In vitro in in vivo presnova izvlečka Cistanche Tubulosa pri normalnih in kronično nepredvidljivih depresivnih podganah, ki jih povzroča stres

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

Yang Li, et al

POVZETEK

Za Cistanche tubulosa, eno vrsto Cistanches Herba, je bilo pred kratkim potrjeno, da ima antidepresivno učinkovitost pri podganah s kroničnim nepredvidljivim stresom (CUS) z obnavljanjem homeostaze črevesne mikrobiote. V tem prispevku želimo raziskati presnovni profil C. tubulosa pri normalnih in s CUS povzročenih depresivnih modelih podgan in vitro in in vivo. Z uporabo UPLC-Q-TOF-MS in vitro gastrointestinalni metabolizemIzvleček Cistanche tubulosa(CTE) so ovrednotili pri normalnih in CUS podganah. Hkrati in vivo metabolizem CTE(izvleček Cistanche tubulosa)pri normalnih in depresivnih podganah so raziskovali tudi v podganjem urinu in blatu. Skupaj 20 in 26 metabolitov je bilo opredeljenih iz metabolizma in vitro in in vivo pri normalnih in CUS podganah. CTE(izvleček Cistanche tubulosa)je bil presnovljen v aglikone in produkte razgradnje feniletanoidnih glikozidov (PhG) in iridoidnih glikozidov z normalno ali depresivno črevesno mikrobioto podgan in vitro. Presnovki faze II aglikonov in produkti razgradnje PhG in iridoidnih glikozidov so bili glavni metaboliti v urinu in blatu podgan. Poleg tega je bila presnovna sposobnost ustvarjanja sekundarnih glikozidov in aglikonov v depresivni črevesni mikrobioti podgan veliko šibkejša od tiste v normalni črevesni mikrobioti podgan, kar je bilo pripisano neurejenim glikozidnim hidrolazam, ki jih proizvaja črevesna mikrobiota pri podganah z depresijo CUS. Rezultati te študije so postavili temelje za razumevanje presnovnega procesa in terapevtskega mehanizma antidepresivnih lastnosti CTE.

Ključne besede: Cistanche tubulosa, Depresija Metabolizem, In vitro, In vivo, Črevesna mikrobiota

1. Uvod

Cistanches Herba je uradno zabeležena kot posušena sočna stebla Cistanche deserticola (YC Ma) in C. tubulosa (Schrenk), ki se uporablja za zdravljenje odpovedi ledvic, impotence, ženske neplodnosti, morbidne levkoreje, obilne metroragije in senilnega zaprtja [1]. Sodobne farmakološke študije so pokazale, da ima Cistanches Herba različne biološke aktivnosti, kot so anti-nevrodegeneracija, imunoregulacija in protivnetje [2,3]. Naše prejšnje preiskave so to potrdileIzvleček Cistanche tubulosa(CTE), ki so sestavljeni iz 48,6 odstotka feniletanoidnih glikozidov (PhG), 6,9 odstotka iridoidnih glikozidov in 20.0 odstotka skupnih saharidov, bi lahko izrazito ublažili simptome depresije pri depresivnih podganah, ki jih povzroča kronični nepredvidljiv stres (CUS). obnavljanje homeostaze črevesne mikrobiote [4]. Nedavne študije kažejo, da so bile spremembe v sestavi črevesne mikrobiote povezane z razvojem in napredovanjem depresije [5,6]. Relativna številčnost mikrobnih rodov je bila izrazito motena pri podganah z depresivnim modelom CUS v primerjavi z normalnimi kontrolami [7]. Pri bolnikih z depresijo sta bili tudi raznolikost in bogastvo črevesne mikrobiote pomembno spremenjeni [8]. Poleg tega so bile različne spojine, vključno s feniletanoidnimi glikozidi (PhG) in iridoidnimi glikozidi, obravnavane kot glavne sestavine Cistanches Herba [2,3], ki so se zlahka presnovile v njihove sekundarne glikozide in aglikone, vključno s hidroksitirozolom (HT), 3,4-dihidroksifenetil glikozida, deglikozilirane genipozidne kisline itd. s človeško črevesno mikrobioto. Ti metaboliti se lažje absorbirajo skozi črevesje in izvajajo biološko aktivnost, skladno s prototipno komponento [9–11]. Tako verjamemo, da bo med pojavom in razvojem depresije motnja strukture črevesne mikroflore neizogibno vplivala na presnovo peroralnih tradicionalnih kitajskih zdravil (TCM) v prebavilih, poleg vpliva na fiziološko stanje gostitelja. Večina obstoječih presnovnih podatkov o Cistanches Herba izhaja iz presnovnih študij na zdravih živalih [12–15]. Zato bi bilo bolj klinično pomembno raziskati presnovni profil CTE(izvleček Cistanche tubulosa)v patološkem stanju pri pojasnjevanju njegovih bioaktivnih sestavin in razumevanju mehanizma delovanja za njegovo antidepresivno učinkovitost.

