In Silico analiza peptida parazitoidnega strupa Drosophila razkriva razširjenost motiva kation-polar-kation clip v proteinih Knottin 1. del

Povzetek:

Leptopilina heteroatom je kot splošne parazitoidne ose zelo uspešna pri številnih vrstah vinskih mušic iz rodu Drosophila. Parazitoidi v svojem strupu proizvajajo specializirane večstrategijske zunajcelične mehurčkom (EV) podobne strukture. Proteomska analiza je identificirala več proteinov, povezanih z imunostjo, vključno s peptidom knottin, LhKNOT, ki vsebuje strukturno ohranjen inhibitor cisteinskega vozla (ICK), ki je prisoten v proteinih iz različnih taksonov. Naša strukturna in priklopna analiza LhKNOT-ove 36-rezidualne jedrne vozlaste gube je razkrila, da ima poleg samega vozlastega motiva tudi kation–polar–kation (CPC) sponko.

Inhibitor cistein je naravna snov, ki se uporablja za preprečevanje oksidativne poškodbe in pospeševanje rasti celic. Za imunost se vloga cisteina kaže predvsem v izboljšanju imunosti telesa ter preprečevanju vnetij in okužb.

V zadnjih letih vse več študij dokazuje, da ima lahko cistein pomembno vlogo pri imunskem sistemu. Lahko spodbuja proliferacijo imunskih celic, poveča odpornost telesa na patogene in zmanjša tveganje za okužbo. Poleg tega lahko cistein tudi zmanjša nastajanje prostih radikalov in izboljša splošno zdravje imunskega sistema ter s tem poveča odpornost telesa.

Čeprav je učinek cisteina na imunost zelo pomemben, ga je treba pri uporabi inhibitorja cisteina uporabljati previdno. Ker se zaviralec cistein običajno uporablja za zdravljenje določenih bolezni, kot so bolezni srca in ožilja, artritis itd., bo v primeru zlorabe vplival na imunost in povzročil oslabitev imunskega sistema telesa ter s tem povečal tveganje za okužbo.

Skratka, med zaviralcem cisteinom in imunostjo obstaja neločljiva povezava. Čeprav lahko zaviralci cisteina spodbujajo zdravje telesa, jih je treba uporabljati tudi pod vodstvom zdravnika, pri čemer je treba paziti na vzdrževanje razumnega odmerka za ohranjanje zdravja telesa. Vidi se, da moramo izboljšati imuniteto. Cistanche lahko bistveno izboljša imuniteto, saj mesni pepel vsebuje različne biološko aktivne sestavine, kot so polisaharidi, dve gobi, Huang Li itd. Te sestavine lahko stimulirajo različne imunske sisteme. celicam podobnih celic, kar poveča njihovo imunsko aktivnost.

Kliknite zdravstvene koristi cistanche

Motiv CPC posnetka naj bi olajšal protimikrobno aktivnost v proteinih, ki vežejo heparin. Presenetljivo je, da ima večina testiranih ICK-jev tudi motiv posnetka CPC, vključno s 75 verodostojnimi proteini vozlov rastlin in členonožcev, ki imajo veliko zaporedje in/ali strukturno podobnost z LhKNOT. Tako kot LhKNOT in teh drugih 75 knottin proteinov, tudi protiglivični peptid Drosophila Drosomycin, kanonični ciljni gen imunske poti TollNF-kappa B muhe, vsebuje ta motiv CPC posnetka. Naši rezultati skupaj kažejo na možno obrambno funkcijo za parazitoid LhKNOT.

Razširjenost motiva posnetka CPC, ki je intrinzičen cisteinskemu vozlu znotraj tukaj pregledanih proteinov vozla, nakazuje, da je nastala 3D topologija pomembna za njihove biokemične funkcije. Posnetek CPC je verjetno zelo ohranjen strukturni motiv, ki ga najdemo v številnih raznolikih proteinih s poročano sposobnostjo vezave heparina, vključno z amiloidnimi proteini. Knottini so tarče za razvoj terapevtskih zdravil in vpogled v njihova razmerja med strukturo in funkcijo bo pospešil oblikovanje novih zdravil.

Ključne besede:

Gostitelj–parazit; Drosophila; Leptopilina; cisteinski vozel; zavozlana guba; Cation–Polar–Cation sponka; protimikrobni peptid; heparin-vezavni motiv; mini proteini.

