Izboljšan pomnilnik za prepoznavanje predmetov z uporabo ponavljajoče se transkranialne magnetne stimulacije po kodiranju, 1. del

povzetek

Ozadje: Znano je, da možganska stimulacija vpliva na kanonične poti in proteine, ki sodelujejo pri spominu. Vendar pa obstajajo nasprotujoči si rezultati o sposobnosti možganske stimulacije za izboljšanje spomina, kar je lahko posledica variacij v času stimulacije.

Med stimulacijo možganov in spominom obstaja tesna povezava. Možganska stimulacija lahko spodbuja aktivnost možganskih nevronov in s tem izboljša spomin in kognitivne sposobnosti.

Prvič, možganska stimulacija lahko spodbuja povezavo med nevroni. S stimulacijo možganov bo komunikacija in povezava med nevroni postala pogostejša in učinkovitejša. Te povezave bodo postale bolj stabilne in resnične, zaradi česar bodo možgani bolj prožni, ustvarjalni in premišljeni. Te prednosti vam bodo dale prednost pri učenju in življenju.

Drugič, možganska stimulacija lahko prinese močnejši spomin. Pogosta stimulacija možganov lahko poveča vitalnost in zdravje možganov ter s tem izboljša spomin. Med zdravjem možganov ter spominom in kognitivnimi dejavnostmi obstaja pomembna povezava. Možganska stimulacija bo pomagala možganom, da si opomorejo, rastejo in se popravijo. Na ta način se bomo lažje naučili znanja ali pridobili pomembne informacije iz življenja in jih bomo lahko bolje shranili in priklicali v možgane.

Poleg tega lahko stimulacija možganov spodbuja tudi učenje in uporabo novih informacij. V življenju se nenehno srečujemo z različnimi težavami, s katerimi se ne znamo spoprijeti. S pogostim stimuliranjem možganov lahko hitreje in natančneje razumemo te zapletene informacije, se jim postopoma prilagajamo, iščemo načine, kako jih obdelati in se z njimi bolje spoprijemamo, zaradi česar postanemo bolj priročni pri reševanju stvari.

Skratka, s stimulacijo možganov smo lahko bolj prilagodljivi, ustvarjalni in premišljeni. Tudi s težavami in izzivi v življenju se bomo soočali bolj samozavestno. Možganska stimulacija je dober način za izboljšanje naših kognitivnih sposobnosti, krepitev učenja in izboljšanje spomina. Držimo se svojega načrta vadbe za možgane, ohranimo pozitiven odnos, bodimo pozitivni, si prizadevajmo za boljši osebni razvoj in uresničimo svoje ideale. Vidi se, da moramo izboljšati spomin in Cistanche lahko bistveno izboljša spomin, saj lahko Cistanche uravnava tudi ravnovesje nevrotransmiterjev, kot je povečanje ravni acetilholina in rastnih faktorjev, ki so zelo pomembni za spomin in učenje. Poleg tega lahko Cistanche izboljša pretok krvi in ​​spodbuja dostavo kisika, kar lahko zagotovi, da možgani dobijo dovolj hranil in energije, s čimer se izboljša vitalnost in vzdržljivost možganov.

Kliknite Know za izboljšanje delovnega spomina

Hipoteza: Domnevali smo, da bi ponavljajoča se transkranialna magnetna stimulacija (rTMS), izvedena po učni nalogi in v obdobju pred pridobitvijo, lahko pomagala izboljšati spomin. Metode: Mišijim samcem B6129SF2/J (n=32) smo vsadili kranialni nastavek za pritrditev tuljave rTMS da bi miši lahko dosledno stimulirali čelni del, medtem ko bi se prosto gibali.

Miši so bile nato podvržene fazi vzorčenja testa prepoznavanja predmetov in zdravljene þ3, þ24, þ48 ur po testu. Zdravljenje je vključevalo 10-minutno stimulacijo rTMS s frekvenco 10 Hz (TMS, n=10), navidezno zdravljenje (SHAM, n=11) ali kontrolno skupino, ki ni opravila vedenjskega testa ali prejela rTMS (KONTROLA n=11).

Pri þ72 so miši testirali glede njihovega raziskovanja novega v primerjavi z znanim predmetom. Rezultati: Pri 72-h so samo miši, ki so prejele rTMS, bolje raziskovale nov predmet kot znani predmet.