V trenutni študiji želimo opisati presnovne profile CTE(izvleček Cistanche tubulosa)pri zdravih podganah in modelih depresije, povzročenih s CUS, s kvadrupolno masno spektrometrijo s časom preleta ultra zmogljive tekočinske kromatografije (UPLC-Q-TOF-MS). Želodčni sok, črevesna tekočina in mikrobiota normalnih in depresivnih patoloških podgan so bili uporabljeni za simulacijo presnovnega procesa CTE(izvleček Cistanche tubulosa)v prebavnem traktu in vitro, neodvisno in zaporedno. Presnovki in vivo so razjasnjeni tudi po peroralnem dajanju CTE(izvleček Cistanche tubulosa)pri normalnih in CUS podganah. Ta študija zagotavlja nove vpoglede v metabolizem in aktivne metabolite CTE(izvleček Cistanche tubulosa)za depresijo.

2. Material in metode

2.1. Material

Posušena stebla C. tubulosa so bila zbrana v okrožju Hetian (Xinjiang, Kitajska). Vzorce vzorcev vavčerjev je overil prof. Xiaobo Li in jih deponiral v herbariju Fakultete za farmacijo šanghajske univerze Jiao Tong (Šanghaj, Kitajska). Uporabljena je bila metoda ekstrakcije, kot je navedeno v naši prejšnji publikaciji [4]. TheIzvleček Cistanche tubulosa(CTE) vzorce smo shranili pri 4 stopinjah in jih pred uporabo ponovno raztopili v sterilni vodi. Sterilne vodne raztopine CTE(izvleček Cistanche tubulosa)vzorce smo nato filtrirali skozi 0.22 μm membrano in filtrate zbrali v sterilne epruvete.

Echinacoside je zagotovil laboratorij dr. Pengfei Tuja, Univerza v Pekingu (Peking, Kitajska). Akteozid, izoakteozid, 2'-acetilakteozid in cistanozid A so bili kupljeni pri Sichuan Weikeqi BiologicalTechnology Co., Ltd. (Chengdu, Kitajska). Hidroksitirozol, kofeinska kislina, 3,4-dihidroksibenzenpropionska kislina, 3-hidroksifenilpropionska kislina in 3-fenilpropionska kislina so bile kupljene pri Aladdin IndustrialInc. (Šanghaj, Kitajska). S HPLC-UV je bilo ugotovljeno, da je čistost vsake komponente > 95 odstotkov. Acetonitril kakovosti HPLC je bil kupljen pri Mercku (Darmstadt, Nemčija). Deionizirano vodo smo pripravili iz destilirane vode s sistemom za čiščenje vode Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, ZDA). Vsi drugi uporabljeni reagenti in kemikalije so bili analitske kakovosti.

2.2. Poskusi na živalih

Samci podgan Sprague-Dawley (200 ± 20 g) so bili pridobljeni iz Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company (Peking, Kitajska) in nameščeni v Laboratory Animal Center šanghajske univerze JiaoTong (Šanghaj, Kitajska). Živali so bile nameščene v skupinski hiši pri kontrolirani sobni temperaturi (25 ± 2 stopinji, 55 ± 10 odstotkov relativne vlažnosti) s ciklom svetlo-tema 12:12 ur. Podgane so imele 1 teden prost dostop do običajne hrane za laboratorijske podgane in vode. Objekte in protokole za živali je odobril Odbor za etiko živali šanghajske univerze Jiao Tong (Šanghaj, Kitajska).

Po enotedenski aklimatizaciji je bilo dvanajst naivnih podgan naključno razdeljenih v dve skupini (n=6), kontrolno skupino in skupino s kroničnim nepredvidljivim stresom (CUS). Podgane CUS so bile razvite kot v našem prejšnjem poročilu [4], ki so bile izpostavljene različnim stresorjem: beli hrup (100 dB) 1 uro, nizkointenzivna stroboskopska osvetlitev čez noč (120 bliskov/min), pomanjkanje vode 24 ur, prazno steklenice z vodo za 1 uro (po odvzemu vode), odvzem hrane za 24 ur, fizična omejitev (1–2 uri), prisilno plavanje (5 min), umazana kletka za 24 ur (200 ml vode v 100 g podlage iz žagovine), ščipanje repa ( 1 min), šok za 30 min, nagib kletke za 45 stopinj za 24 ur in osvetlitev čez noč (12 ur). Stresorji so bili uporabljeni neprekinjeno in naključno 4 tedne, podrobna ureditev je opisana v tabeli S1. Po 4 tednih stresa so bili izvedeni test preference saharoze, test na odprtem polju in test hranjenja z zatiranim hranjenjem, kot je opisano prej [4]. Oris CUS in vedenjskega testa je prikazan na sliki S1. Po vedenjskih testih smo od vsake podgane pridobili vsaj 4 fekalne pelete in jih dali v sterilne stožčaste epruvete za in vitro analizo CTE(izvleček Cistanche tubulosa)metabolizem.

2.3. Gastrointestinalni metabolizem CTE(izvleček Cistanche tubulosa)z normalno in CUS podganami in vitro

2.3.1. Metabolizem CTE(izvleček Cistanche tubulosa)v simuliranih želodčnih in črevesnih sokovih

Petdeset miligramov CTE(izvleček Cistanche tubulosa)smo dodali 10 ml simuliranega želodčnega soka oziroma črevesnega soka. Nato CTE(izvleček Cistanche tubulosa)smo inkubirali pri 37 stopinjah 4 ure v želodčnem soku in 6 ur v črevesnem soku. Gojeno zmes (1 mL) smo pogasili s 3 mL z vodo nasičenega n-butanola takoj pri 0 in 4 h v želodčnem soku ter pri 0 in 6 h v črevesnem soku. Metoda obdelave uporabljenega vzorca je bila, kot je opisano prej [9].

