, prvotno pridobljene iz miši C57BL/6. Testi ELISPOT so bili izvedeni na podlagi standardnega protokola. 96-Multiscreen-IP plošče z vdolbinicami so bile predhodno navlažene s 15 µL 35 % etanola na vdolbinico pod sterilnimi pogoji. Plošče smo trikrat sprali s sterilnim PBS, preden smo na plošče nanesli 100 µL protitelesa za zajemanje IFN (klon AN-18, eBioscience, San Diego, CA, ZDA), razredčenega v PBS (2 µg/mL). Plošče smo inkubirali čez noč pri 4 stopinjah, preden smo na ploščah izvedli teste MLR. Plošče, prevlečene z zajemnimi protitelesi, smo trikrat sprali s PBS in nato blokirali z RPMI1640 2 uri pri 37 °C.

Vsaka od preskusnih plošč je vključevala naslednje kontrole: vdolbinice brez celic, vdolbinice s celicami brez stimulacije in vdolbinice s celicami, obdelanimi s forbol {{0}}miristat 13-acetatom (PMA) in Ca ionofor kot pozitivne kontrole. Zdravljenje s PMA služi kot pozitivna kontrola s posnemanjem drugega prenašalca sporočil, DAG, za aktiviranje poti T-celičnega receptorja in posledično povzroči aktivacijo T-celic, pri čemer ionofor Ca olajša vstop kalcijevih ionov v celice. Plošče smo pred barvno reakcijo inkubirali 36 ur pri 37 ◦C. Plošče smo sprali s PBS, ki je vseboval {{10}}.01 % Tween 20 šestkrat in nato 100 µL detekcijskih protiteles (klon R64A2, eBioscience, San Diego, CA, ZDA), razredčenih v PBS (0,5 µg/mL) smo nanesli v vsako vdolbinico. Plošče smo inkubirali pri 37 ◦C dodatni 2 uri. Plošče smo ponovno sprali z 0,01 % Tween 20 v PBS. Na vdolbinico smo nanesli 100 µL Streptavidin-AP (razredčitev 1:1000, Invitrogen) in plošče inkubirali 45 minut pri sobni temperaturi. Vse plošče smo ponovno trikrat sprali z 0,01 % Tween 20 v PBS in samo s PBS še trikrat. Nazadnje smo v vsako vdolbinico dodali 100 µL BCIP/NBT (Sigma Aldrich, München, Nemčija) za obarvanje. Vse plošče so bile temeljito oprane z vodo iz pipe in posušene pred analizo podatkov.

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

5. Sklepi

Ta študija kaže, da sekvenčni binokularni presadki alogenskih RPC v steklovino votlino ne izzovejo klasične imunske zavrnitve pri miših. Čeprav je priznano, da teh alogenskih histoloških študij ni bilo mogoče izvesti s človeškim kliničnim izdelkom RPC, se podatki zdijo skladni z rezultati klinične varnostne študije (jCyte, JC-01E, neobjavljeni podatki), v kateri so bolniki z retinitisom pigmentosa prejela nesočasne dvostranske injekcije brez imunosupresivnega zdravljenja. Čeprav je težko neposredno primerjati obe študiji, je treba omeniti, da so skupni rezultati obeh pokazali podobnost v smislu preživetja alogenskega presadka.

Reference

1. Hori, J.; Ng, TF; Šatoš, M.; Klassen, H.; Streilein, JW; Young, MJ Neural progenitor celice nimajo imunogenosti in se upirajo uničenju kot alografti. Matične celice 2003, 21, 405–416. [CrossRef] [PubMed]

2. Klassen, H.; Schwartz, PH; Ziaeian, B.; Nethercott, H.; Young, MJ; Bragadottir, R.; Tullis, GE; Warfvinge, K.; Narfstrom, K. Živčni prekurzorji, izolirani iz razvijajočih se mačjih možganov, kažejo integracijo mrežnice po presaditvi na mrežnico distrofične mačke. vet. Ophthalmol. 2007, 10, 245–253. [CrossRef] [PubMed]