1. Uvod

Pri interakcijah med gostiteljem in parazitom mora parazit zagotavljati napadalni pritisk, hkrati pa ohranjati gostitelja pri življenju, da ohrani preživetje sposobne potomce [1,2]. Takšni nasprotujoči si cilji so privedli do razvoja dejavnikov virulence z različnimi molekularnimi strategijami, hkrati pa ohranjajo visoko specifičnost gostitelja. Parazitske Hymenoptera predstavljajo več kot milijon vrst, so vseprisotne na planetu in parazitirajo na različnih členonožcih, predvsem na žuželkah [3].

Ose, ki napadajo gostitelje žuželk, so razvile vrsto vedenjskih in biokemičnih strategij za uspeh in ostajajo pod stalnim koevolucijskim pritiskom s svojimi gostitelji [4–7].

Sistem Leptopilina/Drosophila je nastajajoči model za razumevanje molekularnih temeljev odzivov proti osi in strategij virulence os [8]. Za zatiranje imunosti gostitelja samice Leptopiline vnašajo dejavnike strupa v svoje gostitelje ličinke med odlaganjem jajčec [4,9,10]. Dobro definirani prirojeni imunski mehanizmi pri Drosophili [11–13] zagotavljajo dragocen kontekst za preučevanje učinkov teh dejavnikov strupa os.

Okužba s specialistom L. boulardi aktivira humoralne in celične imunske roke, ki jih nadzira ohranjena signalna pot Toll-NF-κB muhe. Izražanje genov protimikrobnih peptidov (AMP), kot je drosomicin, se aktivira po okužbi z L. boulardi [14]. Signalizacija Toll-NF-κB nadzoruje tudi delitev in razvoj krvnih celic [15,16], korake, ki nadzorujejo inkapsulacijo in smrt jajčec os [17,18].

Nasprotno pa okužba s splošnim L. heteroatom zavira obe imunski poti [9,14] in skoraj vse krvne celice ličink uničijo dejavniki v strupu ose [19,20].

V tej študiji analiziramo teoretično strukturo peptida heteroatoma L., imenovanega LhKNOT, identificiranega v organelih podobnih izločkih v strupu heteroatoma L., ne pa tudi v strupu L. boulardi [21]. Ti organeli, ki zavirajo imunski sistem, vključujejo več kot 350 proteinov in imajo proteomski profil evkariontskih mikrovezikul in množico proteinov, povezanih z imunostjo [21–23].

LhKNOT sprejme motiv "Inhibitor Cysteine ​​Knot" (knottin) [24]. Motiv vozlov je na splošno ohranjen v vrsti taksonov, od rastlin [25,26] do polžev [27]. Ti majhni peptidi (<60 residues) are functionally diverse. Knottins are used offensively, in spider toxins [28] and cone snail venom [27], as well as defensively, e.g., in wound healing activities of cacti [26], and antimicrobial host defense in plants [25,26,29] and invertebrates [30].

Širok spekter delovanja vozlov se pripisuje celotni strukturi njegove gube, ki temelji izključno na ohranjenem motivu šestih cisteinskih ostankov, ki izkoriščajo edinstveno sposobnost teh cisteinov, da tvorijo disulfidne mostove. Motiv vozlov se pojavi, ko opazimo ostanke cisteina v vzorcu C1-C2-C3-C4-C5-C6 (kjer »-« predstavlja več zelo spremenljivi ostanki).

Disulfidni mostovi se nato oblikujejo na podoben ohranjen način (C1-C4, C2-C5 in C3-C6), kar ima za posledico C1-C4 in C{{ 8}}C5, ki tvori makrocikel, medtem ko se C3-C6 pojavlja znotraj tega makrocikla, kar povzroči "vozlano" topologijo. Ker je ta zavozlana topologija v veliki meri odvisna od ohranitve šestih cisteinskih ostankov, motiv vozla omogoča znatno variacijo v celotnem zaporedju [30]. Kombinacija njihove majhnosti, visoke tolerance variance zaporedja in opažene strukturne stabilnosti je naredila vozle priljubljen oder za načrtovanje zdravil [30], potencialno celo za zdravljenje raka [31].

