In vitro in in silico vpogled v zaviralce tirozinaze
Mar 28, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com
Hee Jin Jung a,b,c, Sang Gyun Noh a,b,c, Yujin Park a, Dongwan Kang a, Pusoon Chun d, Hae Young Chung a,b,c,⇑,Hyung Ryong Moon a
Povzetek
Tirozinaza je ključni encim, ki je odgovoren za biosintezo melanina in je učinkovit pri zaščiti poškodb kože, ki jih povzroča ultravijolično sevanje. Kot del nenehnih prizadevanj za odkrivanje močnih zaviralcev tirozinaze smo sistematično oblikovali in sintetizirali trinajst (E)-benziliden-1-indanon derivatov (BID1–13) in določili njihovo inhibitorno delovanje proti tirozinazi. Med ocenjenimi spojinami je bil BID3 najmočnejši zaviralec gobje tirozinaze (IC50=0.034 mM, aktivnost mikofenolatov; IC{50=1.39 mM, aktivnost difenolov). Kinetične študije so pokazale, da je BID3 pokazal mešano vrsto inhibicije tirozinaze z vrednostjo Ki 2,4 mM z uporabo L-DOPA kot substrata. Simulacije molekularnega priklopa in silico so pokazale, da se BID3 lahko veže na katalitična in alosterična mesta tirozinaze, da zavira encimsko aktivnost, kar je potrdilo eksperimentalne študije in vitro med BID3 in tirozinazo. Poleg tega se je po zdravljenju z BID3 vsebnost melanina zmanjšala in aktivnost celične tirozinaze je bila zavrta. Ta opažanja so razkrila, da je BID3 močan zaviralec tirozinaze in bi se potencialno lahko uporabljal kot belilno sredstvo za zdravljenje motenj, povezanih s pigmentacijo.
Cistanche: zelišče za beljenje kože
1. Uvod
Melanin, ki ga sintetizirajo melanociti v vazalnem sloju povrhnjice, se na splošno nanaša na družino pigmentov, ki so splošno znani po tem, da ščitijo kožo sesalcev pred poškodbami, ki jih povzroči škodljivo UV-sevanje z lovljenjem prostih radikalov ali razprševanjem vhodne UV-svetlobe [1]. Vendar pa lahko obilno nastajanje melanina povzroči vidno hiperpigmentacijo povrhnjice, ki je lahko očitna kot melazma, pege, starostne pege ali senilni lentigin [2].
Tirozinaza (EC 1.14.18.1), metaloencim, ki vsebuje baker, je ključni encim, vključen v melanogene procese. Tirozinaza katalizira dva koraka, ki omejujeta hitrost, v melanogenezi; hidroksilacija tirozina (aktivnost krezolaze ali mikofenolata) za proizvodnjo 3,4-dihidroksifenilalanina (L-DOPA) in kasnejša oksidacija L-DOPA (aktivnost kateholaze ali difenolov) v ustrezen DOPA-kinon. Kadar je substrat L-tirozin, je produkt reakcije, ki jo katalizira tirozinaza, DOPA-kinon, ki se nato pretvori v melanin [3]. Ti koraki so ključni za zaščito kože pred UV žarki. Goba Agaricus se uporablja za svojo komercialno dostopno in visoko homologijo z encimom tirozinaze sesalcev, zaradi česar je zelo primerna kot model za študije melanogeneze [4]. Pri ljudeh melanin pomaga zaščititi kožo pred poškodbami, ki jih povzroča UV [5]. Vendar pa lahko prekomerna raven melanina povzroči različne dermatološke motnje, vključno s hiperpigmentacijami, melazmo, pegami in starostnimi pegami [6]. Zato so za zaviranje čezmerne pigmentacije kože potrebni inhibitorji nove tirozinaze, ki kažejo lastnosti podobnih zdravilu in lastnosti beljenja kože.
1-Indanon z benzoil-ciklopentanonskim skeletom velja za togega bratranca halkonov, ki vključuje nenasičen ketonski sistem halkonov, ki tvorijo ciklični 5-členski obroč, ki je naravno prisotna komponenta v različnih užitnih rastlinskih virih [7 ]. Več študij je pokazalo, da imajo spojine, ki imajo 1-indanon del, farmakološki pomen, saj kažejo različne koristne biološke aktivnosti, vključno s protivnetnimi [8–10], proti raku [11,12], antioksidativnimi [13], proti Parkinsonovi bolezni bolezen [14], anti-Alzheimerjeva bolezen [15–17], protimikrobne [18], protiimunske zaviralne [19] in anti-tirozinazne [20] lastnosti.