3. Salado-Manzano, C.; Perpina, U.; Straccia, M.; Molina-Ruiz, FJ; Cozzi, E.; Rosser, AE; Canals, JM Ali je imunološki odziv ozko grlo za celično terapijo pri nevrodegenerativnih boleznih? Spredaj. Cell Neurosci. 2020, 14, 250. [CrossRef]

4. Petrus-Reurer, S.; Romano, M.; Howlett, S.; Jones, JL; Lombardi, G.; Saeb-Parsy, K. Imunološki vidiki in izzivi za regenerativne celične terapije. Komun. Biol. 2021, 4, 798. [CrossRef]

5. Bucher, K.; Rodriguez-Bocanegra, E.; Dauletbekov, D.; Fischer, MD Imunski odzivi na retinalno gensko terapijo z uporabo brez povezanih virusnih vektorjev - Posledice za uspeh in varnost zdravljenja. Prog. Retin. Eye Res. 2021, 83, 100915. [CrossRef]

6. Singh, MS; Park, SS; Albini, TA; Canto-Soler, MV; Klassen, H.; MacLaren, RE; Takahashi, M.; Nagiel, A.; Schwartz, SD; Bharti, K. Presaditev matičnih celic mrežnice: Uravnoteženje varnosti in potenciala. Prog. Retin. Eye Res. 2020, 75, 100779. [CrossRef]

7. Kamao, H.; Mandai, M.; Okamoto, S.; Sakai, N.; Suga, A.; Sugita, S.; Kiryu, J.; Takahashi, M. Karakterizacija človeško induciranih pluripotentnih matičnih celic, pridobljenih iz retinalnih pigmentnih epitelijskih celic, katerih cilj je klinična uporaba. Matične celice Rep. 2014, 2, 205–218. [CrossRef]

8. Sugita, S.; Kamao, H.; Iwasaki, Y.; Okamoto, S.; Hashiguchi, T.; Iseki, K.; Hayashi, N.; Mandai, M.; Takahashi, M. Inhibicija aktivacije T-celic s celicami pigmentnega epitelija mrežnice, pridobljenimi iz induciranih pluripotentnih matičnih celic. Raziskati. Ophthalmol. Vis. Sci. 2015, 56, 1051–1062. [CrossRef]

9. McGill, TJ; Stoddard, J.; Renner, LM; Messaoudi, I.; Bharti, K.; Mitalipov, S.; Lauer, A.; Wilson, DJ; Neuringer, M. Alogenska okvara celičnega presadka RPE, pridobljena iz iPSC, po presaditvi v subretinalni prostor pri primatih razen človeka. Raziskati. Ophthalmol. Vis. Sci. 2018, 59, 1374–1383. [CrossRef]

10. Sugita, S.; Mandai, M.; Kamao, H.; Takahashi, M. Imunološki vidiki presaditve celic RPE. Prog. Retin. Eye Res. 2021, 84, 100950. [CrossRef]

11. Nair, DSR; Thomas, BB Strategije zdravljenja degenerativnih bolezni mrežnice na osnovi izvornih celic. Curr. Matične celice Res. Ther. 2022, 17, 214–225. [CrossRef] [PubMed]

12. Martinez Velazquez, LA; Ballios, BG Naslednja generacija molekularnih in celičnih terapevtikov za podedovane bolezni mrežnice. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 11542. [CrossRef]

13. Liu, Y.; Chen, SJ; Li, SY; Qu, LH; Meng, XH; Wang, Y.; Xu, HW; Liang, ZQ; Yin, ZQ Dolgoročna varnost presaditve matičnih celic človeške mrežnice pri bolnikih s pigmentozo retinitisa. Matične celice Res. Ther. 2017, 8, 209. [CrossRef] [PubMed]