Različne vrste eksperimentalnih dokazov dokazujejo ali nakazujejo protimikrobne sposobnosti za različne vozle [25, 26, 29, 30, 32, 33] ali interakcije zaprtih ionskih kanalov [28, 34], čeprav molekularni mehanizmi, s katerimi se te funkcije izvajajo, niso dobro razumel. Poleg tega ni znano, ali imajo te protimikrobne funkcije skupen mehanizem delovanja.

Glede na njegovo odkritje iz imunosupresivnih delcev iz mušjih parazitov sta bila naša cilja (a) identificirati z LhKNOT povezana zaporedja iz različnih organizmov, vključno z L. heteroatom, L. boulardi in Ganaspis parazitoidi, ki napadajo Drosophila in (b) identificirati vse nove strukturne motive, ki so prisotni v znanih ali novih homologih LhKNOT z upanjem, da bi lahko napoved takega ohranjenega motiva predlagala možne funkcije za LhKNOT in vodila prihodnje eksperimentalne raziskave.

Pokažemo, da ima teoretični model LhKNOT značilnosti vozlaste gube s tremi antiparalelnimi beta ploščami, omejenimi z disulfidnimi mostovi. Model LhKNOT vsebuje sponko CPC, ki je sposobna interakcije s heparinom, negativno nabitim glikozaminoglikanom (GAG) pomembne medicinske vrednosti. LhKNOT ima tudi potencial za medsebojno delovanje z drugimi GAG, kot sta keratan sulfat (GAG, ki je močno sulfatiran, podoben heparinu) in hialuronska kislina (edini predstavnik GAG, ki ne potrebuje sulfatiranja) [35].

Poleg tega imajo strukturni homologi LhKNOT (tj. verodostojni proteini motiva vozla) tudi motiv CPC posnetka, ki se lahko spoji s heparinom. Presenetljivo je, da tako kot LhKNOT in ti drugi verodostojni proteini vozlov, tudi protiglivični peptid Drosophila Drosomycin deli ta motiv CPC posnetka v svoji strukturi. Ta motiv je bil identificiran tudi v 41 od 46 dodatnih homologov LhKNOT iz L. heteroatom, L. boulardi in Ganaspis spp. osi uspešno na D. melanogaster.

Ta opažanja, ki temeljijo na siliciju, kažejo, da lahko motiv sponke CPC, ki je neločljivo povezan z mnogimi vozli, predstavlja strukturno osnovo za spreminjanje imunskih ali virulentnih funkcij. Špekuliramo o možni protimikrobni ali z virulenco povezani funkciji os LhKNOT. Številčnost vozlaste gube in njeno soglasje z motivom sponke CPC v večini na novo identificiranih peptidov vozla iz treh parazitoidov Drosophila kaže na njihovo pomembno vlogo, ki še ni določena, v fiziologiji parazitoidov in/ali v parazitu gostitelju interakcije.

2. Rezultati
2.1. Sekvenca LhKNOT kaže podobnost protimikrobnim peptidom insektov in rastlin

Iskanje BLASTp podatkovnih baz nr in TSA z uporabo zaporedja LhKNOT v polni dolžini (60 aminokislin) je pokazalo omejeno število pomembnih zadetkov, v prvi vrsti označenih kot "protimikrobni peptidi", iz rastlin in žuželk. Identificiranih je bilo tudi nekaj zaporedij gliv. Vsi rezultati so pokazali manj kot 60-odstotno identiteto aminokislin z LhKNOT. Najboljše ujemanje za LhKNOT v bazi podatkov nr je bil protimikrobni peptid iz navadnega hrošča Callosobruchus maculates, medtem ko je bil najboljši zadetek v bazi podatkov TSA protimikrobni peptid iz pršice pšenične kodrice Aceria Coachella.

Ohranjanje je bilo najbolj vidno v območju edinega zaporednega motiva, povezanega z LhKNOT, cisteinsko zavozlanega 'protiglivičnega peptidnega' podpisa (domena pfam11410, E=2.8 × 10-3). Po zagonu PSI-BLAST za odkrivanje oddaljenih homologov so bile razkrite dodatne sekvence. PSI-BLAST je pokazal podobne rezultate pri navadni ledenki Mesembryanthemum crystallinum; rdeče pršice, Dinothrombium tinctorium; parazitoidna osa, Trichogramma pretiosum; hrošč klik, svetleči Ignelater; parazitoidna osa, Trichogramma brassicae; navadni hrošček, Brassicogethes aeneus; jesenovka, Agrilus planipennis; in žagarica, Neodiprion lecontei.