Nadalje smo pokazali, da sta za ta učinek pomembna spodbujanje sinaptičnega GluR2 in vzdrževanje sinaptičnih povezav v peririnalnem korteksu in hipokampalnem CA1.

Poleg tega smo našli dokaze, da so bile te spremembe povezane s potmi CAMKII in CREB v hipokampalnih nevronih.

Zaključek: S povezovanjem znanih bioloških učinkov rTMS s spominskimi potmi zagotavljamo dokaze, da je rTMS učinkovit pri izboljšanju spomina, če ga dajemo v fazah utrjevanja in vzdrževanja.

1. Uvod

Znano je, da neinvazivna možganska stimulacija vpliva na kanonične poti in proteine, ki sodelujejo pri spominu. Vendar so trenutne študije, ki so preučevale učinke možganske stimulacije, zlasti ponavljajoče se transkranialne magnetne stimulacije (rTMS), na spomin, imele nasprotujoče si rezultate [1].

Razlog za to bi lahko bil ciljanje stimulacije ob različnih časih med oblikovanjem in priklicem spomina [1]. Dokazi kažejo, da bi se ciljanje na rTMS v fazah po kodiranju ali konsolidaciji lahko izkazalo za koristno za razvoj stabilnih dolgoročnih spominov [2]e4.

Konsolidacija je faza, ki spremeni kratkoročni spomin v dolgoročni spomin (LTM). Proces je odvisen od časovno specifične sinteze proteinov, ki pretvori nove informacije v stabilne sinaptične modifikacije s povečano gostoto postsinaptičnih receptorjev [5,6].

Pomen te sinteze beljakovin, specifične za čas in regijo, je bil prikazan v študijah, ki blokirajo sintezo beljakovin denovo. Na primer, ena študija, ki je blokirala sintezo beljakovin v hipokampusu 3-h, ne pa 6-h po dogodku učenja, je pri podganah poslabšala LTM, ne pa tudi kratkoročnega spomina[7].

Med temi proteini je bilo ugotovljenih več pomembnih signalnih poti, ki so regulirane navzgor in so pomembne v tem procesu.

V sinapsi obstaja več signalnih poti, ki signalizirajo inervacijo receptorja in stabilnost hrbtenice, potrebno za LTM. Ti se aktivirajo z dolgotrajnim potenciranim dražljajnim dogodkom (LTP) in so pogosto okrepljeni z nevrotrofičnimi dejavniki, kot je možganski nevrotrofični faktor (BDNF) [8].

BDNF je še posebej pomemben pri ustvarjanju dolgoročnih spominov, saj blokiranje sinteze BDNF v določenih časovnih točkah naslednje učenje blokira njegovo konsolidacijo [5].

BDNF se veže na receptorje tirozin kinaze (TrkB) in lahko sproži več signalnih poti, kot so poti protein kinaze, aktivirane z mitogenom/ekstracelularne signalno regulirane kinaze (ERK) ali fosfolipaze Cg. Te signalne poti se združijo pri aktiviranju faktorja regulacije transkripcije CREB (cyclicAMP-responsive element-binding protein).

Proteini, aktivirani s kalcijem, kot je od kalcija/kalmodulina odvisna proteinska kinaza II (CAMKII), prav tako igrajo vlogo pri regulaciji genov, aktiviranih s CREB [9e11], prav tako pa lahko neposredno posredujejo pri sinaptični ekspresiji glutamatergičnih receptorjev AMPA in stabilizirajo sinaptični oder [12e15] .

Te signalne poti skupaj povzročijo ekspresijo in translokacijo receptorja shiftin, ki posreduje pri povečani aktivaciji v sinapsi, s čimer služi za stabilizacijo sinaps in prispeva k vzdrževanju podaljšanega LTP [16]. Pomembno je, da so prejšnje študije pokazale, da je mogoče izboljšati konsolidacijo spomina. s periodično reaktivacijo teh konsolidacijskih poti v eksperimentalnih okoljih [17].

