Poleg dejavnosti MET za spodbujanje življenjske dobe v različnih modelnih organizmih

Prosim kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza več informacij

UVOD

Epitelijske celice leče (LEC) tvorijo enoplast celic, ki obdajajo sprednjo kapsulo leče in segajo do ekvatorialnega loka leče [1, 2]. Normalna zgradba in delovanje LEC sta bistvena za vzdrževanje prosojnosti in presnovne homeostaze celotne leče [3]. Vse več dokazov kaže, da lahko staranje LEC povzroči modifikacijo, denaturacijo in agregacijo proteinov leče, vključno z encimi in kristalini, kar na koncu vodi do zamegljenosti leče ali celo katarakte [3-5]. Starostna siva mrena (ARC) ostaja glavni vzrok za okvaro vida in slepoto, kar resno vpliva na kakovost življenja starejših [6]. Trenutno ni učinkovitih strategij za preprečevanje napredovanja ARC. Zato je treba razviti farmakološko intervencijo, ki lahko izboljša preglednost leče in upočasni napredovanje ARC.

V zadnjih nekaj desetletjih so znanstveniki dosegli izjemen napredek pri izboljšanju zdravja in podaljšanju življenjske dobe z uporabo številnih genetskih, prehranskih in farmakoloških posegov [7]. Metformin (MET) je eno izmed obsežno raziskanih sredstev proti staranju. Obsežne študije kažejo, da lahko MET ublaži staranje in podaljša zdravo življenjsko dobo v različnih sistemih živalskih modelov. MET ne more le podaljšati življenjske dobe Caenorhabditis elegans, temveč tudi izboljšati njegovo zdravje in vitalnost [8]. MET lahko zmanjša s starostjo in oksidativnim stresom povezano kopičenje poškodb DNK v izvornih celicah srednjega črevesa Drosophila in tako podaljša njihovo življenjsko dobo [9]. Prejšnje študije tudi kažejo, da kronično dajanje majhnih odmerkov MET izboljša zdravje in življenjsko dobo miši [10]. Poleg tega novi dokazi kažejo, da bolniki s sladkorno boleznijo, zdravljeni z MET, izkazujejo koristi za preživetje, tudi v primerjavi s kontrolnimi osebami, ki nimajo sladkorne bolezni [11].

KSL09

Za več informacij kliknite tukaj

Poleg aktivnosti MET, ki spodbuja življenjsko dobo v različnih modelnih organizmih, MET cilja na več poti celičnega signala za izboljšanje bolezni, povezanih s staranjem. Pokazalo se je, da MET modulira avtofagijo predvsem preko aktivacije protein kinaze (AMPK), aktivirane z adenozin monofosfatom (AMP), ter preprečuje nevrodegeneracijo in nevrovnetje, da igra nevroprotektivno vlogo pri Parkinsonovi bolezni [12]. Podobno MET izboljša s starostjo povezane spremembe v jetrnih sinusoidnih endotelnih celicah preko AMPK in endotelnih poti dušikovega oksida [13].cistanche odmerek redditPoleg tega kronična aktivacija AMPK z MET preprečuje kardiomiopatijo z uravnavanjem avtofagije pri miših OVE26 s sladkorno boleznijo [14]. Poleg tega MET blaži s starostjo povezano kardiovaskularno poslabšanje s krepitvijo avtofagije in omejevanjem kalorij [15]. Poleg tega lahko zdravljenje z MET zavre s starostjo povezano aterosklerozo pri ApoE-7-miših in kuncih, ki jo povzroča prehrana z visoko vsebnostjo maščob, znatno prepreči kalcifikacijo aterosklerotičnih plakov, zmanjša visoko občutljive ravni C-reaktivnega proteina in zavira aktivacijo pot jedrskega faktorja kappa B(NF-kB) v krvnih žilah [16-18].