Z uporabo spletnega strežnika HMMER, ki temelji na skritih Markovovih modelih, kot alternativne metode za odkrivanje oddaljenih homologov smo identificirali pet zadetkov gliv iz Akanthomyces lecanii, Cordyceps javanica, Cordyceps confragosa, Rosellinia necatrix in Beauveria bassiana.

Iskanje podobnih sekvenc v PDB je dalo samo dva pomembna rezultata, enega za protiglivični peptid Alo-3 tipa knottin iz žuželke Acrocinus longimanus in drugega iz disulfidno omejenega peptida za celjenje ran pB1 iz Pereskia bleo. Podrobnosti o vseh bližnjih in oddaljenih homologih, identificiranih z uporabo različnih pristopov podobnosti zaporedja, so povzete v dodatni tabeli S1.

Poravnava LhKNOT z znanimi strukturami tipičnih vozlov in identificiranimi homologi je pokazala ohranitev šestih cisteinov, ki tvorijo tri disulfidne mostove v LhKNOT (slika 1A). Na svojem N-koncu vsebuje LhKNOT dolg spiralni segment, za katerega je predvideno, da deluje kot signalno zaporedje; znotraj vsebuje tri beta liste, kot se pričakuje od sekundarne strukture peptidov vozla (slika 1B).

Poleg tega je ocena podobnosti zaporedja LhKNOT, usmerjena na razpoložljive transkripte L. heteroatom in L. boulardi ter iz drugega parazitoida Drosophila, Ganaspis spp. (glej Metode), je razkril obilico povezanih zaporedij. Za L. heterotoma (Lh14) smo identificirali 16 dodatnih Lh14 knottin proteinov (dodatna tabela S2).
Za L. boulardi smo identificirali 22 proteinov knottin (dodatna tabela S3). Šest homologov LhKNOT je bilo podobno identificiranih iz Ganaspis hookeri (G1) in dva homologa LhKNOT sta bila najdena v napovedih beljakovin iz genoma G. brasiliensis (VA) (dodatna tabela S4). Slika 2 prikazuje ohranjanje teh parazitoidnih zaporedij vozlov z LhKNOT. Tako se zdi, da vsaj nekaj parazitoidov Drosophila, vzorčenih v tej študiji, kodira več proteinov vozla. Te ose lahko kodirajo dodatne takšne peptide knottin, za pridobitev celovitega seznama pa so potrebni sistematični proteomski/bioinformatski pristopi. Funkcije teh domnevnih vozlov v fiziologiji parazitov ostajajo neznane.

Slika 1. (A) Poravnava več zaporedij LhKNOT (zgoraj) in homologov v družini knottin (od zgoraj navzdol): Mesembryanthemum crystallinum (rastlina; protimikrobna; NCBI ID: AAC19399), Aceria tosichella (pršica; protimikrobna; NCBI ID :MDE48292.1), Callosobruchus maculatus (hrošč; neznano; NCBI ID:VEN35376.1), Dinothrombium tinctorium (pršica; neznano; NCBI ID:RWS16713.1), Trichogramma pretiosum (Alo{{10}} podobno; parazitoidna osa; protimikrobno; NCBI ID: XP_014233229.1), Ignelater luminosus (hrošč; neznano; NCBI ID: KAF2884324.1), Trichogramma brassicae (parazitoidna osa; neznano; NCBI ID: CAB{{27) }}{{30}}31014.1), Brassicogethes aeneus (hrošč; neznan; NCBI ID: CAH0563829.1), Agrilus planipennis (pepelovka; protimikrobno; NCBI ID : XP_018321119.1), Neodiprion lecontei (žagarica; neznano; NCBI ID: XP_015517007.2), Akanthomyces lecanii (gliva; protiglivično; Uniprot ID: A0A168C5L6), Cordyceps javanica (gliva; protiglivično) ; Uniprot ID: A0A545VVU1), Cordyceps confragosa (gliva; neznana; Uniprot ID: A0A179IJT7), Rosellinia necatrix (gliva; neznano; Uniprot ID: A0A1S8A723), Beauveria bassiana (gliva; neznana; Uniprot ID: A0A0A2VUF6), Acrocinus longimanus (Alo-3; hrošč; protiglivično; PDB ID: 1Q3J) in Pereskia bleo (pB1; kaktus; PDB ID: 5XBD). Enaki ostanki so označeni z rdečo, medtem ko so kemično podobni ostanki označeni z rumeno. Črne puščice označujejo ohranjene cisteinske ostanke, ki so odgovorni za vozlasto strukturno gubo, povezljivost disulfidnega mostu treh disulfidnih mostov pa je označena z neonsko zelenimi številkami.