Halkoni (1,3-diaril-2-pravi-1-oni) so aromatski ketoni, sestavljeni iz dveh aromatskih obročev, povezanih s triogljikovim a,b-nenasičenim karbonilnim sistemom kot osrednjim jedrom [21, 22]. To so naravno prisotne komponente, ki jih najdemo v različnih užitnih naravnih rastlinah in veljajo za predhodne spojine za sintetično pot flavonoidov in izoflavonoidov, kot so pirazolini, pirimidin, flavanol, flavoni, flavanoni, izoflavoni, auroni, antocianidin, dihidroflavanol in dihidrohalkon [23–25]. Nenasičeni karbonilni sistem a,b je bistvenega pomena za vrsto biološke aktivnosti, saj so ti sistemi porazdeljeni v številnih naravnih produktih, kot so halkoni in indanon, kjer so molekule relativno bolj ravninske in je prenos elektronskih učinkov arilnih substituentov usmerjen na karbonilno skupino [7]. Prejšnji številni raziskovalci so poročali, da so bili halkoni v več publikacijah označeni kot nov razred zaviralcev tirozinaze [26–29]. Pred kratkim so Kim in sodelavci [30,31] zasnovali in sintetizirali vrsto derivatov kalkona in jih ocenili za njihovo in vitro proti- tirozinaze in antimelanogenih aktivnosti proti mišjim melanocitom.
Po naših predhodno objavljenih podatkih so derivati z (E)-b-fenil-a,b-nenasičenim karbonilnim ogrodjem pokazali močno inhibicijo tirozinaze [32–34]. (E)-Benziliden-1-indanoni so lahko privlačno antimelanogeno sredstvo, saj imajo spojine v svoji kemični strukturi (E)-b-fenil-a,b-nenasičeno karbonilno ogrodje. Zlasti Radhakrishnan et al. (2015) [20] je zasnoval in sintetiziral vrsto benziliden-1-indanon derivatov, ki nosijo (Z)-konfiguracijo, in jih ovrednotil za anti-tirozinazno aktivnost. Čeprav so bili ti derivati (Z)-benziliden-1-indanona raziskani, je treba antitirozinazne in antimelanogene aktivnosti derivatov (E)-benziliden-1-indanona še natančno preučiti.
Zato smo oblikovali in sintetizirali trinajst spojin (BID1–13) skeleta 1-indanona, ki nosi (E)-obliko benziliden. Med temi sintetičnimi spojinami je 2,4-dihidroksiskupina na obroču B 1-indanona pokazala največjo inhibicijo tirozinaze (približno 400--krat bolj učinkovito kot kojična kislina, pozitivna kontrola). Poleg tega nadalje ocenjujemo inhibitorno aktivnost BID3 tirozinaze in karakteriziramo njegovo regulativno vlogo pri sintezi melanina z uporabo celic melanoma B16F10. V razširjenih poskusih smo ovrednotili antimelanogeni potencial BID3 in skušali identificirati encimsko kinetiko in študije molekularnega povezovanja. V zaporednih poskusih so raziskali tudi potencial celične tirozinaze BID3 in proizvodnjo melanina v celicah melanoma B16F10, ki jih povzroči a-MSH in IBMX.
PROTI OKSIDACIJI IN BELENJU KOŽE: IZVLEČEK CISTANCHE
2. Materiali in metode
2.1. Reagenti
Gobja tirozinaza (EC 1.14.18.1), alfa-melanocite stimulirajoči hormon (a-MSH), 3-izobutil-1-metilksantin (IBMX), L-tirozin, L-3,{{ 11}}dihidroksifenilalanin (L-DOPA), dimetil sulfoksid (DMSO), kojična kislina, ftalna kislina in trans-cimetova kislina so bile kupljene pri Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ZDA). Dulbeccov modificiran Eagleov medij (DMEM), fetalni goveji serum (FBS), streptomicin in amfotericin so bili kupljeni pri WELGENE Inc. (Gyeongsan-si, Južna Koreja). Vsi drugi reagenti so bili kupljeni pri Sigma-Aldrich.
2.2. kemija
2.2.1. Splošne metode
Vsi reagenti so bili komercialno pridobljeni in uporabljeni brez nadaljnjega čiščenja. Tankoplastno kromatografijo (TLC) in kolonsko kromatografijo smo izvedli na ploščah 60F245, predhodno prevlečenih s Merckom, in MP Silica 40–63, 60 Å. Podatki masne spektroskopije z visoko ločljivostjo (HR) so bili pridobljeni na masnem spektrometru s tekočinsko kromatografijo (LC) Agilent AccurateMass s štirimi časi letenja (Q-TOF) (Agilent, Santa Clara, CA, ZDA) v ESI pozitivnem načinu. Spektri jedrske magnetne resonance (NMR) so bili posneti na spektrometru Varian Unity INOVA 400 ali spektrometru Varian UnityAS500 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ZDA) za 1H NMR (400 in 500 MHz) oziroma za 13C NMR (100 MHz) oz. . Kot NMR topila za NMR vzorce smo uporabili DMSO d6, CD3OD in CDCl3. Konstanta sklopitve (J) in vrednosti kemijskega premika so bile izmerjene v hercih (Hz) oziroma delih na milijon (ppm). Okrajšave, uporabljene pri analizi podatkov 1H NMR, so naslednje: s (singlet), bs (široki singlet), d (dublet), dd (dublet dubletov), t (triplet), TD (triplet dubletov), q ( kvartet), andm (več).