Na podlagi teh opažanj je ta študija poskušala raziskati, ali lahko MET upočasni staranje ARC in osnovni molekularni mehanizem. Naše ugotovitve so naslednje: (i) kronično zdravljenje z nizkimi odmerki MET je upočasnilo staranje LEC pri naravno starih miših in s tem zaviralo motnost leče; (i) pot AMPK je bila inaktivirana in avtofagični tok je bil oslabljen pri starajočih se LEC; (i) ) kronično zdravljenje z nizkimi odmerki MET je odložilo staranje LEC pri naravno starih miših z aktiviranjem poti AMPK in izboljšanjem avtofagije. Naše ugotovitve utemeljujejo domnevno vlogo MET proti staranju in zagotavljajo zadostne dokaze, da se lahko MET izkaže za možno terapevtsko možnost za ARC.

REZULTATI

Staranje LEC je bilo povezano z ARC pri naravno starih miših

Več možnih mehanizmov ARC, vključno z učinkom staranja, je bilo obsežno raziskanih.koristi izvlečka cistanche,Vendar povezava med staranjem LEC in ARC in vivo ostaja nejasna. Domnevali smo, da lahko staranje LEC povzroči ARC in vivo. Zato smo izdelali mišji model ARC. Naši rezultati so pokazali, da je bila prosojnost leče pri naravno starih miših (starejše miši) znatno zmanjšana v primerjavi s tisto v kontrolni skupini (mlade miši) (slika 1a). Kot je prikazano na sliki 1b, je bila incidenca katarakte v naravno stari skupini 95,23 odstotka. Test barvanja s H&E je pokazal, da so bili LEC v kontrolni skupini okrogle oblike in pravilno razporejeni, gostota normalnih LEC pa je bila relativno visoka, medtem ko so bili LEC naravno starih miši ravne oblike in razporejeni neenakomerno, gostota starajoči se LEC se je izrazito zmanjšal (slika 1c). Poleg tega je barvanje s SA- -Gal pokazalo, da je bilo razmerje senescentnih LEC povišano pri naravno starih miših (slika 1d). Poleg tega smo analizirali izražanje beljakovin markerjev, povezanih s staranjem, z barvanjem IHC in analizo Western blot. IHC barvanje je pokazalo, da je bila ekspresija p21 in p53 povečana v LEC naravno starih miši v primerjavi z mladimi mišmi (sl. 1e, f). Podobno smo nadalje odkrili, da je bila ekspresija beljakovin p21 in p53 višja v kapsulah leč naravno starih miši kot v kapsulah leč mladih miši (slika 1g). Ti rezultati kažejo, da je bilo staranje LEC povezano z ARC pri naravno starih miših.

KSL10

Cistanche lahko upočasni staranje

Kronično dajanje nizkih odmerkov MET je izboljšalo preglednost leče in ublažilo staranje LEC Preden smo testirali učinek metformina na ARC, smo ugotovili, ali je kronično dajanje nizkih odmerkov MET varno za miši. Po 10-mesečnem zdravljenju z MET je 28 miši (18 v skupini z naravno starostjo in 10 v skupini z MET) poginilo zaradi naravnih vzrokov. Ugotovili smo, da so bile žive miši v obeh skupinah zdrave in ni bilo bistvene razlike v telesni masi in masi organov med obema skupinama (tabela 1). Zato so ti rezultati pokazali, da je bil odmerek metformina, uporabljen v študiji, varen za živali in bi ga lahko uporabili za nadaljnje poskuse.