Prejšnje študije so pokazale sposobnost rTMS, da neposredno vpliva na te specifične poti v možganih. Študije in vivo so pokazale, da rTMS poveča raven BDNF v možganih [18e20]. Bolj neposredno, in vitro rTMS povzroči povečan Ca2þ v nevronih, prevladujočo signalno molekulo v poti CAMKII [18]. Povečana fosforilacija CAMKII in CREB je bila prikazana tudi in vitro po rTMS [20,21].

rTMS prav tako neposredno vpliva na ekspresijo sinaptičnih receptorjev, povečuje gostoto receptorjev AMPA [22e24] in uravnava podenote receptorjev AMPA glutamatni receptor 1 (GluR1) in glutamatni receptor 2 (GluR2) [25,26].

Zato asrTMS aktivira te poti, kar bi bilo najučinkovitejše za izboljšanje spomina med fazo konsolidacije. Ta študija je proučila uporabo rTMS za izboljšanje spomina s ciljanjem na stimulacijo faz konsolidacije in vzdrževanja spomina.

Domnevali smo, da bi rTMS, ki se izvaja po učni nalogi in v obdobju pred pridobitvijo, lahko izboljša zmogljivost spomina. To bi bila posledica občasne reaktivacije poti, ki so vključene v spomin, na katere prav tako vpliva rTMS.

Z uporabo živalskega modela specifičnega epizodnega LTM smo pokazali, da rTMS izboljša spomin predmeta, če ga dajemo v 72-h med kodiranjem in pridobitvijo, medtem ko miši, ki so bile zdravljene s SHAM, niso ohranile spomina.

Ta učinek je bil podprt s spremembami sinaptičnih povezav v peririnalnem korteksu in CA1, povečano aktivacijo CREB in CAMKII ter dinamičnim premikom podenot receptorja AMPA v sinapsi.

2. Material in metode

2.1. Živali

Za to študijo smo uporabili n=33 samcev miši B6129SF2/J, starih 2 do 4 mesece. Vse miši so živele v ciklusu 12-h svetlobe/12-h teme s prostim dostopom do suhe krme in vode. Vsa nega živali in postopki so bili v skladu z Zakonom o dobrem počutju živali in so bili v skladu z institucionalnimi smernicami ter odobreni s strani VA Palo Alto odbora za raziskave na živalih.

2.2. Operacija podpore tuljavi

Vsaka od miši je bila podvržena operaciji za pritrditev tuljave, ki je omogočila dosledno rTMS stimulacijo budnih živali. Podrobnosti o kirurškem posegu najdete v Poh et al., 2018 [27].

Na kratko, živali so bile anestezirane s 3% izofluranom in vzdrževane pri 2-3% z nosnim stožcem. Po britju in čiščenju mesta za sterilnost je bil z rezilom skalpela narejen sagitalni rez v dolžini približno 10 mm.

Pokostnico so nežno postrgali in na bregma s cianoakrilatom pritrdili predhodno izdelano spiralno oporo in jo ojačali z zobnim cementom. Rano so nato zašili okoli nosilca tuljave.

2.3. Vedenje in stimulacijski postopki

Za pregled vedenja in postopkov stimulacije glejte sl. 1a. Po petih dneh okrevanja po operaciji podpore s tuljavo so bile miši tri dni navajene na ločeno stimulacijsko kletko in postopke s tuljavo.

Zadnji dan navajanja na tuljavo so bile miši podvržene testu odprtega polja (OFT) za 10-min, ki je služil tudi kot navajanje na test prepoznavanja predmeta (ORT). Naslednji dan so miši izpostavili fazi vzorčenja ORT z dvema istima predmetoma za 10 minut. Predmeti so bili podobne velikosti, vendar različnih barv in oblik. Ti predmeti so bili postavljeni v nasprotnih kotih kvadratne arene za testiranje.

Tri ure pozneje so bile miši naključno razdeljene v dve zdravljeni skupini, TMS, ki je prejela aktivno stimulacijo 10-min 10 Hz rTMS, in SHAM, ki so bile obravnavane enako, le da je bila tuljava med stimulacijo izklopljena.

Miši TMS in SHAM smo ponovno zdravili24- in 48-h po seznanitvi. Zadnji dan (72-h po seznanitvi) so bile miši 10-min izpostavljene testni fazi ORT z enim znanim in enim novim predmetom.