2.2.2. Postopek za sintezo BID1–13
Raztopino benzaldehida (1,1–1,2 ekv.) in 1-indanona (100 mg, 0,76 mmol) v 1 M v HCl ocetni kislini (0,4 ml) smo mešali pri sobni temperaturi za 4–48 h. Po dodatku vode smo oborino filtrirali in sprali z vodo in heksan:etilacetat (1:1), heksan:diklorometan (4:1–1:1) ali mešanico diklorometana in metanola, odvisno od lastnosti preostalih benzaldehidov. da dobimo (E)-benziliden-1-indanone (BID1–13) v dobitkih 32,8–99,1 odstotka. Strukturna karakterizacija (1H in 13C NMR in podatki o masi vseh BID) sintetiziranih spojin je podana v Dodatnih informacijah.
2.2.2.1. (E)-2-(4-Hidroksibenziliden)-2,3-dihidro-1H-inden-1-on(BID1).
Rumena trdna snov; donos 93,4 odstotka; reakcijski čas, 6 h; molekulska formula, C16H12O2; tališče 224,7-225,9 C; 1H NMR (400 MHz, DMSO d6) d 10,10 (s, 1H, OH), 7,72 (d, 1H, J=7.6 Hz, 7- H), 7,64–7,58 (m, 4H, 4-H, 5-H, 20-H, 60-H), 7,43 (s, 1H, vinilni H), 7,39 (t, 1H, J=7,2 Hz, 6-H), 6,87 (d, 2H, J=8,0 Hz, 30-H, {{46 }}H), 3,99 (s, 2H, CH2); 13C NMR (100 MHz, DMSO d6) d 193,9, 160,1, 150,4, 138,3, 135,1, 134,0, 133,6, 132,2, 128,2, 127,2, 126,7, 124,1, 116,7, 32,6; HRMS (ESI z 1MH plus) m/m/z H) plus izračunano 237,0910, obsd 237,0911.
2.2.2.2. (E)-2-(3,4-dihidroksibenziliden)-2,3-dihidro-1H-inden-1-on (BID2).
Rumena trdna snov; donos, {{0}}.6 odstotkov ; reakcijski čas, 5 h; molekulska formula, C16H12O3; tališče 251,2–252,4 °C; 1H NMR (400 MHz, DMSO d6) d 9,65 (s, 1H, OH), 9,24 (s, 1H, OH), 7,72 (d, 1H, J=7 0,6 Hz, 7-H), 7,66–7,61 (m, 2H, {{30}}H, 5-H), 7,42 (t, 1H,J {{35) }}.2 Hz, 6-H), 7,35 (s, 1H, vinilni H), 7,19 (s, 1H, 20-H), 708 (d, 1H , J=8,0 Hz, 60-H), 6,83 (d, 1H, J=8,0 Hz, 50-H), 3,98 (s, 2H,CH2 ); 13C NMR (100 MHz, DMSO d6) d 193,8, 150,4, 148,7, 146,3, 138,3, 135,1, 134,5, 132,0, 128,2, 127,3, 127,1, 125,0, 124,0, 118,2, 116,7, 32. HRMS (ESI plus) m/z C16H13O3 (M plus H) plus izračunano 253,0859, obsd 253,0857.
2.2.2.3. (E)-2-(2,4-dihidroksibenziliden)-2,3-dihidro-1H-inden-1-on (BID3).
Rumena trdna snov; donos, 5{{20}}.9 odstotkov; reakcijski čas, 10 h; molekulska formula, C16H12O3; tališče 198,5–199,9 °C (razpad); 1H NMR (500 MHz, CD3OD) d 8,17 (s, 1H, vinilni H), 7,82 (d, 1H, J=8,0 Hz, 60-H), 7,67–7,63 (m, 3H , 4-H, 5-H, 7-H), 7,45 (t, 1H, J=7,0 Hz, 6-H), 6,45 (d , 1H, J=8.5 Hz, 50-H), 6,39 (s, 1H, 30-H), 4,01 (s, 2H, CH2); 13C NMR (100 MHz, DMSO d6) d 193,9, 161,6, 160,4, 150,3, 138,6, 134,8, 131,7, 130,3, 128,7, 128,1, 127,2, 123,9, 114,3, 108,6, 103,7, 32. HRMS (ESI plus) m/z C16H13O3 (M plus H) plus izračunano 253,0859, obsd 253,0858.
2.2.2.4. (E)-2-(4-Hidroksi-3-metoksibenziliden)-2,3-dihidro-1Hinden-1-on (BID4).