X in XX označujeta spremenljivo število ostankov na N- oziroma C-koncu. Elementi sekundarne strukture modeliranega LhKNOT so prikazani na vrhu. in T predstavljata -stran oziroma -turn. (B) Napoved sekundarne strukture za LhKNOT, ki prikazuje dolg vijačni segment (rožnati valj; signalni peptid), ki mu sledijo trije beta prameni (rumene puščice). Ta sekundarna struktura sledi kanoničnemu Knottinovemu podpisu [36]. (C) Prototip vozlaste strukturne gube iz zbirke podatkov KNOTTIN [36] (dovoljenje za reprodukcijo te slike je dal dr. Jean-Christophe Gelly, INSERM, oktober 2019). Dva disulfidna mostova (zelena) tvorita makro cikel, medtem ko tretji (modri) vleče skozi središče in daje proteinu istoimensko zavozlano topologijo. (D) Predvidena terciarna struktura LhKNOT, ki prikazuje vozlasto topologijo in ohranjen cisteinski motiv, cisteinski ostanki tvorijo disulfidne mostove v ohranjenem vzorcu, ki ga vidimo v celotni družini vozlov (oblika C1 -C4 in C2 -C5 makro cikel, C3 -C6 vleče skozi sredino).

Slika 2. (A) Večkratna poravnava zaporedja LhKNOT (zgoraj) in homologov v Lh14. (B) Večkratna poravnava zaporedja LhKNOT (zgoraj) in homologov v L. boulardi. X, označen v zelenem polju, ustreza naslednjim vstavkom v dveh zaporedjih Lb17: Lb: GISX01151661.1 X=SQAPPPTPEFHPPGTPP; Lb: GISX01151653.1 X=SQLTSPRSTFPPTGSTIPSIITT. (C) Večkratna poravnava zaporedja LhKNOT (zgoraj) in homologov v Ganaspis spp. Enaki ostanki so označeni z rdečo, medtem ko so kemično podobni ostanki označeni z rumeno.

Črne puščice označujejo ohranjene cisteinske ostanke, ki so odgovorni za vozlasto strukturno gubo, povezljivost disulfidnega mostu treh disulfidnih mostov pa je označena z neonsko zelenimi številkami. Elementi sekundarne strukture modeliranega LhKNOT so prikazani na vrhu. in T predstavljata -stran oziroma -turn. Sive zvezde so dodane na vrhu blokov sekvenc, zgornji ostanki predstavljajo ostanke, modelirane z alternativnimi konformacijami.

2.2. Tridimenzionalna struktura LhKNOT

Tipično strukturno gubo peptida vozla definira šest cisteinov, vključenih v tri disulfidne vezi, da tvorijo s cisteinom zavozlano triverižno antiparalelno beta ploščo [25]. Pomembna značilnost te gube je povezljivost cisteinskih ostankov, da tvorijo disulfidne mostove, in disulfidni most cisteinov 3 in 6, ki gre skozi disulfide 1–4 in 2–5, da nastane poseben disulfid skozi disulfidni vozel (slika 1A, C ).

Ta disulfid s funkcijo disulfidnega vozla razlikuje vozlovsko gubo od drugih proteinov cisteinskega vozla. Razen ohranjenih cisteinov je preostalo aminokislinsko zaporedje lahko precej spremenljivo, zato je le omejeno število vozlov identificirano s pristopi podobnosti zaporedja za LhKNOT (glejte prejšnji razdelek in dodatno tabelo S1).

Algoritmi za prepoznavanje zgibov in pristopi modeliranja, ki temeljijo na predlogah, so po drugi strani pridobili več različnih vozlov kot primernih kandidatov za modeliranje LhKNOT. Med različnimi ustvarjenimi modeli LhKNOT je bil najboljši model LhKNOT, ki temelji na več predlogah, ustvarjen s programom HHpred [37] s strukturnimi omejitvami, izpeljanimi iz najboljših treh predlog, Alo-3 (PDB: 1Q3J) [ 30], omega-agatoksin-IVA (PDB: 1IVA) [28] in PAFP-S (PDB: 1DKC) [25]. Na znanju temelječi energijski profili, izračunani z uporabo ProSA-web [38] za ta izbrani model, so pokazali nizke energije in z-rezultat −4,53, kar je primerljivo z rešenimi strukturami.