Nato so dajali kronično nizkoodmerno MET, da bi ocenili, ali lahko MET zavira motnost leče in ublaži s starostjo povezano staranje LEC pri naravno starih miših. Kot je bilo pričakovano, se je prosojnost leče v skupini MET močno izboljšala v primerjavi s prosojnostjo leče v skupini naravno starejših (slika 2a). Poleg tega so morfološka opazovanja potrdila, da je leča skupine MET pokazala zmanjšanje motnosti. Incidenca katarakte v skupini naravno starejših je bila 95,23 odstotka, medtem ko je bila v skupini MET 19.00 odstotkov (slika 2b). Test barvanja H&E je pokazal, da je bila gostota LEC v skupini MET opazno večja kot pri naravno starih miših (slika 2c). Poleg tega so bili LEC skupine MET razmeroma okrogle oblike v primerjavi s tistimi v naravno stari skupini (slika 2c). Barvanje s SA- -Gal je pokazalo, da se je razmerje med starajočimi se LEC znatno zmanjšalo v skupini MET v primerjavi s tistim v skupini naravno starejših (slika 2d). Analiza IHC je pokazala, da je bila ekspresija p21 in p53 bolj zmanjšana v LEC skupine MET kot v naravno stari skupini (sl. 2e, f). Podobno je Western blot analiza pokazala, da je bila ekspresija proteina p21 in p53 izjemno zmanjšana v lečnih kapsulah skupine MET v primerjavi s tistimi v naravno starajoči se skupini (slika 2g). Ti rezultati so pokazali, da bi lahko kronično dajanje MET v nizkih odmerkih izboljšalo preglednost leče in ublažilo staranje LEC.

KSL11

Kronično dajanje nizkih odmerkov MET je oslabilo staranje LEC pri naravno starih miših z aktivacijo AMPK. Ogromna količina podatkov podpira sklep, da je aktiviranje AMPK zadostno za podaljšanje življenjske dobe v modelnih organizmih, kar povečuje njegovo privlačnost kot tarčo dolgoživosti [19,20] . Glede na to teorijo smo ocenili izražanje poti AMPK v LEC miši. Relativna raven mRNA FAS je bila zmanjšana v skupini z naravno starostjo in povečana v skupini MET (slika 3a). Kot je prikazano na sliki 3b,c, je bila ekspresija fosforiliranega AMPKa (Thr172) in fosforiliranega ACC (Ser79) zmanjšana v LEC naravno starih miši v primerjavi s tistimi pri mladih miših. Vendar pa je bila ekspresija fosforiliranega AMPKa (Thr172) in fosforiliranega ACC (Ser79) povišana v LEC skupine MET v primerjavi s tistimi v naravno stari skupini. Poleg tega je Western blot analiza pokazala, da je bila ekspresija proteina fosforiliranega AMPKa (Thr172) in fosforiliranega ACC (Ser79) bistveno zmanjšana v lečnih kapsulah naravno starajočih se, ravni ekspresije proteina fosforiliranega AMPKa (Thr172) in fosforiliranega ACC ( Ser79) so bile povečane v kapsulah za leče skupine MET (slika 3d). Ti podatki so razkrili, da je bila pot AMPK inaktivirana v LEC naravno starih miši. Poleg tega je kronično dajanje nizkih odmerkov MET oslabilo staranje LEC pri naravno starih miših z aktivacijo AMPK.

Kronično dajanje nizkih odmerkov MET je obnovilo avtofagični tok za ublažitev staranja LEC pri naravno starih miših. Prejšnje študije so pokazale, da ima lahko avtofagija pomembno vlogo v boju proti škodljivim učinkom staranja [21, 22]. Za nadaljnjo analizo molekularnih in celičnih sprememb v leči po zdravljenju z MET smo določili izražanje LC3 in p62, ker sta splošno sprejeta kot biomarkerja ravni avtofagije. Kot je prikazano na sliki 4a, se je relativna raven izražanja mRNA p62 znatno povečala v naravno stari skupini v primerjavi s tisto v kontrolni skupini; vendar pa je bila relativna raven ekspresije mRNA p62 bistveno znižana v skupini MET v primerjavi s tisto v skupini naravno starejših.cistanche Genghis KhanPoleg tega je barvanje z IHC pokazalo, da so bile ravni lahke verige 3 (LC3-II/l) in p62, povezane z mikrotubulami, proteina 1 povečane v LEC naravno starih miši. Poleg tega so naši rezultati pokazali, da so se ravni LC3-II/l in p62 izjemno znižale v LEC skupine MET (sl. 4b, c). Ravni beljakovin LC3-ll in p62 so bile opazno povečane v lečnih kapsulah naravno stare skupine (slika 4d). Skupaj smo špekulirali, da je bil avtofagični tok oslabljen v LEC-jih naravno starih miši in bi ga bilo mogoče obnoviti s kroničnim dajanjem nizkih odmerkov MET, da bi ublažili staranje LEC-jev pri naravno starih miših.