Rumena trdna snov; donos, 52.0 odstotkov; reakcijski čas, 4 h; molekulska formula, C17H14O3; tališče 186,9-187,4 °C; 1H NMR (400 MHz, DMSO d6) d 9,71 (s, 1H, OH), 7,73 (d, 1H, J=7.6 Hz, 7- H), 7,67–7,62 (m, 2H, 4-H, 5-H), 7,45 (d, 1H, J=2.{{50}} Hz , 20-H), 7,43 (t, 1H, J=7.2 Hz, 6-H), 7,31 (s, 1H, vinilni H), 7,24 (dd, 1H, J=8.0,2.0 Hz, 60-H), 6.87 (d, 1H, J=8.0 Hz, 50-H), 4.05 (s, 2H, CH2 3,84 (s, 3H, OCH3); 13C NMR (100 MHz, DMSO d6) d 193,9, 150,5, 149,7, 148,5, 138,3, 135,2, 134,4, 132,3, 128,2, 127,3, 127,1, 125,7, 124,1, 116,6, 115,3, 36. HRMS (ESI plus) m/z C17H15O3(M plus H) plus izračunano 267.1016, obsd 267.1016.
2.3. Biološka ocena
2.3.1. Inhibicijski test gobove tirozinaze
Test inhibitorne aktivnosti tirozinaze je bil izveden z uporabo gobje tirozinaze, kot je opisano prej, z manjšimi spremembami [35,36]. Na kratko, 10 mL določene koncentracije vsake spojine (0,0005–50 mM) in 20 mL gobje tirozinaze (1000 enot/mL) v 50 mM fosfatnem pufru (pH 6,5) smo dodali 170 mL reakciji zmes v 96-mikroplošči z vdolbinicami (Corning, ZDA). Razmerje 1 mM raztopine L-tirozina ali L-DOPA, 50 mM pufra kalijevega fosfata (pH 6,5) in destilirane vode je bilo 10:10:9. Reakcijske mešanice smo inkubirali pri 37 °C 30 minut. Po tem smo količino proizvedenega dopakroma v vsaki vdolbinici izmerili s spektrofotometrično analizo pri 492 nm (OD492) z uporabo bralnika mikroplošč. Stopnja inhibicije tirozinaze (v odstotkih) je bila izračunana kot (1 Absample/Abscontrol) 100 odstotkov. Stopnja inhibicije vzorca je bila izražena kot koncentracija, potrebna za 50-odstotno inhibicijo (IC50).
2.3.2. Encimska kinetična analiza s tirozinazo
Za določitev kinetičnih mehanizmov inhibicije sta bili uporabljeni dve komplementarni kinetični metodi: Lineweaver–Burk in Dixonplots [37–39]. Z uporabo Lineweaver-Burkovih grafov (dvojne recipročne ploskve) je bil določen tip inhibicije BID3 z uporabo različnih koncentracij L-DOPA (0.125, 0.25, 0.5 in 1 mM), kot substrati, v odsotnosti in prisotnosti različnih koncentracij BID3 (1, 2 in 4 lM). Dixonov graf (enojne recipročne ploskve) inhibicije fortirozinaze je bil pridobljen v prisotnosti različnih koncentracij L-DOPA (0.125, 0.25, 0.5 in 1 mM ). Koncentracije BID3 so bile 1, 2 in 4 mM. Encimski postopki so bili sestavljeni iz predhodno opisanih testnih metod tirozinaze. Inhibicijska konstanta (Ki) je bila določena z interpretacijo Dixonovih grafov.
2.3.3. Simulacije molekularnega priklopa tirozinaze
Za določitev strukture kompleksa encim-inhibitor in za zagotovitev točnosti, ponovljivosti in zanesljivosti rezultatov priklopa smo uporabili programsko opremo AutoDock4.2. Za študije dickinga so bile kristalne strukture tarče proteina gobove tirozinaze pridobljene iz poravnave proteinskega zaporedja (Protein Data Bank (PDB ID: 2Y9X) (http://www.rcsb.org/adb) [40]. Izvedene so bile avtomatizirane simulacije priklopa med tirozinazo in kojično kislino, ftalno kislino, cimetovo kislino ali BID 3. Za postopek spajanja: pretvorite 2D v 3D strukture, izračunajte naboje in dodajte vodikove atome s programom ChemOffice (http://www.cam bridgesoft.com) [41 LigandScout 4.1.5 je bil uporabljen za napovedovanje možnih interakcij med ligandi in tirozinazo ter identifikacijo farmakoforjev.
2.3.4. Celična kultura in test viabilnosti celic
Celice mišjega melanoma B16F10 smo kupili pri korejski banki celičnih linij (KCLB, Seul, Koreja) in jih gojili v DMEM, dopolnjenem z 10 odstotki FBS in 1 odstotkom streptomicina, nato pa jih inkubirali pri 37 °C, navlažili s 5 odstotki atmosferskega CO2. Analize viabilnosti celic so bile izvedene, kot je opisano prej [42]. Na kratko, celice zasejane pri gostoti 1104 celic/vdolbino v 96-plošči z vdolbinicami 24 ur. Naslednji dan smo celice izpostavili različnim koncentracijam BID3 in jih inkubirali 24 oziroma 48 ur. Nato smo v vsako vdolbinico dodali 10 ml raztopine EZ-Cytox in celice inkubirali 2–4 ure. Absorbanco smo določili z uporabo ELISA pri valovni dolžini 450 nm. Vsak test je bil izveden v trojniku.