2.3.2. Metabolizem CTE(izvleček Cistanche tubulosa)z normalno in CUS črevesno mikrobioto podgan

Sveže normalne in CUS fekalne vzorce podgan smo najprej zmešali in homogenizirali s 25-kratnim volumnom juhe GAM. Sedimente smo odstranili s filtracijo skozi tri kose gaze. Suspenzija je bila nato inkubirana pri 37 stopinjah v anaerobnem inkubatorju, v katerem je bil zrak nadomeščen z mešanico plinov (H2 5 odstotkov, CO2 10 odstotkov, N2 85 odstotkov). Ločeno smo dodali 50 miligramov CTE k 5 ml normalne in CUS fekalne suspenzije podgan in suspenzijo inkubirali pri 37 stopinjah 48 ur. Gojeno mešanico smo odstranili in ekstrahirali z vodo nasičenim n-butanolom pri 0, 12, 24 in 48 urah. Metoda obdelave vzorca je bila opisana prej [9].

2.3.3. Zaporedna presnova CTE(izvleček Cistanche tubulosa)z želodčnim sokom, črevesnim sokom, normalno in CUS črevesno mikrobioto podgan

Prvič, 100 mg CTE(izvleček Cistanche tubulosa)je bil dodan v 1{{10}} ml simuliranega želodčnega soka in inkubiran pri 37 stopinjah 4 ure. Celotno reakcijo smo pogasili s 3-kratnim volumnom n-butanola, nasičenega z vodo, in centrifugirali pri 3000 obratih na minuto 15 minut, čemur je sledilo izhlapevanje supernatanta pod tokom dušika plin pri 37 stopinjah. Drugič, ostanek smo ponovno raztopili v 0,4 ml sterilne vode, dodali k 8 ml simuliranega črevesnega soka in inkubirali pri 37 stopinjah 6 ur. Na enak način smo pripravili vzorec z želodčnim sokom. Nazadnje smo ostanek ponovno raztopili v 0,3 ml sterilne vode, dodali k 6 ml normalne in CUS fekalne suspenzije podgan in inkubirali pri 37 stopinjah 48 ur v anaerobikikubatorju. En mililiter reakcije smo pogasili s 3 ml z vodo nasičenega n-butanola takoj po 0 in 4 urah v želodčnem soku, po 0 in 6 urah v črevesnem soku in po 0, 12, 24 in 48 urah v črevesni mikrobioti podgan. . Vzorec je bil obdelan identično CTE(izvleček Cistanche tubulosa)v simuliranem želodčnem soku.

2.4. Metabolizem CTE(izvleček Cistanche tubulosa)z normalno in CUS podganami in vivo

Vsaka podgana v obeh skupinah je bila nato nameščena v posamezno presnovno kletko. Po nočnem postu, ki je omogočal samo prost dostop do vode, so vsem podganam peroralno dali 2 ml vode preko želodčne sonde. Prazne vzorce urina in blata smo zbrali pri vseh podganah od 0 h do 12 h. Nadalje, CTE(izvleček Cistanche tubulosa)(400 mg/kg) smo dajali z gavažo. Vzorci urina in blata so bili zbrani od 0 do 24 ur. Vsi vzorci urina in blata so bili takoj shranjeni pri –80 stopinjah.

Vzorci urina in blata normalnih in CUS podgan so bili predhodno obdelani, kot je opisano prej [12]. Vse nastale vzorce smo analizirali z UPLC-Q-TOF-MS.

2.5. Analitična metoda

UPLC je bil izveden na sistemu Waters ACQUITY UPLC (WatersCorp., Milford, MA, ZDA) s kolono ACQUITY UPLC BEH C18 (100 mm × 2,1 mm id, 1,7 μm, Waters Corp. , ZDA) z gradientnim eluiranjem z uporabo {{10}}.1 odstotka acetonitrila mravljinčne kisline (A) in 0.1 odstotka mravljične kisline v vodi (B) pri pretoku 0,4 ml/min . Profil gradienta je bil: 0–5 min (A:5–20 odstotkov), 5–7,5 minut (A: 20–30 odstotkov), 7,5–10 minut (A: 30–70 odstotkov), 10–11 minut (A : 70–100 odstotkov ) in je bila zadržana 1,5 minute. Gradient je bil recikliran nazaj na 5 odstotkov v 0,5 min in je bil zadržan 2,5 min za naslednjo izvedbo. Volumen injekcije je bil 3 μL. Temperatura pečice kolone je bila nastavljena na 35 stopinj.

Masno spektrometrijo smo izvedli z uporabo Waters Vion IMS masnega spektrometra (Waters Corp., Milford, MA, ZDA). Ionizacija je bila izvedena v načinu negativnega elektrospreja (ESI−). Parametri MS so bili naslednji: kapilarna napetost, −2.0 kV; napetost stožca, 20 V; izvorna temperatura, 120 stopinj; temperatura raztapljanja, 500 stopinj ; pretoka plina pri stožcu in desolvataciji 50 oziroma 1000 L/h. Za natančno merjenje mase je bil levcin-enkefalin uporabljen kot zaporna masa za generiranje [M–H]- iona (m/z 554,2615). Eksperiment MSE (Mass SpectrometryElevatedEnergy) v dveh funkcijah skeniranja je bil izveden na naslednji način: funkcija 1 (nizka energija): m/z 50–1000, 0,25 s čas skeniranja, 0,02 s zakasnitev med skeniranjem, 6 eV energija trka; funkcija 2 (visoka energija): m/z50–1000, 0,25 s čas skeniranja, 0,02 s zakasnitev med skeniranjem, rampa energije trka 20–45 eV.