DISKUSIJA

Nezdravljena siva mrena je glavni vzrok slepote po vsem svetu, za katero je značilna motnost kristalne leče [23]. Epidemiološke študije so pokazale, da je starost prevladujoči dejavnik tveganja za sivo mreno, znano kot ARC, in da je edino zdravljenje kirurška odstranitev [24]. Prejšnje študije so pokazale, da je staranje LEC glavni vzrok za ARC [25]. Do danes ni bilo učinkovitih terapevtskih sredstev, ki bi zavirala zamegljenost leče in ublažila staranje LEC brez neželenih stranskih učinkov. Poudarek te študije je bil oceniti molekularno biološko osnovo za staranje LEC in mehanizem zaščite normalnih LEC pred staranjem. Naši rezultati so pokazali, da je bila inaktivacija AMPK in okvara avtofagije povezana s staranjem LEC in ARC. Poleg tega smo ugotovili, da lahko MET zaščiti LEC pred staranjem in zavira motnost leče z aktiviranjem AMPK in izboljšanjem avtofagije.

Staranje je temeljni biološki proces, ki ga spremlja splošen upad delovanja tkiva. S podaljševanjem življenjske dobe postanejo s starostjo povezane disfunkcije, kot je ARC, resne zdravstvene težave

vprašanja [26]. Poročali so, da je staranje LEC vključeno v pojav in razvoj ARC [5]. Naši rezultati so pokazali, da so bili LEC-ji naravno starih miši ravne oblike in razporejeni neenakomerno, gostota LEC-jev pa se je izrazito zmanjšala (sl. 1c, d). Poleg tega je bila ekspresija genov, povezanih s staranjem (p21 in p53), povečana v LEC naravno starih miši (sl. 1e, f, g). Naši rezultati so pokazali, da je staranje LEC povezano s pojavom in razvojem ARC. Zato bo morda potrebno natančno razumevanje molekularnih mehanizmov, na katerih temelji staranje LEC, da se zagotovi utemeljitev za nove strategije zdravljenja.

MET je najpogosteje predpisano peroralno hipoglikemično zdravilo za sladkorno bolezen tipa 2 po vsem svetu. Nastajajoči dokazi kažejo, da ima MET koristne učinke na zdravje, ki presegajo tiste, ki so povezani z izboljšanjem glikemije [27]. Potrjeno je bilo, da so mehanizmi MET pomembni za usmerjanje temeljnih poti biološkega staranja, kot je aktiviranje AMPK, povečanje avtofagije, zaviranje vnetja in izvajanje antioksidativnih učinkov [28]. Pri ljudeh se MET v klinični praksi uporablja že več kot 60 let; ima visok varnostni profil in je edinstveno pozicioniran za posredovanje v več ključnih poteh, odgovornih za staranje in s starostjo povezane bolezni. Vendar učinki TGO na ARC in regulativni mehanizem teh učinkov niso bili nikoli opisani. Posledično je v naši študiji kronično dajanje nizkih odmerkov MET pri naravno starih miših izboljšalo preglednost leče (slika 2a) in oslabilo staranje LEC in vivo (slika 2).

KSL12

Splošno priznano je, da MET aktivira pot AMPK, ki je potencialni mehanizem MET za izvajanje učinka proti staranju [29]. AMPK, senzor celične energije, igra ključno vlogo pri uravnavanju celične energetske bilance [30]. Več študij je pokazalo, da AMPK služi kot integrator in posrednik več poti in procesov, ki povezujejo energetiko z dolgo življenjsko dobo. V naši študiji smo ugotovili, da je bila inaktivacija AMPK značilnost starajočih se LEC pri naravno starih miših (slika 3). Kasneje se je pokazalo, da MET stimulira pot AMPK, da prepreči staranje LEC (slika 3). Kot uveljavljen aktivator AMPK se vloga MET pri preprečevanju staranja na splošno pripisuje njegovim učinkom na modulacijo spodnjih signalnih poti, kot je obnovitev avtofagije, aktivacija Sirt1 in Foxo1 ter zatiranje mTOR [31,32]. Naša študija je zagotovila nove dokaze, ki poudarjajo pomen funkcije AMPK, ki jo aktivira MET, pri preprečevanju pojava ARC.