2.3.5. Analiza vsebnosti melanina
Vsebnost melanina je bila določena, kot je opisano prej [43]. Celice melanoma B16F10 (2 105 celic/vdolbino) so bile posejane v 6-plošče za kulture vdolbinic. Za določitev inhibitornega učinka BID3 na melanogenezo smo svež medij nadomestili z medijem, ki je vseboval BID3 (1, 5 in 10 lM) ali kojično kislino (10 mM) kot pozitivno kontrolo za 1 uro, nato pa stimulirali z a-MSH (5 lM ) in IBMX (200 mM) 48 h. Po dvakratnem izpiranju s PBS smo celice ločili z inkubacijo v tripsin/EDTA in pelete raztopili v 100 mL 1 N NaOH in nato inkubirali pri 60 °C za enoročno mešanje, da se raztopi melanin. Vsebnost melanina smo določili z merjenjem absorbance pri 405 nm z uporabo čitalnika ELISA (TECAN, Sunrise, Avstrija). Vsebnost melanina je bila izračunana z uporabo naslednje enačbe: (vzorec/kontrola) - 100 odstotkov. Vse določitve so bile izvedene v treh izvodih.
2.3.6. Aktivnost celične tirozinaze
Aktivnost celične tirozinaze je bila ocenjena, kot je opisano prej, z rahlimi spremembami [44, 45]. Na kratko, 2 105/celic smo nasadili v 6-posodice z vdolbinicami in inkubirali čez noč. Celice so bile 1 uro izpostavljene različnim koncentracijam BID3 (1, 5 in 10 mM) orkojične kisline (10 mM) in nato 48 ur stimulirane z a-MSH (5 mM) in IBMX (200 mM). Po dvakratnem izpiranju s PBS smo celice lizirali s 100 ml raztopine za lizo, ki je vsebovala 50 mM fosfatnega pufra (pH 6,5), 0,1 mM fenilmetilsulfonilfluorida (PMSF) in 1 odstotek Tritona X -100 ter jih zamrznili pri 80 C za 30 minut. Lizate smo odmrznili in centrifugirali pri 12,000 rpm 30 minut pri 4 C. Nato smo supernatant (80 mL) združili z 2 mg/mL L-DOPA (20 mL) v 96-plošči z vdolbinicami . Po 30-minutni inkubaciji pri 37 C smo izmerili optično gostoto pri 492 nm z ELISA čitalnikom (TECAN, Salzburg, Avstrija). Koncentracijo beljakovin smo določili z reagentom za analizo beljakovin BCA z uporabo BCA kot standarda (Thermo Scientific, Rockford, IL, ZDA).
Korist izvlečka Cistanche: zavira tirozinazo.
2.3.7. Statistična analiza
Vsi podatki so predstavljeni kot povprečje ± standardna napaka povprečja (SEM). Podatke smo analizirali z enosmerno analizo variance (ANOVA), da bi ugotovili razlike med zdravljenji, čemur je sledil Bonferronijev posthoc test. Vrednost p < 0,05="" je="" veljala="" za="" statistično="">
3. Rezultati in razprava
3.1. kemija
Derivati (E)-benziliden-1-indanona (BID1–13) so bili sintetizirani v skladu s splošno shemo 1. V tej pričujoči študiji je bilo sintetiziranih trinajst derivatov (E)-2-benziliden-1-indanona in njihovi preučevali so inhibitorne lastnosti tirozinaze. Ciljni (E)-2-benziliden-1-indanon derivati so bili sintetizirani z uporabo kislih (1 M HCl v ocetni kislini) pogojev. Te reakcije so ustvarile ciljni (E)-2-benziliden-1- derivatov indanona z izkoristki 32,8–99,1 odstotka. Videti je, da so samo E-izomeri 2-benziliden-1-indanona nastali zaradi A-seva, znanega kot 1,3-alilni sev. A-sev (sterihindranca) med fenilnim obročem in karbonilno skupino v Z-izomeru je očitno večji od tistega med fenilnim obročem in metilensko skupino v E-izomeru. Strukture sintetičnih spojin so bile preverjene z 1H in 13C NMR in masno spektrometrijo, kot je opisano v eksperimentalnem delu (sliki S1–S38). Zlasti je kemijski premik olefinskega protona zaščiten v E-izomeru 2- benziliden zaradi anizotropnega učinka karbonilne skupine in se zdi v nizkem polju (nad 7 ppm) v primerjavi z izomerom Z (<7 ppm)="" [46].="" the="" chemical="" shifts="" of="" olefinic="" protons="" in="" the="" benzylidene-1-indanones="" appeared="" in="" the="" range="" of="" 7.31–8.17="" ppm.="" therefore,="" the="" benzylidene-1-indanone="" derivatives="" were="" determined="" to="" be="" (e)-stereoisomers.="" we="" found="" that="" the="" presence="" of="" hydroxyl="" or="" methoxyl="" group="" at="" the="" 2-position="" of="" the="" phenyl="" ring="" moves="" the="" chemical="" shift="" of="" the="" olefinic="" proton="" to="" 0.5–0.8="" ppm="">
Shema 1. Sinteza (E)-2-benziliden-1-indanonov.