2.6. Obdelava podatkov

Podatki so bili obdelani s programsko opremo UNIFI 1.8.1 (Waters Corp., Milford, MA, ZDA) za identifikacijo metabolitov v natančnih surovih podatkih polnega skeniranja, zbranih prek MSE. Spojine so bile identificirane na podlagi natančne mase, fragmentov v visokoenergijski masni spektrometriji. Prag intenzivnosti je bil nastavljen na 100,0 števcev. Identifikacija tarče, toleranca ujemanja fragmentov in drugi parametri so bili samodejno nastavljeni.

3. Rezultati

3.1. Vedenjske spremembe pri podganah s CUS inducirano depresijo

Podgane s simptomi depresije, ki jih povzroča CUS, so ocenili z vedenjskimi testi, vključno s testom preference saharoze, testom odprtega polja in testom hranjenja z zatiranim hranjenjem. Studentov t-test je pokazal, da so bili preferenca saharoze v testu preference saharoze (p < 0,001),="" skupna="" prevožena="" razdalja="" v="" testu="" na="" odprtem="" terenu="" (p="">< 0,001)="" in="" zakasnitev="" pri="" prehranjevanju="" pri="" testu="" hranjenja="" brez="" novosti="" (p="">< 0,01)="" pomembno="" drugačen="" v="" primerjavi="" s="" kontrolno="" skupino="" po="" 4-tedenskem="" zdravljenju="" s="" cus="" (slika="" 1).="" te="" ugotovitve="" so="" pokazale,="" da="" je="" bil="" model="" kroničnega="" nepredvidljivega="" stresa="" uspešno="">

3.2. Karakterizacija kemijskih sestavin CTE(izvleček Cistanche tubulosa)

Celovita analiza prototipnih sestavin CTE(izvleček Cistanche tubulosa)je bila izvedena z UPLC-Q-TOF-MS. Skupaj 27 komponent iz CTE(izvleček Cistanche tubulosa)odkriti in okvirno karakterizirani, vključno z 20 PhG, 5 iridoidi in iridoidnimi glikozidi ter 2 oligosaharidoma. Podrobne informacije, vključno z retenzijskim časom, natančno MS in ioni fragmentov MS/MS, so navedene v podpornih informacijah (tabela S2), da zagotovijo vpogled v strukturo teh kemičnih sestavin. UPLC-Q-TOF-MS skupni ionkromatogram (TIC) CTE je bil prikazan na sliki S2.

3.3. Gastrointestinalni metabolizem CTE(izvleček Cistanche tubulosa)z normalno in CUS podganami in vitro

V tej študiji so potencialni metaboliti CTE(izvleček Cistanche tubulosa)z normalnimi in CUS. Podgane so bile in vitro odkrite iz TIC in identificirane s kombinacijo elementarnih sestav in masnih spektrov fragmentov MS/MS, potem ko so jih primerjali s kontrolnimi vzorci. Vsi metaboliti iz CTE(izvleček Cistanche tubulosa)v simuliranih želodčnih in črevesnih sokovih je normalna in CUS črevesna mikrobiota podgan navedena v tabeli 1.

3.3.1. Metabolizem CTE(izvleček Cistanche tubulosa)v simuliranih želodčnih in črevesnih sokovih

Sedem metabolitov CTE(izvleček Cistanche tubulosa)v simuliranem želodčnem soku so bili pogojno identificirani z natančnimi informacijami o masi in MSE fragmentih: M1 (m/z 315,1074, C14H20O8, 1,66 min), M4 (m/z 459,1501, C20H28O12, 2,36 min), M5 (m/z 445,1715, C20H30O11, 2,60 min), M7 (m/z 179,0338, C9H8O4, 2,85 min), M12 (m/z 785,2481, C35H46O20, 4,77 min), M16 (m/z 827,2580, C37H48O21, 5,73 min) in M18 (m/z 623 .1968, C29H36O15, 5,81 min). Deglikozilacija, dehidroksilacija, dehidrogenacija in izomerizacija so veljale za glavne presnovne poti za CTE v želodčnem soku. Ugotovljeno je bilo, da imata M4 in M5 molekulsko maso 2 Da in 16 Da nižjo od njune prototipne komponente, dekafeoilakteozida, in sta zato identificirana kot njegova dehidrogenirana oziroma dehidroksilirana produkta. M12 je bil identificiran kot izomer ehinakozida, ki proizvaja enake ione kot ehinakozid pri m/z 623.2178, 477.1601, 315.1055, 161.0237.

Isti metaboliti so bili odkriti po CTE(izvleček Cistanche tubulosa)inkubacija v črevesnem soku. Omeniti velja, da so kofeoilno skupino na položaju C-6' v PhG zlahka presnavljali prebavni encimi v črevesnem soku, da so proizvedli svoje dekafeilne metabolite in kofeinsko kislino.