Da bi ugotovili, ali je bilo raziskovanje novega predmeta večje od znanega objekta, smo izračunali indeks diskriminacije (((raziskovanje novega predmeta)-(raziskovanje znanega predmeta))/((raziskovanje novega predmeta)þ(raziskovanje znanega predmeta))). Izbrali smo 72-h, saj so prejšnje študije [28] in pilotni podatki (niso prikazani) pokazali, da pod normalnimi pogoji miši v tem trenutku ne ohranijo pomnilnika ORT.

Vrste predmetov in lokacija novega predmeta so bili med skupinami uravnoteženi. Za navajanje, vzorčenje in sejo s sondo so miši vedno dali 30 minut, da se prilagodijo na poskusno sobo pred poskusi, predmete in areno pa so po vsaki miši očistili s 70 % etanolom.

Da bi raziskali učinke samo vedenjske naloge, smo vključili tudi skupino, ki je bila obravnavana enako kot miši SHAM, le da niso opravile ORT.

Namesto tega so bili izpostavljeni seji vzorčenja in sondiranja, vendar brez predmetov. Ena miška v skupini TMS ni dosegla zahtevanega praga skupnega 20- raziskovanja obeh predmetov v seji vzorčenja in je bila zato izključena iz študije. Ta miška je bila izključena iz kasnejše biokemične analize.

Vse druge miši so dosegle merila v seji vzorčenja in sonde. Brez ene miške so bile končne številke v eksperimentalnih skupinah TMS n=10, SHAM n=11 in CONTROLn=11.

2.4. Western blot

Tri ure po seji s sondo so miši žrtvovali s prevelikim odmerkom ketamina, tkiva hipokampusa in frontalnega korteksa pa hitro razrezali na suh led in shranili pri 80 °C.

Ti vzorci so bili homogenizirani s 300 ml ledeno mrzlega reagenta Synaptic Protein Extraction Reagent (Thermo Scientific) z 1x koktajlom zaviralca proteaze (Roche) in 1x tabletami koktajla zaviralca fosfataze (Roche) (na 10 ml), 5 s.

Homogenate centrifugiramo pri 1200 g 10 minut, da odstranimo ostanke celic. Vzeli smo supernatant in del supernatanta alikvotirali za analizo polnega homogenata. Preostanek smo centrifugirali pri 15,{3}} g 20-min pri 4 C.

Pelete, ki so vsebovale sinaptosome, smo nežno resuspendirali v Syn-Per pri 1,5 ml/g tkiva, da smo ustvarili sinaptični homogenat. Za kvantificiranje koncentracije beljakovin v vzorcu smo uporabili nanokapljico.

Polni homogenat in sinaptični homogenat sta bila do analize shranjena pri 80 °C. Oba homogenata Full in Synaptic sta bila razredčena na 4 mg/ml ledeno hladnega PBS in zmešana z 1:4 pufrom za nalaganje beljakovin (LiCor) in 1:4000 merkaptoetanolom. Nato so bili 5-min segreti pri 95 C in naloženi v gele Mini PROTEAN TGX (Bio-Rad).

Po ločevanju z elektroforezo pri 100 V smo proteine ​​prenesli na nitrocelulozno bloting membrano (GE Healthcare Lifesciences). Membrane so bile sprane v raztopini za predhodno obdelavo antigena SuperSignal WesternBlot Enhancer (Thermo Scientific) in nato blokirane z blokirnim pufrom (Rockland) in 1% kozjim serumom 1-h.

Po blokiranju je bila membrana inkubirana s primarnimi protitelesi, razredčenimi v SuperSignal Western BlotEnhancer Primary Antibody Diluent (Thermo Scientific) čez noč pri sobni temperaturi.

Primarna uporabljena protitelesa so bila mišje monoklonsko ERK 1/2 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology), kunčje monoklonsko fosfo-p44/42 MAPK (pERK 1:1000, Cell SignalingTechnologies), mišje monoklonsko CREB (1:500, Cell SignalingTechnologies), kunčje monoklonsko fosfo-CREB (S133) (pCREB1:500, Cell Signaling Technologies), zajčji monoklonski CAMKIIalpha (1:1000, Cell Signaling Technologies), mišji monoklonski fosfo-CAMKII (Thr286) (pCAMKII 1:1000, Invitrogen), mišji monoklonski GluR1 (1: 750, Santa Cruz Biotechnology), kunčji monoklonski fosfo-GluA1 (S845) (pGluR1(845) 1:750, CellSignaling Technologies), kunčji monoklonski fosfo-GluA1 (S831)(pGluR1(831) 1:750, Cell Signaling Technologies), miška monoklonski GluR2 (1:750, Invitrogen), kunčji poliklonski fosfo-GluR2(S880) (pGluR2 1:500, Invitrogen), mišji monoklonski TrkB (1:500, BD Transduction Laboratories) ali kunčji poliklonski fosfo-TrkB( Tyr816) (pTrkB 1:500, EMD Millipore).