3.2. Lastnosti spojin, ki zavirajo tirozinazo
Inhibicijski potencial za tirozinazo derivatov (E)-benziliden-1-indanona je bil raziskan z uporabo gobje tirozinaze. Mikofenolat (L-tirozin) in difenoli (L-DOPA) so bili uporabljeni kot substrati za te poskuse [35]. Encimske reakcije so bile izvedene s tirozinazo, substratom in testnimi inhibitorji. Vse testirane spojine so pokazale od koncentracije odvisno inhibicijo. Vrednosti IC50 (E)-benziliden-1-indanonskih derivatov so prikazane v tabeli 1.
V substratih L-tirozina in L-DOPA je BID3 pokazal močno zaviralno aktivnost z vrednostmi IC50 0.{{10}}34 ± 0.{{ 27}}224 mM oziroma 1,39 ± 0.00004 mM v primerjavi s pozitivno kontrolno kojično kislino, ki je imela vrednosti IC50 13,77 ± 0,20 mM oziroma 33,14 ± 0,93 mM (Slika 1A). Poleg tega je BID6 pokazal močno aktivnost proti L-tirozinu in L-DOPA z vrednostmi IC50 5,00 ± 0,91 mM oziroma 53,11 ± 2,79 mM. BID1 je pokazal pomembno inhibicijo proti tirozinazi prek poti L-tirozina in L-DOPA z vrednostmi IC50 39,74 ± 3,71 mM oziroma 130,0 ± 5,39 mM. BID4 in BID11 sta pokazala zmerno inhibitorno aktivnost za tirozinazo. Drugi derivati so bili neaktivni. Podobno je BID2 pokazal pomembno aktivnost proti L-tirozinu in L-DOPA, z vrednostmi IC50 41,27 ± 3,03 mM in 52,93 ± 2,62 mM. Poleg tega poročani inhibitorji mešanega tipa, ftalna kislina in cimetova kislina, niso pokazali zaviralnih učinek pri koncentraciji 200 mm [47].
V skladu z ugotovitvami študij razmerja med strukturo in aktivnostjo (SAR) so derivati, ki vsebujejo (E)-benziliden-1-indanonske substituente na fenilnem obroču, opazno vplivali na potencialno inhibicijo tirozinaze. BID3, ki je zaviral tirozinazo z največjo močjo, nosi 2-hidroksi skupino v prisotnosti 4-hidroksi skupine in močno zavira aktivnost tirozinaze (BID1 proti BID3). Ti rezultati kažejo, da je lahko 2,4-dihidroksi skupina (rezorcinolni del) v strukturi fenilnega obroča odgovorna za povečano inhibicijo tirozinaze. Zanimivo je, da smo v prejšnji študiji o potencialnih sintetičnih inhibitorjih tirozinaze pokazali, da 2,4-dihidroksi substitucija močno zavira aktivnost tirozinaze [48,49]. Poleg tega so naši podatki SAR tudi pokazali, da uvedba 3-hidroksi skupine v prisotnosti 4-hidroksi skupine vpliva na zaviranje tirozinaze. Ti pojavi so bili dokazani z ugotovitvijo, da je 4-metoksi-3-hidroksi fenilni obroč povečal inhibitorno aktivnost proti tirozinazi, medtem ko je uvedba 3,4-dihidroksi skupine (kateholni del) zmanjšala inhibitorno aktivnost tirozinaze ( BID2 proti BID6) [35]. Ti rezultati kažejo, da je 3-hidroksi-4-metoksi skupina odgovorna tudi za inhibitorno aktivnost tirozinaze. Kljub temu sta v naši trenutni študiji BID9 in BID11, ki vsebujeta 2,4-dimetoksi fenilne ali 3,5-dimetoksi fenilne skupine, pokazala zmerno inhibitorno aktivnost tirozinaze. Na podlagi vrednosti IC50 po poti L-tirozina in L-DOPA je BID3 pokazal najmočnejšo inhibitorno aktivnost tirozinaze, zato smo nadalje preučevali mehanizem, na katerem temelji ta inhibitorni učinek. Radhakrishnan et al. (2015) [20] so poročali, da so hidroksilno substituirane (Z)-benziliden-1-indanone spojine močni inhibitorji tirozinaze. Čeprav so prejšnje študije pokazale, da imajo hidroksil substituirani (Z)-benziliden-1-indanon derivati antitirozinazno aktivnost, kolikor nam je znano, ni bilo poročil o zaviranju tirozinaze z (E)-benzilidenom-1- indanonovih derivatov z uporabo celičnih poskusov.
Tabela 1. Zaviralni potencial gobove tirozinaze substituiranega 2,3-dihidro-1H-inden-1-ona (1-indanona), podobnega halkonu
izvedenke (BID1–13).
Slika 1. Od koncentracije odvisno zaviranje aktivnosti gobove tirozinaze z BID3 in kojično kislino (pozitivna kontrola) (n=3).