3.3.2. Metabolizem CTE(izvleček Cistanche tubulosa)z normalno in CUS črevesno mikrobioto podgan

Skupaj 20 metabolitov, ki se biološko transformirajo iz CTE(izvleček Cistanche tubulosa)pri normalni ratintestinalni mikrobioti so bile odkrite in identificirane (slika 2). Iz teh rezultatov je bilo ugotovljeno, da so se PhG razgradili v aglikonski hidroksitirosol (HT) M2 (m/z 153,0550, C8H10O3, 1,78 min) in kofeinsko kislino (CA) M7 (m/z 179,0338, C9H8O4, 2,85 min), nato pa so so bili nadalje presnovljeni v M3 (m/z 163,0390, C9H8O3, 2,02 min), M6 (m/z 181,0501, C9H10O4, 2,76 min), M10 (m/z 195,0655, C10H12O4, 4,35 min) in M11 (m/z 165,0552) , C9H10O3, 4,36 min) z dehidroksilacijo, redukcijo in metilacijo. Poleg tega so osrednje presnovne poti, ki so proizvedle neposredne metabolite prototipnih spojin PhG iz CTE v normalni črevesni mikrobioti podgan, redukcija, metoksilacija, deglikozilacija, dekafeoil, dehidrogenacija in izomerizacija.

Po inkubaciji v podganji črevesni mikrobioti depresije, ki jo povzroča CUS, CTE(izvleček Cistanche tubulosa)se je pretvoril v 20 metabolitov po enakih presnovnih poteh kot normalne podgane.

3.3.3. Zaporedna presnova CTE z želodčnim sokom, črevesnim sokom, normalno in CUS črevesno mikrobioto podgan

Po zaporedni inkubaciji v želodčnem soku, črevesnem soku, normalni in CUS črevesni mikrobioti podgan, CTE(izvleček Cistanche tubulosa)se je presnavljal v 14 metabolitov (vključno z 8 z želodčnim sokom, 7 s črevesnim sokom, 11 z normalno in 10 s črevesno mikrobioto podgan CUS). Med temi sta bila M2(HT) in M11 (3-hidroksifenilpropionska kislina, 3-HPP) končna metabolita PhG po zaporedni inkubaciji CTE(izvleček Cistanche tubulosa)v želodčnem soku, črevesnem soku in črevesni mikrobioti. Med normalno in CUS podganami ni bilo bistvene razlike v presnovkih.

M8, M9, M14, M17, M19 in M20 so odkrili le v neodvisnem metabolizmu CTE z normalno in CUS črevesno mikrobioto podgan. Ti presnovki so bili v glavnem presnovni intermediati, ki so bili v študiji sekvenčnega metabolizma CTE popolnoma presnovljeni v končne presnovke in jih je zato težko zaznati.

3.3.4. Razlike med presnovno hitrostjo CTE pri normalni in CUS črevesni mikrobioti

Za pojasnitev razlik med hitrostjo presnove CTE(izvleček Cistanche tubulosa)z normalno in CUS črevesno mikrobioto podgan so bile ločeno in zaporedno določene relativne vsebnosti 27 prototipnih spojin in 20 metabolitov po inkubaciji z želodčnim sokom, črevesnim sokom, normalno in CUS črevesno mikrobioto podgan (tabeli S3 in S4). Rezultati so pokazali, da ni bilo bistvenih razlik med CTE(izvleček Cistanche tubulosa)metabolitov normalnih in depresivnih podgan, so opazili pomembno razliko v stopnjah njihove presnove. Na primer, C2 in C5 sta bila identificirana kot 8-epiloganska kislina ali njen izomer. V normalnih vzorcih so bili popolnoma presnovljeni v 12 urah inkubacije. V patološko depresivni črevesni mikrobioti podgan pa so se po 48 urah inkubacije temeljito presnovili. Očitno je bilo, da je bila hitrost presnove pri normalni podgani hitrejša kot pri podgani CUS. Podobne rezultate so odkrili pri C18 (izoakteozid). Poleg tega je treba omeniti, da je bila površina vrha M12 (izomerizacija ehinakozida) in M16 (izomerizacija tubulozida A) v normalnih vzorcih veliko večja od tiste v vzorcih CUS, kar kaže, da je reakcija izomerizacije CTE(izvleček Cistanche tubulosa)je bil bolj razširjen pri normalni črevesni mikrobioti podgan kot pri depresivni črevesni mikrobioti podgan.

3.4. Metabolizem CTE pri normalni in CUS podgani in vivo

S primerjavo bioloških vzorcev skupine, zdravljene s CTE, s slepimi biološkimi vzorci je bilo skupno 26 metabolitov (spojina 1–26) CTE(izvleček Cistanche tubulosa)odkrite so bile nenormalne in CUS podgane (tabela 2). Tipični kromatogrami UPLC normalnih in CUS vzorcev urina podgan so predstavljeni na sliki 3.

3.4.1. Karakterizacija metabolitov CTE v normalnem in CUS raturinu

Skupaj 18 in vivo metabolitov CTE(izvleček Cistanche tubulosa)v normalnih vzorcih podganjega urina so bili okvirno identificirani. Razgradni presnovki PhG, vključno s HT in CA, ter njihovo nadaljnje sulfatiranje (spojine 1, 2, 3, 5, 8 in 16), metiliranje (6, 21, 22 in 24) in metoksiliranje (13 in 14) presnovki so bili presnovki. glavni metaboliti v normalnem urinu podgan. Iridoidni glikozidi so se zlahka presnovili v aglikone (23, 25 in 26) z deglikozilacijo. Omeniti velja, da v normalnem vzorcu podganjega urina ni bila odkrita nobena komponenta prototipa.