14. Wang, Y.; Tang, Z.; Gu, P. Presaditev na osnovi matičnih / matičnih celic za degeneracijo mrežnice: pregled kliničnih preskušanj. Cell Death Dis. 2020, 11, 793. [CrossRef] [PubMed]

15. nemščina, OL; Vallese-Maurizi, H.; Soto, TB; Rotstein, NP; Politi, LE Matične celice mrežnice, upi in ovire. World J. Matične celice 2021, 13, 1446–1479. [CrossRef]

16. Karamali, F.; Behtaj, S.; Babaei-Abraki, S.; Hadady, H.; Atefi, A.; Savoj, S.; Soroushzadeh, S.; Najafian, S.; Nasr Esfahani, MH; Klassen, H. Potencialne terapevtske strategije za degeneracijo fotoreceptorjev: pot do obnovitve vida. J. Transl. med. 2022, 20, 572. [CrossRef]

17. Semo, M.; Haamedi, N.; Stevanato, L.; Carter, D.; Brooke, G.; Young, M.; Coffey, P.; Sinden, J.; Patel, S.; Vugler, A. Učinkovitost in varnost matičnih celic človeške mrežnice. prevod Vis. Sci. Technol. 2016, 5, 6. [CrossRef]

18. Mochizuki, M.; Sugita, S.; Kamoi, K. Imunološka homeostaza očesa. Prog. Retin. Eye Res. 2013, 33, 10–27. [CrossRef]

19. Yamasaki, S.; Sugita, S.; Horiuchi, M.; Masuda, T.; Fujii, S.; Makabe, K.; Kawasaki, A.; Hayashi, T.; Kuwahara, A.; Kishino, A.; et al. Nizka imunogenost in imunosupresivne lastnosti človeških mrežnic, pridobljenih iz ESC in iPSC. Matične celice Rep. 2021, 16, 851–867. [CrossRef]

20. Klassen, H.; Schwartz, MR; Bailey, AH; Young, MJ Površinski markerji, izraženi z multipotentnimi človeškimi in mišjimi nevralnimi matičnimi celicami, vključujejo tetraspanine in neproteinske epitope. Neurosci. Lett. 2001, 312, 180–182. [CrossRef]

21. Klassen, H.; Ziaeian, B.; Kirov, II.; Young, MJ; Schwartz, PH Izolacija matičnih celic mrežnice iz posmrtnega človeškega tkiva in primerjava z avtolognimi možganskimi matičnimi celicami. J. Neurosci. Res. 2004, 77, 334–343. [CrossRef]

22. Ingulli, E. Mehanizem celične zavrnitve pri presaditvi. Pediatr. Nefrol. 2010, 25, 61–74. [CrossRef]

23. Issa, F.; Schiopu, A.; Wood, KJ Vloga celic T pri zavrnitvi presadka in toleranci presaditve. Strokovnjak Rev. Clin. Immunol. 2010, 6, 155–169. [CrossRef] [PubMed]

24. Nasr, M.; Sigdel, T.; Sarwal, M. Napredek pri diagnostiki zavrnitve presadka. Strokovnjak Rev. Mol. Diagn. 2016, 16, 1121–1132. [CrossRef] [PubMed]

25. Klassen, H.; Imfeld, KL; Ray, J.; Young, MJ; Gage, FH; Berman, MA Imunološke lastnosti odraslih hipokampalnih matičnih celic. Vis. Res. 2003, 43, 947–956. [CrossRef] [PubMed]

26. Weinger, JG; Weist, BM; Plaisted, WC; Klaus, SM; Walsh, CM; Lane, neusklajenost TE MHC povzroči zavrnitev nevralnih matičnih celic po presaditvi hrbtenjače v modelu virusno povzročene demielinizacije. Matične celice 2012, 30, 2584–2595. [CrossRef] [PubMed]

27. ReNeuron, L. Prva pri človeku faza I/IIa, odprta, prospektivna študija varnosti in prenašanja subretinalno presajenih matičnih celic človeške mrežnice (hRPC) pri bolnikih s pigmentnim retinitisom (RP). Klinično preskušanje št. NCT02464436. Dostopno na spletu: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02464436 (dostopano 27. februarja 2023).