3.3. Encimska kinetična analiza inhibicije tirozinaze
Ker je bil BID3 najmočnejši zaviralec, smo nadalje proučevali mehanizem, na katerem temelji njegov zaviralni učinek. V poskusu razlage načina inhibicije encimov so bile izvedene kinetične analize pri različnih koncentracijah L-DOPA in različnih koncentracijah BID3. Dixon in Lineweaver-Burk ploskvi sta bili narisani z uporabo podatkov, dobljenih iz kinetičnih študij, da bi potrdili vzorec inhibicije, inhibicijske konstante (Ki) pa so bile določene z interpretacijo Dixonovih grafov (sl. 2A in B). Koncentracija L-DOPA je označena kot sledi: 1, 2, 4 mM. Presek leži na levi strani, kar kaže na inhibicijo mešanega tipa proti tirozinazi z vrednostjo Ki 2,4 mM (slika 2B). Vrednost Ki predstavlja koncentracije, ki so potrebne za tvorbo kompleksa encim-inhibitor, tako da inhibitor z nižjo vrednostjo Ki kaže na večjo aktivnost inhibicije tirozinaze.
Molekularno združevanje je v mnogih letih prispevalo pomembne vpoglede v odkrivanje zdravil. Vendar pa so postopki priklopa namenjeni identifikaciji pravilnih položajev ligandov v veznem žepu aproteina in predvidevanju afinitete med ligandom in proteinom. Z drugimi besedami, združevanje opisuje proces, skozi katerega se dve molekuli prilegata skupaj v tridimenzionalnem prostoru. Da bi ugotovili, ali se BID3 veže na aktivno mesto tirozinaze, je bila izvedena analiza molekularnega priklopa, da bi se identificirali možni vezni položaji BID3 v kristalni strukturi gobje tirozinaze (PDB ID: 2Y9X) (slika 3A). Ti rezultati so bili izračunani s programom AutoDock4.2. program. Najbolj stabilen vezni položaj je bil tisti z najnižjo oceno [50]. Pred kratkim so Hassani et al. [47] so poročali, da sta cimetova kislina in ftalna kislina mešani inhibitorji tirozinaze. Tako so bili aid, cimetova kislina in ftalna kislina uporabljeni za validacijo rezultatov priklopa [51]. Modela molekularnega priklopa BID3 in kojične kisline (dobro znanega inhibitorja kompetitivnega tipa) na katalitskem mestu tirozinaze sta prikazana na sliki 3B [52]. ]. Kompleks zaviralca tirozinaze-BID3 je predstavljal 6,28 kcal/mol vezavne energije, vključno z dvema vodikovima vezema z ostankoma tirozinaze ASN260 in MET280, opazili pa so tudi hidrofobne interakcije med BID3 in ostanki tirozinaze VAL248, PHE264 in VAL283, kar je dodatno stabiliziralo interakcijo na katalitskem mestu za gobja tirozinaza (tabela 2 in sliki 3E in H). Poleg tega so modeli molekularnega priklopa BID3, ftalne kisline (alosterični inhibitor 1) in cimetove kisline (alosterični inhibitor 2) na dveh alosteričnih mestih prikazani na sliki 3C in 3D. Ftalna kislina in cimetova kislina sta bili vzeti kot referenčni ligandi na alosteričnih mestih 1 oziroma 2 [47, 51]. Kot je prikazano na slikah 3F in I, imata BID3 in ftalna kislina eno vodikovo vez z ostankom TRY140 tirozinaze in tri ostanke hidrofobnih interakcij z LEU24, PHE147 in ILE148 tirozinaze na alosteričnem mestu 1. Ustrezne interakcije liganda BID3 in cimetove kisline na alosteričnem mestu 2 tirozinaze je vključevalo vodikove vezi med ASP312 in LYS376 tirozinaze, medtem ko je THR308 hidrofobno deloval na alosteričnem mestu 2 (sliki 3G in J). Poleg tega je bilo ugotovljeno, da vezava BID3-tirozinaze izvaja vezavno energijo na obeh alosteričnih mestih tirozinaze (4,38 oziroma 5,68 kcal/mol), kar kaže na visoko vezavno afiniteto z obema alosteričnima mestoma. Na podlagi encimskih kinetičnih študij je BID3 izvajal inhibicijo mešanega tipa, sposobnost vezave BID3 s katalitskim mestom in dvema alosteričnima mestoma je potrdila njegovo inhibicijo tirozinaze mešanega tipa.
Slika 2. Lineweaver-Burk (A) in Dixonova grafa (B) za inhibicijo gobje tirozinaze z BID3 z uporabo L-DOPA kot substrata.
3.4. Biološka aktivnost
Da bi izkoristili učinke BID3 proti tirozinazi v modelu celične kulture, smo preučili njegove citotoksične učinke na celice B16F10. Celice so bile 48 ur obdelane z različnimi koncentracijami BID3 (1–20 mM) in ocenjene s testom EZ-Cytox. Rezultati so pokazali, da BID3 ni imel pomembnega citotoksičnega učinka na melanomske celice B16F10 do 20 mM (sliki 4A in B). Zato so bili naslednji poskusi izvedeni z uporabo BID3 do 20 mM.