V vzorcu urina depresivne podgane 22 metabolitov CTE(izvleček Cistanche tubulosa)so bili odkriti in označeni. Ena prototipna spojina, 8-epiloganska kislina, je bila odkrita v patološkem urinu podgan. Drugi presnovki so bili v skladu s tistimi, ki so jih našli v normalnem urinu podgan, vključno s sulfatiranimi presnovki (1, 2, 3, 8, 10 in 16), metiliranimi presnovki (6, 11, 19 in 22), metoksiliranimi presnovki (13 in 14). HT in CA ter teaglikoni iridoidnih glikozidov (25 in 26).

3.4.2. Karakterizacija metabolitov CTE(izvleček Cistanche tubulosa)pri normalnih in CUS ratfecesih

V tej študiji samo en metabolit (spojina 20, 3-HPP) CTE(izvleček Cistanche tubulosa)je bilo ugotovljeno v normalnem blatu podgan. Večina PhG je bila najprej razgrajena v CA in posledično podvržena nadaljnji presnovi v svoj glavni mikrobni metabolit, 3-HPP. V fekalnem vzorcu podgane CUS so bili poskusno opredeljeni 3 metaboliti, vključno s sulfatiranim 3-HPP (spojina 16) in sulfatiranim HT (spojini 2 in 3).

3.4.3. Razlike med in vivo metaboliti CTE pri normalnih in CUS podganah

Po peroralni uporabi CTE(izvleček Cistanche tubulosa), so metaboliti in vivo pokazali očitne razlike pri zdravih in depresivnih modelih podgan. 21 presnovkov (spojina 1–3, 5, 6, 8–14, 16, 17 in 19–26) je bilo odkritih v obeh vzorcih zdravih in CUS podgan. Spojina 23 (deglikozilirana genipozidna kislina) je bila identificirana samo v vzorcih zdravih podgan, medtem ko so spojine 4 (HT), 7 (8-epiloganska kislina), 15 (3, 4-dihidroksibenzenpropionska kislina) in 18 ({{ 19}}HPP glukuronidna konjugacija) so odkrili samo v vzorcih podgan modela CUS. Če povzamemo, sestavine prototipa so odkrili samo pri podganah CUS, medtem ko so pri normalnih podganah odkrili več metabolitov faze II.

4. Razprava

V tej študiji so bili neodvisno in zaporedno uporabljeni trije modeli inkubacije in vitro, vključno z želodčnim sokom, črevesnim sokom, normalno in CUS črevesno mikrobioto podgan, da bi raziskali gastrointestinalni presnovni profil CTE(izvleček Cistanche tubulosa)in vitro. Ugotovljeno je bilo, da PhG in iridoidni glikozidi v CTE(izvleček Cistanche tubulosa)depresivne črevesne mikrobiote podgan, ki jo povzroči CUS, zlahka presnavljajo v svoje sekundarne glikozide in aglikone. Po tem in vivo metabolizem CTE(izvleček Cistanche tubulosa)pri normalnih podganah in CUS podganah. Predlagane presnovne poti za CTE(izvleček Cistanche tubulosa)pri zdravih in s CUS povzročenih depresivnih podganah so prikazani na sliki 4. PhG, kot sta ehinakozid in akteozid, so se presnovili v HT in CA, CA pa je bil podvržen nadaljnji presnovi v svoj glavni mikrobni metabolit, 3-HPP. HT, CA in 3-HPP so bili nato presnovljeni v njihove sulfatirane, metilirane in metoksilirane metabolite. Iridoidni glikozidi, vključno z genipozidno kislino, kankanozidom A in kankanozidom N, so bili presnovljeni v svoje aglikone z deglikozilacijo. Ti so nadalje pokazali, da so PhG in iridoidni glikozidi v CTE(izvleček Cistanche tubulosa)so se zlahka presnavljale v sekundarne glikozide in aglikone pri podganah CUS. Ti presnovki imajo običajno boljšo absorpcijo v črevesju in biološko uporabnost, da se nato absorbirajo v kri za izvajanje biološke aktivnosti [16–18]. Treba je omeniti, da je izomerizacija prevladovala za PhG v prebavnem traktu, ustrezni presnovki so bili identificirani po primerjavi z retencijskim časom UPLC njihovih prototipnih spojin na podlagi neoptimiziranega idealnega profila gradienta UPLC.

Kofeinska kislina je bila primarni produkt razgradnje CTE(izvleček Cistanche tubulosa)z depresivno patološko črevesno mikrobioto podgan. Prejšnje publikacije so poročale, da ima kofeinska kislina učinke, podobne antidepresivu, v testu prisilnega plavanja pri miših. Raven mRNA možganskega nevrotrofičnega faktorja (BDNF) v čelni skorji in raven mRNA TrkB v amigdali sta se po testu prisilnega plavanja znatno zmanjšali, prvo znižanje pa je znatno zavirala kofeinska kislina [19]. Hidroksitirozol je bil aglikon PhG, ki ščiti nevrogenezo in kognitivno funkcijo s preprečevanjem znižanja regulacije nevronskega proteina BDNF, ki ga povzroči stres [20]. Zato je treba več pozornosti nameniti nekaterim bioaktivnim metabolitom (tj. HT in CA), ki jih črevesna mikrobiota po peroralni uporabi transformira.