28. Lu, B.; Lin, Y.; Tsai, Y.; Girman, S.; Adamus, G.; Jones, MK; Shelley, B.; Svendsen, CN; Wang, S. Naknadna presaditev človeškega nevronskega prednika v degenerirano mrežnico ne ogrozi začetnega preživetja presadka ali terapevtske učinkovitosti. prevod Vis. Sci. Technol. 2015, 4, 7. [CrossRef] [PubMed]

29. Jones, MK; Lu, B.; Girman, S.; Wang, S. Celične terapevtske strategije za zamenjavo in ohranitev pri degenerativnih boleznih mrežnice. Prog. Retin. Eye Res. 2017, 58, 1–27. [CrossRef] [PubMed]

30. Bell, BA; Kaul, C.; Bonilha, VL; Rayborn, ME; Shadrach, K.; Hollyfield, JG Miška BALB/c: Učinek standardne osvetlitve vivarija na patologijo mrežnice med staranjem. Exp. Eye Res. 2015, 135, 192–205. [CrossRef]

31. Klassen, HJ; Ng, TF; Kurimoto, Y.; Kirov, I.; Šatoš, M.; Coffey, P.; Young, MJ Multipotentni retinalni progenitorji izražajo razvojne markerje, se diferencirajo v mrežnične nevrone in ohranjajo svetlobno posredovano vedenje. Raziskati. Ophthalmol. Vis. Sci. 2004, 45, 4167–4173. [CrossRef]

32. jCyte, Inc. Varnost ene intravitrealne injekcije matičnih celic človeške mrežnice (jCell) pri pigmentnem retinitisu. Klinično preskušanje št. NCT02320812. Dostopno na spletu: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02320812 (dostopano 24. februarja 2023).

33. jCyte, Inc. Varnost in učinkovitost intravitrealne injekcije matičnih celic človeške mrežnice pri odraslih s pigmentnim retinitisom. Klinično preskušanje # NCT03073733. Dostopno na spletu: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03073733 (dostopano 24. februarja 2023).

34. jCyte, Inc. Varnost ponavljajočih se intravitrealnih injekcij človeških matičnih celic (celic) mrežnice pri odraslih osebah s pigmentnim retinitisom. Klinično preskušanje # NCT04604899. Dostopno na spletu: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04604899 (dostopano 24. februarja 2023).

35. Oudejans, JJ; van der Valk, P. Imunohistokemična klasifikacija neoplazem T celic in NK celic. J. Clin. Pathol. 2002, 55, 892. [CrossRef] [PubMed]

37. Tostanoski, LH; Chiu, YC; Gammon, JM; Simon, T.; Andorko, JI; Bromberg, JS; Jewell, CM Reprogramiranje lokalnega mikrookolja bezgavk spodbuja toleranco, ki je sistemska in specifična za antigen. Cell Rep. 2016, 16, 2940–2952. [CrossRef] [PubMed]

37. Jurga, AM; Paleczna, M.; Kuter, KZ Pregled splošnih in diskriminatornih označevalcev diferencialnih fenotipov mikroglije. Spredaj. Cell Neurosci. 2020, 14, 198. [CrossRef] [PubMed]

38. Li, JC; Zou, XM; Yang, SF; Jin, JQ; Zhu, L.; Li, CJ; Yang, H.; Zhang, AG; Zhao, TQ; Chen, CY Zunajcelične pasti nevtrofilcev sodelujejo pri razvoju tromboze, povezane z rakom, pri bolnikih z rakom želodca. Svet J. Gastroenterol. 2022, 28, 3132–3149. [CrossRef]

39. Kee, BL Razvoj naravnih celic ubijalk in ILC1. Encikl. Immunobiol. 2016, 1, 140–148.