Kot je navedeno zgoraj, AMPK komunicira s številnimi potmi in proteini, da izvaja učinek proti staranju, vključno s povečanjem avtofagije. Avtofagija, ki se pojavlja kot osrednji proces za zagotavljanje dolgoživosti, je pritegnila široko zanimanje kot potencialna terapevtska tarča za bolezni, povezane s staranjem. Avtofagija je tekoč, večstopenjski zapleten biološki proces. Celoten proces avtofagije se imenuje avtofagični tok, ki se pogosto uporablja za odražanje stopnje avtofagije. Kot indikator avtofagije je LC3-Il tesno vezan na avtofagosomsko membrano, ki jo razgradijo lizosomski encimi.cistanche podaljšanje življenjske dobePodobno se p62, substrat, specifičen za avtofagijo, običajno razgradi v avtofagolizosomu, njegova ekspresija pa posredno odraža stopnjo avtofagije. V tej študiji so naše ugotovitve pokazale, da se je raven avtofagije izrazito zmanjšala pri starajočih se LEC (slika 4), medtem ko je MET obrnil s starostjo povezano okvaro avtofagije (slika 4). Molekularni mehanizem proti staranju MET se pripisuje primarni funkciji AMPK v celicah, ker na splošno poveča avtofagijo z aktivacijo AMPK [33]. Poleg tega je dokazano, da MET neposredno povečuje avtofagijo in tako prispeva k preprečevanju staranja [34]. Vendar pa so potrebne podrobnejše študije za pojasnitev osnovnih mehanizmov, ki dokazujejo, da MET povečuje avtofagijo preko neodvisne ali odvisne AMPK poti.

Dokazano je bilo, da razširjenost ARC ni bila povezana s spolom pri populacijah azijskega porekla [35, 36]. Zato spola nismo upoštevali kot dejavnik, ki bi lahko vplival na ARC. Našo študijo je treba razlagati ob upoštevanju zgoraj navedenih omejitev.

ZAKLJUČEK

Če povzamemo, smo dokazali, da lahko inaktivacija poti AMPK in s starostjo povezana okvara avtofagije prispevata k staranju LEC in pojavu ARC. Poleg tega so podatki iz naših poskusov razkrili, da je MET učinkovito odložil staranje LEC in nastanek ARC z aktivacijo poti AMPK in povečanjem avtofagije. Naše ugotovitve so osnova za nadaljnje raziskave molekularnih mehanizmov, ki so uporabni pri vlogi MET med procesom staranja ARC in bodo informativne za intenzivnejše študije o razvoju novih strategij proti pojavu in razvoju ARC.

MATERIALI IN METODE Reagenti

MET je bilo kupljeno pri Bristol-Myers Squibb Company (Kitajska). Protitelesa proti p21 (ab188224), p53 (ab131442), fosforiliranemu AMPKa(p-AMPK)(Thr172)(ab133448), AMPKa1(ab32047), -aktinu (ab8226) in SQSTM1/p62 (3340-1) so bili pridobljeni pri Abcam (MA, ZDA). Protitelesa proti LC3 (12741) in fosfo-acetil CoA karboksilazi (p-ACC) (Ser79) (3661) so bila kupljena pri Cell Signaling Technology ( MA, ZDA).