Tabela 2 Vezavna mesta in rezultati priklopa BID3 v gobji tirozinazi (PDB ID: 2Y9X), kot je bilo ugotovljeno s programom AutoDock4.2.
Melanogenezo uravnava encimska kaskada tirozinaze. Zaradi tega je bilo razvitih več spojin za beljenje kože, ki zmanjšujejo aktivnost tirozinaze. Kojična kislina, zaviralec tirozinaze, je bila uporabljena kot pozitivna kontrola [53]. Da bi torej raziskali učinke BID3 na hiperpigmentacijo, povzročeno z zvišanjem cAMP, smo celice B16F10 obdelali z a-MSH in IBMX v prisotnosti BID3 (1, 5 in 2{{20}}). mM) 48 ur in določili vsebnost melanina ter aktivnosti celične tirozinaze (sl. 4C in D). Zdravljenje z a-MSH in IBMX je povzročilo znatno povečanje (P < 0,001#)="" vsebnosti="" melanina="" (slika="" 4c)="" in="" aktivnosti="" celične="" tirozinaze="" (slika="" 4d)="" v="" celicah="" b16f10="" v="" primerjavi="" z="" neobdelano="" kontrolo.="" vendar="" pa="" je="" zdravljenje="" z="" bid3="" pomembno="" (p="">< 0,01**;="" p="">< 0,001***)="" in="" od="" koncentracije="" odvisno="" zmanjšana="" vsebnost="" melanina="" in="" aktivnost="" celične="" tirozinaze="" celic="" b16f10="" v="" primerjavi="" s="" celicami,="" zdravljenimi="" z="" a-msh="" aliibmx,="" kar="" kaže,="" da="" je="" lahko="" zmanjšanje="" celičnega="" melanina="" posledica="" zaviranja="" aktivnosti="" tirozinaze="" .="" tako="" te="" ugotovitve="" jasno="" kažejo,="" da="" ima="" bid3="" antimelanogene="" učinke,="" ki="" zavirajo="" aktivnost="" tirozinaze="" in="" sintezo="" melanina="" v="" celicah="" b16f10,="" ne="" da="" bi="" povzročil="">
Indanon je ena od privilegiranih struktur medicinske kemije in je na splošno povezan z različnimi farmakološko aktivnimi spojinami [54]. Indanon je prisoten v različnih fiziološko aktivnih naravnih izdelkih. Glede na to so Okpekonet sod., [55] poročali o novi spojini 1-indanon, izolirani iz korenin Uvaria. Ta spojina je prvi 1-derivat indanona, izoliran iz rastlin. Nagle et al. [56] so poročali o izolaciji novega metiliranega indan-aldehida iz marinecianobakterije kot regulatorja tumorske angiogeneze. Podobno, od biološkega pomena jedra indanona, so bili raziskovalci zadnjih nekaj let osredotočeni na razvoj farmakološko aktivnih analogov indanona kot terapevtskih sredstev. Strukturna raznolikost 1-indanonov pomeni različne biološke odzive in te spojine se lahko uporabljajo v kmetijstvu in medicini. Razvite so bile različne spojine na osnovi indanona kot zdravila proti Alzheimerjevi bolezni [16,57–59], proti raku [60– 62], protimikrobna [63,64] in protivirusna sredstva [65,66]. Zaradi širokega potenciala uporabe so 1-indanoni zanimivi objekti za nadaljnje raziskave in je zaželeno oblikovati nove razrede za njihovo sintezo.
cistanche tubolosa: proti staranju
4. Sklep
Za identifikacijo novih močnih zaviralcev tirozinaze smo oblikovali in sintetizirali trinajst (E)-benziliden-1-indanonovih derivatov. Med temi spojinami (E)-2-(2,4-dihidroksi-benziliden){ {6}},3-dihidro-1H-in-1-on (BID3) je močno zaviral aktivnost tirozinaze (IC50=0.034 in 1,39 mM, za L-tirozin in L-DOPA), ki je bila boljša od referenčne spojine, kojične kisline (IC50=13.77 mM oziroma 33,14 mM). Razmerje med strukturo in aktivnostjo je pokazalo, da je prisotnost dihidroksilne skupine na položaju 2 in 4- skeleta (E)-benziliden-1-indanona izboljšala aktivnost proti tirozinazi. Način encimske inhibicije encima, določen z grafoma Lineweaver-Burk in Dixon, je pokazal, da je BID3 inhibitor mešanega tipa. Študije molekularnega priklopa kažejo, da sta vezava na aktivnem mestu in na alosteričnih mestih pomembna mehanizma za inhibitorno aktivnost tirozinaze. Na podlagi teh rezultatov se zdi, da je BID3 močan zaviralec tirozinaze za zdravljenje kožnih motenj, kot je hiperpigmentacija.
koristi desert cistanche: zavira tvorbo melanina