Verify3D [39] je ta model, ki temelji na več predlogah, ocenil s prehodno oceno (100.00 odstotkov ostankov v modelu ima povprečno 3D-1 D ocena večja ali enaka 0,2). Rezultat VoroMQA [40] 0,325 je verjetno odraz majhnosti peptida in rezultati predlog so bili v istem razponu (dodatna slika S1).

Ta model, ki temelji na več šablonah, ponazarja vozlasto gubo s tremi antiparalelnimi beta prameni, omejenimi z disulfidnimi mostovi in ​​pričakovano povezljivostjo disulfidnih mostov (slika 1D). KNOTER3D, orodje v podatkovni zbirki KNOTTIN [36] je potrdilo, da ima ta model verodostojno pregib vozla, in potrdilo predhodno identificiran vzorec disulfidne vezi na sliki 1D.

2.3. LhKNOT kaže prisotnost CPC sponke, ki je sposobna interakcije s heparinom in drugimi GAG

Za iskanje potencialnih funkcij LhKNOT so bile raziskane korelacije med strukturo in funkcijo tesnih strukturnih homologov LhKNOT. Protein knottin iz kaktusa Pereskia bleo (PDB: 5XBD) [26] ima motiv za vezavo heparina, znan kot CPC posnetek. Ta strukturni motiv tvori geometrijsko omejeno sponko dveh kationskih in enega polarnega ostanka, ki medsebojno delujejo s heparinom s solnimi mostovi in ​​vodikovimi vezmi, ki ga pritrdijo na položaj znotraj pozitivno nabite površine sponke [41].

Strukturna superpozicija cactus knottin in LhKNOT je pokazala, da sta si strukturi zelo podobni, s skupno razliko manj kot 2Å. Docking analiza LhKNOT s heparinom z uporabo specifičnih parametrov ClusPro za heparin kot ligand je pokazala, da se za LhKNOT polarne interakcije, ki ustrezajo motivu posnetka CPC, pojavljajo v ostankih R1-S3-R14 (slika 3A) .

Izmerjene razdalje (tako med alfa-ogljiki kot središči mase sodelujočih stranskih verig ostankov) so se razlikovale od razdalj CPC posnetka za manj kot 1Å, kar kaže na prisotnost domnevnega CPC posnetka v LhKNOT (slika 3B). Površinska elektrostatika modeliranega LhKNOT je prav tako pokazala prisotnost pričakovanega kationskega veznega žepa, ki ga tvori sponka CPC [41, 42] (slika 3C).

Za oceno zmožnosti CPC posnetka za interakcijo z drugimi GAG je bila izvedena dodatna analiza priklopa z LhKNOT in keratan sulfatom (PDB ID: 1KES) ter z LhKNOT in hialuronsko kislino (PDB ID: 1HYA). V obeh primerih je pozitivno nabita vezna površina, ki jo ustvari CPC sponka, vezana na negativno nabite molekule. Ligploti, ki jih je ustvaril PDBSum, so potrdili povezavo GAG z ostanki, ki tvorijo CPC (dodatni sliki S2 in S3).

2.4. Drugi strukturni homologi LhKNOT vsebujejo tudi motiv CPC sponke

Prisotnost CPC posnetka v LhKNOT in njegovem strukturnem homologu iz Pereskia bleo (pB1) je nakazala možnost širšega ohranjanja CPC posnetka v družini knottin. Analiza 21 tesnih strukturnih homologov LhKNOT z eksperimentalno rešenimi PDB-ji v bazi podatkov KNOTTIN je pokazala, da imajo peptidi v vsakem primeru motiv CPC posnetka. Pri večini peptidov (npr. T. tridentatus) so parametri motiva odstopali manj kot 1 Å od pregiba jedrnega vozla, medtem ko je pri drugih (npr. žaljivi vozli) odstopanje znašalo do meje 3 Å (dodatna tabela S5). Podobno so modelirani proteini knottin identificiranih homologov pokazali, da so skoraj vsi imeli CPC posnetek.