Živali in zdravljenje

Samci miši C57BL6J, stari 3 in 8 mesecev, so bili kupljeni pri Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd. (Peking, Kitajska). Miši so bile nameščene v pogojih z nadzorovano temperaturo (temperatura, 20-25 stopinj in relativna vlažnost, 55±15 odstotkov) z 12-urnim ciklom svetloba/tema, s prostim dostopom do hrane in vode. Vse postopke in protokole, izvedene na živalih, je odobril etični odbor Harbinske medicinske univerze.

Miši so bile razdeljene v naslednje tri skupine: (i) kontrolna skupina je imela mlade miši (stare 3 mesece, telesna teža=29.72± 1,66 g, n =40), ki so prejemale standardno prečiščeno mišjo prehrano in vodo ad libitum; Ko so bile miši stare 10 mesec, je bilo 120 miši naključno razdeljenih v dve skupini: naravno stara skupina in skupina MET. (i) naravno stara skupina (starejše miši, stare 20 mesecev, telesna teža=32.98±1,93 g, n=60) je prejela standardno prečiščeno mišjo prehrano in vodo ad libitum; (ii) skupina MET ( 20 mesecev, telesna teža=31.21±2,81 g,n=60)je bila na standardni prečiščeni mišji dieti in vodi, dokler miši niso dosegle starosti 10 mesecev; po tem pa so se začela zdravljenja. Miši v skupini MET so bile 10 mesecev hranjene s hrano, dopolnjeno z 0,1 odstotka MET (Bristol Myers Squibb, Kitajska) in brez vode.

izolacija leč in lečnih kapsul

Miši so bile evtanazirane z izpahom materničnega vratu. Vsem poskusnim živalim smo takoj izrezali celotno oko in ga dali v sterilno fiziološko raztopino. Optični živec je bil postavljen navzgor in fiksiran s pinceto. Nato so naredili rez na vidnem živcu, ki vstopa v oko, in beločnico potegnili nazaj, da bi izpostavili lečo.cistanche nzNato smo s pinceto nežno odstranili delce ciliarnega telesa, pritrjene na ekvatorialno ravnino leče. Takoj so bile posnete sveže leče, ki so bile hitro fiksirane s 4-odstotnim paraformaldehidom pri sobni temperaturi. Celotne lečne kapsule so bile hitro olupljene s preostale leče, na hitro zamrznjene v tekočem dušiku in shranjene pri 80 stopinjah C za nadaljnje poskuse.

Hematoksilin in eozin (H&E)

Svežo lečo smo takoj fiksirali s 4 odstotki paraformaldehida pri sobni temperaturi in vdelali v parafin. Za histološko preiskavo so bila tkiva razrezana na 4-µm rezine. Po deparafinizaciji in rehidraciji smo pripravljene parafinske reze obarvali z raztopino hematoksilina (H) 8 minut, čemur je sledilo 5 potopitev v 1-odstotni kislinski etanol (1-odstotna HCl v 70-odstotnem etanolu)

in izpiranje z destilirano vodo. Nato so bili odseki obarvani z raztopino eozina (E) 3 minute, čemur je sledila dehidracija s stopnjevanim alkoholom in čiščenje s ksilenom. Morfološke spremembe smo opazovali pod mikroskopom (Nikon, Eclipse, Japonska).

Test s staranjem povezane -galaktozidaze (SA- -Gal) Aktivnost s staranjem povezane -galaktozidaze (SA- -Gal) je bila izmerjena z uporabo kompleta za barvanje SA- -Gal (Sigma, CS{ {12}}030). V skladu z navodili proizvajalca smo rezine tkiva po nizu obdelav 5 minut (trikrat) izpirali s fosfatno pufrano fiziološko raztopino (PBS) in nato inkubirali v raztopini za barvanje SA- -gal (pH 6,0) pri 37 stopinj brez CO2 24 ur. Slike so bile posnete pod svetlobnim mikroskopom (Nikon, Eclipse, Japonska). Odstotek SA- -gal-pozitivnih celic je bil ocenjen kot povprečno število pozitivnih celic/povprečno število vseh celic.