Za standardno kontrolo obremenitve smo uporabili kunčji poliklonski Cofilin (1:2000, Sigma). Po izpiranju v TBS-Tween smo membrano inkubirali 1 uro pri sobni temperaturi v kozjem anti-kunčjem 800 in kozjem anti-mišjem 680 (1:3000, LiCor).

Imunoblot je bil posnet z infrardečim slikovnim sistemom Odyssey Clx (LiCor), analiza podatkov o intenzivnosti pasov pa je bila izvedena z uporabo Image Studio (LiCor).

2.5. Imunohistokemija

Tri ure po seji s sondo so miši, žrtvovane s prevelikim odmerkom ketamina, nato transkardialno perfundirali s 50 ml hladnega 1 M PBS.
Možgani so bili takoj naknadno fiksirani v 4 % raztopini paraformaldehida pri 4 °C in preneseni v 30% saharozo v PBS za vsaj 48- h pred kriosekcijo v 30 mm odseke. Prosto lebdeče dele so blokirali in permeabilizirali z 10 % kozjega oslovskega seruma v 0,1 % Tritonu v 1 M PBS, nato pa inkubirali 48-h s kunčjim poliklonskim PSD95 (1:300, Thermo Scientific) in mišjim monoklonskim SV2A (1:300, Santa Cruz biotehnologija).

Te odseke smo nato inkubirali 1-h s sekundarnimi protitelesi Alexa Fluor kozji anti-kunec 568 (1:500, Invitrogen) in Alexa Fluorgoat anti-mišji 488 (1:500, Invitrogen. Rezine smo nato sprali z jedrnim barvilom DAPI (1:1000, Sigma), nameščen na diapozitivih in prekrit s Fluoromount (Thermo Scientific).

Barvanje je bilo kvantificirano v frontalnem korteksu (FC), dorzalnem CA1 hipokampusu, entorhinalnem korteksu (EC) in peririnalnem korteksu (PC).

Zložene slike so bile posnete s fluorescentnim mikroskopom BZ-X700 (Keyence) pri 40-kratni povečavi, da se identificirajo sinaptične pike skozi celotno rezino. Skupne pike PDS95, pike SV2A in kolokalizirane (definirane kot dve piki ena poleg druge ali se prekrivajo) so bile preštete iz vsaj štirih slik za vsako področje in povprečje rezultatov, vzetih za vsako miško. Kvantifikacija % kolokaliziranega je bila zaključena s štetjem (prekrivajočih se SV2A in PSD95)/(skupaj SV2A in PSD95) točk.

2.6. Statistika

Vsi podatki so izpolnjevali predpostavke o normalnosti, kot je bilo ocenjeno s preučevanjem asimetrije, kurtoze in vrednosti Shapiro Wilk izračunanih ostankov, in ni bilo kršitev homogenosti variance, kot je bila ocenjena z uporabo Levenove statistike.

Za vedenjske teste so bili t-testi študentov uporabljeni za primerjavo SHAM s TMS, za raziskovanje novih in znanih objektov znotraj skupin pa je bila uporabljena dvosmerna ANOVA RepeatedMeasures.

Imunohistokemija in podatki Western blota so bili testirani glede pomembnosti z uporabo One-WayANOVA. Za vse post-hoc parne primerjave je bila uporabljena Tukeyjeva prilagoditev s pomembnostjo pri p < 0,05.

Če je bila homogenost variance kršena, je bila pomembnost določena z WelchTestom in naknadno popravljena z Games-Howellom, ti primeri so zabeleženi v rezultatih. Vse statistike so bile narejene z uporabo SPSS (različica 22, IBM), grafi pa so bili izdelani z uporabo GraphPad (različica 7, Prism).

For more information:1950477648nn@gmail.com