Poleg tega te ugotovitve dokazujejo, da je bila pri depresivni črevesni mikrobioti pri podganah presnovna sposobnost za tvorbo sekundarnih glikozidov in aglikonov izrazito šibkejša kot pri normalni črevesni mikrobioti podgan. Razlog je verjetno pripisati depresiji povzročenim strukturnim spremembam črevesne mikrobiote, kar vodi do zmanjšane aktivnosti presnovnih encimov, ki jih proizvaja črevesna mikrobiota [21]. Zanimivo je, da je prejšnja študija pokazala, da vrsta Bacteroidetes kodira najbolj razširjene gene glikozidne hidrolaze in polisaharidne liaze za hidrolizo glikozidov in cepitev kompleksnih ogljikovih hidratov z mehanizmom izločanja [22]. Natančneje, Bacteroides spp. vključno z B. caccae, B. dorei, B. finegoldii, B. fragilis, B. intestinalis, B. ovatus, B. thetaiotaomicron, B. uniformis inB. ksilanisolveni so pokazali prevladujoče skupno število genov, ki kodirajo GH in PL. Enake lastnosti ima tudi Parabacteroides distasonis [22]. Naše prejšnje študije so potrdile, da je 28-dnevna kronična nepredvidljiva stresna stimulacija zmanjšala relativno številčnost rodov Bacteroides, Parabacteroides, Butyricimonas in Weissella, medtem ko je povečala Ruminococcus in Deinococcus pri podganah [4]. Omeniti velja, da sta bila Bacteroides in Parabacteroides dva najbolj razširjena mikrobna taksona, ki sta predstavljala približno 20 odstotkov relativne številčnosti pri normalnih podganah. Po zdravljenju s CUS se je relativna abundanca Bacteroides in Parabacteroides močno zmanjšala na približno 5 odstotkov pri depresivnih podganah. Zato bo to neizogibno pripeljalo do zmanjšanja skupnega števila encimov GH in PL pri podganah CUS in dodatno motilo deglikozilirano reakcijo s CUS depresivno črevesno mikrobioto po peroralnem dajanju CTE(izvleček Cistanche tubulosa)pri modelnih podganah.

5. Zaključek

V tej študiji je bila vzpostavljena in uporabljena tehnika UPLC-Q-TOF-MS za presejanje in identifikacijo metabolitovIzvleček Cistanche tubulosapri normalnih in CUS depresivnih podganah in vitro in in vivo. Rezultati so pokazali, da CTE(izvleček Cistanche tubulosa)tako zdrava kot depresivna črevesna mikrobiota presnovila v aglikone in produkte razgradnje PhG in iridoidnih glikozidov. Po peroralni uporabi CTE(izvleček Cistanche tubulosa), metabolite faze II aglikonov in produkte razgradnje PhG in iridoidglikozidov so pretežno našli v urinu podgan. Presnovna zmožnost tvorbe sekundarnih glikozidov in aglikonov v depresivni črevesni mikrobioti podgan je bila precej šibkejša od tiste v črevesni mikrobioti normalne podgane, kar je bilo pripisano neurejenim glikozidhidrolazam, ki jih proizvaja črevesna mikrobiota pri podganah z depresijo CUS. Ta študija ponuja novo perspektivo za poznejše razvoj CTE(izvleček Cistanche tubulosa)kot potencialni antidepresiv.

Zahvala

To delo je bilo podprto z nepovratnimi sredstvi iz nacionalnega ključnega raziskovalnega in razvojnega programa Kitajske (2017YFC1702400).

Dodatek A. Dodatni podatki

Dodatne podatke k temu članku lahko najdete na spletu na naslovu HTTPS://doi.org/10.1016/j.jchromb.2019.121728

Od: ' In vitro in in vivo metabolizemIzvleček Cistanche tubulosapri normalnih in kroničnih nepredvidljivih, s stresom povzročenih depresivnih podganahYang Li, et al

--Journal of Chromatography B 1125 (2019) 121728

Reference

[1] Komisija za kitajsko farmakopejo, Farmakopeja Ljudske republike Kitajske, izdaja 2015, China Medical Science Press, Peking, Kitajska, 2015, str. 135 I. del.
[2] Y. Jiang, P.-F. Tu, Analiza kemičnih sestavin v vrstah Cistanche, J. Chromatogr. 1216 (2009) 1970–1979.
[3] Z. Fu, X. Fan, X. Wang, X. Gao, Cistanches Herba: pregled njegove kemije, farmakologije in farmakokinetične lastnosti, J. Ethnopharmacol. (2017), https://doi.org/10.1016/j.jep.2017.10.015.
[4] Y. Li, Y. Peng, P. Ma, H. Yang, H. Xiong, M. Wang, C. Peng, P. Tu, X. Li, Antidepresivu podobni učinkiIzvleček Cistanche tubulosana podganah s kroničnim nepredvidljivim stresom z obnovo homeostaze črevesne mikrobiote, Front. Pharmacol. (2018), https://doi.org/10.3389/fphar.2018.00967.
[5] JA Foster, MV Neufeld, Črevesno-možganska os: kako mikrobiom vpliva na anksioznost in depresijo, Trends Neurosci. 36 (2013) 305–312.
[6] E. Sherwin, TG Dinan, JF Cryan, Nedavni razvoj pri razumevanju vloge črevesne mikrobiote pri zdravju in bolezni možganov, Ann. NY Acad. Sci. 12 (2017) e0177977.
[7] Y. Meng, H. Jia, Z. Chao, Y. Yong, Z. Yang, M. Yang, Z. Zou, Variacije črevesne mikrobiote in fekalnega presnovnega fenotipa, povezanega z depresijo s sekvenciranjem gena 16S rRNA in LC/ Metabolomika na osnovi MS, J. Pharm. Biomed. Analno 138 (2017) 231–239.