Kvantitativna verižna reakcija s polimerazo v realnem času (gRT-PCR) Celotno RNK iz lečnih kapsul miši smo ekstrahirali z uporabo reagenta TRlzol. Reverzna transkripcija je bila izvedena s kompletom reagentov ExScript RT (Invitrogen). Analiza kvantitativne reverzne transkripcije-verižne reakcije s polimerazo (qRT-PCR) je bila izvedena z uporabo SYBR Green Supermix

kit (Takara, Tokio, Japonska), z -aktinom kot endogenim nadzorom. Transkripcije so bile raziskane za več ciljnih genov, vključno s FAS (naprej, 5'-TTGCTGGCACTACAGAATGC-3'in obratno, 5'-AACAGCC TCAGAGCGACAAT-3'), p62 (naprej, 5'-GGCGCACTACCGCGATGAGGA{{ 10}} in obratno, 5'-TGTTCCCGCCGGCACTCCTT-3') in -aktin (naprej, 5 '-TCGTGGGCCGCCCTAGGCAC-3'in obratno, 5'-TGGCCTTAGGGTTC AGGGGGG-3'. Relativni stopnje izražanja vsakega gena so bile

metoda. normalizirano na -aktin in izračunano z uporabo 2-△△ct r Imunohistokemično (IHC) barvanje Skupno 5 reprezentativnih odsekov iz vsake od 10 izbranih leč na skupino je bilo uporabljenih za imunohistokemično (IHC) analizo za oceno izražanja p21, p53, p-AMPK, p-ACC, LC3 in p62. Potem ko smo pripravljene vzorce inkubirali pri 60 stopinjah 2 uri, smo jih spustili skozi ksilen in stopnjevane alkoholne serije za deparafinizacijo. Nato smo vzorce kuhali v 0,1 M citronske kisline (pH 6,1) 30 minut in ohladili na sobno temperaturo. Po trikratnem pranju s PBS so bili vzorci namočeni z 0, 3-odstotno H2O, da bi zavirali aktivnost endogene peroksidaze. Nato smo dodali primarna protitelesa in jih čez noč ohladili na 4 stopinje C. Ustrezna sekundarna protitelesa smo inkubirali 1 uro pri 37 stopinjah C. Po izpiranju s PBS smo vzorce inkubirali v diaminobenzidinu (DAB), dokler se ni razvila želena intenzivnost madežev. Slike imunsko obarvanih celic so bile zajete z mikroskopom Nikon Eclipse (Nikon, Eclipse, Japonska).

Western blot analiza

Celotne beljakovine iz lečnih kapsul miši smo ekstrahirali s pufrom za radioimunoprecipitacijski test (RIPA) s koktajlom zaviralcev proteaz (Pierce, ZDA), za kvantificiranje koncentracije beljakovin pa smo uporabili komplet bicinhoninske kisline (BCA) (Thermo Fisher Scientific, ZDA). . Skupni protein (40 ug) je bil analiziran z elektroforezo v natrijevem dodecil sulfatu in poliakrilamidnem gelu (SDS-PAGE) in elektroforetično prenesen na membrane filtra iz poliviniliden difluorida (PVDF) (Millipore, Nemčija). Membrane smo čez noč inkubirali s primarnim protitelesom pri 4 stopinjah C. Naslednji dan smo membrane inkubirali z ustreznimi sekundarnimi protitelesi 1 uro pri 37 stopinjah C. Imunoreaktivne pasove smo vizualizirali z uporabo metode kemiluminiscenčnega substrata s Super Signal West Pico komplet (Pierce Biotechnology, ZDA). Izvedeni so bili trije neodvisni poskusi.

Statistična analiza

Podatki so bili izraženi kot povprečje±standardni odklon (SD). Statistične analize so bile izvedene s programsko opremo GraphPad Prism 7.0 in Microsoft Excel. Beljakovine smo kvantificirali s programsko opremo Image J. Za izračun statistične pomembnosti eksperimentalnih podatkov sta bila uporabljena Studentov t-test in analiza variance (ANOVA). Razlike s P-vrednostjo<0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" all="" experiments="" were="" repeated="" independently="" at="" least="" three="">