Šestnajst dodatnih zaporedij iz L. heteroatom, 22 zaporedij iz L. boulardi in 8 zaporedij iz Ganaspis spp., brez znanih 3D struktur, je bilo modeliranih in analiziranih za prisotnost motiva posnetka CPC. Medtem ko je 13 od 16 domnevnih L. heteroatomskih vozlov in 20 od 22 domnevnih L. boulardi vozlov razkrilo motiv posnetka CPC, so vse sekvence Ganaspis vsebovale posnetek CPC (dodatna tabela S5). Zanimivo je, da sedem homologov, ki niso pokazali motiva posnetka CPC, pripada (a) zaporedju navadnega cvetnega prahu (B. aeneus (CAH0563829.1), (b) zaporedju gliv R. necatrix (A0A1S8A723) in (c) trem L. heterotoma knottins 4,5,6 in L. boulardi knottins 3 in 20 (dodatna tabela S5).

Raziskava vozlov v podatkovni zbirki KNOTTIN, ki ni povezana z LhKNOT, vendar predstavlja različne taksone (polž storž, podkovnjak, žuželka, rastlina, škorpijon in pajek), je pokazala motiv CPC posnetka. V vseh primerih je površinski elektrostatični profil motiva CPC sponke pozitivno nabit, kar verjetno olajša interakcije z negativno nabitim heparinom (slika 4). Vendar, podobno kot zgoraj opisani vozli hroščev, gliv in os, posnetek CPC ni bil identificiran v vozlih iz rastlinskega ciklotida in spužev (dodatna tabela S5).

Slika 4. Rezultati priklopa s heparinom in površinska elektrostatika (A) protiglivičnega peptida Phytolacca americana (PFAP-s; rastlina; PDB: 1DKC), (B) selektivnega omega-agatoksina Agelenopsis aperta (Omega-agatoksin IV-A) ; pajek; PDB: 1IVA), (C) protiglivični peptid Acrocinus longimanus (Alo-3; hrošč; PDB: 1Q3J), (D) peptid Pereskia bleo za celjenje ran (pB1; kaktus; PDB: 5XBD) , (E) LhKNOT, (F) protiglivični peptid "Drosomycin" Drosophila spp. (Drosomycin; muha; PDB: 1MYN), (G) konotoksin GS (Conotoxin GS; stožčasti polži; PDB:1AG7), (H) protimikrobni peptid tahistatin A, izoliran iz podkovnjakov (Tahistatin A; podkovnjaki; PDB:1CIX) in (I) Klorotoksin, majhen škorpijonov toksin Leiurus quinquestriatus (Chlorotoxin; škorpijon; PDB:1CHL), ki prikazuje motiv kationskega CPC posnetka. Slike so usmerjene tako, da najbolje prikazujejo strukturo posnetka CPC. Površinski elektrostatični potenciali so barvno razvrščeni od –4 kT/e (rdeča) do plus 4 kT/e (modra).

2.5. In Silico mutacijska analiza LhKNOT CPC posnetka razkriva sekundarni CPC posnetek

Raziskali so modele treh in silico LhKNOT mutantov (R1A, S3A, R14A), da bi primerjali vezavne interakcije divjega tipa in mutantnih proteinov. V primeru mutanta R14A se je pokazalo, da je heparin presenetljivo povezan s sekundarnim CPC posnetkom, ki vključuje ostanke R1, S3 in R30 namesto motiva R1, S3 in R14 v divjem tipu (dodatna slika S4). Dvojni ali trojni mutanti (R14A-R1A; R14A-S3A-R1A) pa niso pokazali interakcije z nobenim od primarnih ali sekundarnih ostankov motiva posnetka CPC (dodatna slika S4C, D).

Mutanti in silico z mutacijo R1A (ki prekinejo tako primarni kot sekundarni motiv CPC posnetka) pa so pokazali, da se heparin povezuje z R29 in R30, saj zagotavljajo edino preostalo kationsko površino (dodatna slika S4C, D). Zanimivo je, da se ligand raje povezuje z motivom CPC sponke, tako v primeru primarnih kot sekundarnih sponk, prek te dodatne kationske površine, ko je motiv na voljo, kar nakazuje, da lahko specifična interakcija sponke CPC omogoči bolj stabilno povezavo preko nespecifična elektrostatična interakcija.

For more information:1950477648nn@gmail.com