[8] JR Kelly, Y. Borre, BC O', E. Patterson, AS El, J. Deane, PJ Kennedy, S. Beers, K. Scott, G. Moloney, Transferring the blues: depression-associated gut microbiota induces nevrovedenjske spremembe pri podganah, J. Psychiatr. Res.. 82 (2016) 109–118.
[9] L. Yang, P. Ying, M. Wang, P. Tu, X. Li, Človeški gastrointestinalni metabolizem vodnega izvlečka Cistanches Herba in vitro: pojasnitev presnovnega profila na podlagi celovite identifikacije metabolita v želodčnem soku, črevesju sok, človeške črevesne bakterije in črevesni mikrosomi, J. Agric. Food Chem. 65 (2017) 7447–7456.
[10] Y. Li, G. Zhou, S. Xing, P. Tu, X. Li, Identifikacija metabolitov ehinakozida, ki jih proizvajajo človeške črevesne bakterije z uporabo tekočinske kromatografije ultrazmogljivosti/kvadrupolne masne spektrometrije časa preleta, J. Agric. Food Chem. 63 (2015) 6764–6771.
[11] Y. Li, G. Zhou, Y. Peng, P. Tu, X. Li, Preverjanje in identifikacija treh tipičnih metabolitov feniletanoidnih glikozidov iz Cistanches Herba s človeškimi črevesnimi bakterijami z uporabo UPLC/Q-TOF-MS, J. Pharm. Biomed. Analno 118 (2016) 167–176.
[12] L. Yang, P. Ying, M. Wang, G. Zhou, Y. Zhang, X. Li, Hitro presejanje in identifikacija razlik med metaboliti Cistanche deserticola in vodnim izvlečkom C. tubulosa pri podganah z UPLC- Q-TOF-MS kombinirana analiza prepoznavanja vzorcev, J. Pharm. Biomed. Analno 131 (2016) 364–372.
[13] C. Q, P. Y, B. X, Z. W, C. L, L. X, Sistematično karakterizirajte presnovke ehinakozida in akteozida iz Cistanche tubulosa v podganji plazmi, žolču, urinu in blatu na podlagi UPLC-ESI-Q-TOF-MS, Biomed. Chromatogr. 30 (2016) 1406–1415.
[14] Y. Wang, H. Hao, G. Wang, P. Tu, Y. Jiang, Y. Liang, L. Dai, H. Yang, L. Lai, C. Zheng, pristop k identifikaciji zaporednih metabolitov tipičen feniletanoidni glikozid, ehinakozid, na podlagi časa ujetja ionov s tekočinsko kromatografijo
analiza masne spektrometrije letenja, Talanta 80 (2009) 572–580.
[15] C. Jia, H. Shi, W. Jin, K. Zhang, Y. Jiang, M. Zhao, P. Tu, Metabolizem ehinakozida, dobrega antioksidanta, pri podganah: izolacija in identifikacija njegovih žolčnih metabolitov, Zdravilo Metab. Dispos. 37 (2009) 431–438.
[16] J. Xu, HB Chen, SL Li, Razumevanje molekularnih mehanizmov medsebojnega delovanja med zeliščnimi zdravili in črevesno mikrobioto, Med. Res. Rev. 37 (2017) 1140–1185.
[17] H. Liu, J. Yang, F. Du, X. Gao, X. Ma, Y. Huang, F. Xu, W. Niu, F. Wang, Y. Mao, Absorpcija in razporeditev ginsenozidov po peroralni uporabi dajanje izvlečka Panax notoginseng podganam, zdravilo Metab. Dispos. 37 (2009) 2290–2298.
[18] JM Laparra, Y. Sanz, S. Schaffer, F. Visioli, Interakcije črevesne mikrobiote s funkcionalnimi živilskimi sestavinami in nutracevtiki, Pharmacol. Res. 61 (2010) 219–225.
[19] H. Takeda, M. Tsuji, T. Yamada, J. Masuya, K. Matsushita, M. Tahara, M. Iimori, T. Matsumiya, Kofeinska kislina oslabi zmanjšanje kortikalne ekspresije mRNA BDNF, povzročeno z izpostavljenostjo prisilnemu plavalni stres pri miših, Eur. J. Pharmacol. 534 (2006) 115–121.
[20] A. Zheng, L. Hao, C. Ke, X. Jie, Z. Xuan, L. Yuan, C. Cong, J. Liu, Z. Feng, Uporaba hidroksitirozola pri materi izboljša nevrogenezo in kognitivno funkcijo pri prenatalno stresnih podmladek, J. Nutr. Biochem. 26 (2015) 190–199.
[21] H. Li, J. He, W. Jia, Vpliv črevesne mikrobiote na presnovo in toksičnost zdravil, Expert Opin. Zdravilo Metab. Toxicol. 12 (2016) 31.
[22] KA El, F. Armougom, JI Gordon, D. Raoult, B. Henrissat, Obilje in raznolikost encimov, aktivnih na ogljikovih hidratih, v mikrobioti človeškega črevesja, Nat. Rev. Microbiol. 11 (2013) 497–504.