In vitro vrednotenje najbolj aktivnih probiotičnih sevov, ki lahko izboljšajo funkcije črevesne pregrade in preprečijo vnetne bolezni prebavilⅡ

2. Materiali in metode

2.1. Celične kulture

Celice človeškega kavkaškega adenokarcinoma debelega črevesa Caco{{0}} (ATCC® HTB-37™) in celice HT29-MTX, ki izločajo epitelno sluz človeškega debelega črevesa (Sigma Aldrich), so bile najprej ločeno kultivirane z uporabo Medij DMEM (Gibco) z dodatkom 10 % fetalnega govejega seruma (Gibco), 100 i.e./ml penicilina, 100 mg/ml streptomicina (Gibco) in 2 mM glutamina (Gibco), pri 37 ◦C v atmosferi 5 % CO2. Nato so bile sokulture postavljene v 12-plošče wellTranswell® (z 12 mm polikarbonatnim vložkom in porami 0,4 µm) tako, da so celice nasadili v bazolateralni predel v razmerju 75:25 Caco-2:HT 29-MTX in se izvaja 21 dni, pri čemer se medij menja vsaka 2 dni.

Kliknite za hitro lajšanje zaprtja

2.2. Bakterijski sevi

Sevi Lactobacillus, vključno z Limosilactobacillus fermentum, izoliranim iz bivoljega mleka [32], Levilactobacillus brevis SP-48, Lacticaseibacillus rhamnosus IMC501, Limosilactobacillus reuteri LR92 in Lacticaseibacillus paracasei IMC502, ki jih zagotavlja vodja projekta Incube, R&D—IBSA Farmaceutici Italia, so gojili v bioreaktorski fermentaciji postopke in liofilizacijo, da dobimo praške, ki se uporabljajo kot začetni material. Pred poskusom smo praške resuspendirali in gojili v juhi Man, Rogosa in Sharpe (MRS-Oxoid) pri 37 ◦C v mikroaerofilnih pogojih 24 ur.

2.3. Zdravljenje celic

So-kultivirane celice smo obdelali z različnimi sevi Lactobacillus spp. (108 CFU/mL) pri množici okužb (MOI) 100, sam ali v kombinaciji z 20 µg/mL lipopolisaharida (LPS) S. Typhimurium, 24 ur pri 37 ◦C pri 5 % CO2 v DMEM brez antibiotikov.

2.4. PCR v realnem času

Za ovrednotenje izražanja pro- in protivnetnih citokinov, HBD-2 in TJs smo celice na koncu zdravljenja trikrat sprali s sterilnim PBS in celotno RNK ekstrahirali z uporabo High Pure RNA Isolation Kit ( Roche Diagnostics). Skupno 2{{20}}0 ng celične RNA je bilo reverzno prepisano (Expand Reverse Transcriptase, Roche) v komplementarno DNA (cDNA) z uporabo naključnih heksamernih začetnikov (randomhexamers, Roche) pri 42 ◦C 45 min, po navodilih proizvajalca. PCR v realnem času za IL-6, IL-8, TNF- , IL-1 , TGF- , HBD-2, Occludin, Zonulin-1 in Claudin{{ 14}}je bil izveden s kompletom LC Fast Start DNA Master SYBR Green (Roche Diagnostics) z uporabo 2 µL cDNA, kar ustreza 10 ng celotne RNA v 20 µL končnem volumnu, 3 mMMgCl2 in 0,5 µM smiselnih in protismiselnih začetnikov ( Tabela 1). Po pomnoževanju je bila izvedena analiza talilne krivulje s segrevanjem na 95 °C za 15 s pri hitrosti temperaturnega prehoda 20 °C/s, ohlajanjem na 60 °C za 15 s s hitrostjo temperaturnega prehoda 20 °C/s in nato segrevanje vzorca pri 0,1 ◦C/s na 95 ◦C. Rezultate smo nato analizirali s programsko opremo LightCycler (Roche Diagnostics). Standardna krivulja vsakega para primerjev je bila vzpostavljena s serijskimi razredčinami cDNA. Vse PCR so bile izvedene v treh izvodih. Specifičnostproduktov pomnoževanja smo preverili z elektroforezo na 2% agaroznem gelu in vizualizacijo z barvanjem z etidijevim bromidom [6].

2.5. ELISA test

Prisotnost IL-6, IL-8, IL-1, TNF-, TGF-, HBD-2, Zonulina-1, Occludina in Claudina{{7 }} v celičnih lizatih kokultur Caco-2/HT29-MTX, okuženih z različnimi sevi laktobacilov z ali brez LPS, smo analizirali z encimsko imunskim testom (ELISA; Invitrogen, IL{{12). }}, IL-8, IL-1 alfa, TNF alfa in TGF beta-1 HumanELISA Kit; Phoenix Pharmaceuticals, Inc. Defensin 2, beta (Human)—ELISA Kit; Elabscience Biotechnology Inc. humani zonulin, humani OCLN (okludin) in humani CLDN1 (Claudin 1) komplet ELISA).

2.6. Test adhezije in invazivnosti

Sposobnost L. brevis, L. reuteri in L. rhamnosus, da zmanjšajo sposobnost adhezivnosti in invazivnosti S. Typhimurium in EIEC v črevesnih kokulturah, so raziskali v treh različnih eksperimentalnih tipih: (i) kompetitivni test, v katerem so bile intestinalne epitelijske celice inkubirane hkrati z laktobacili (108 CFUs/mL) in S. Typhimurium ali EIEC (108 CFUs/mL) 2 uri. (ii) Inhibicijski test, pri katerem so bile celice predhodno inkubirane z laktobacili (108 CFUs/mL) 2 uri, nato pa je bil dodan S. Typhimurium ali EIEC (108 CFUs/mL) in inkubirani dodatni 2 uri. (iii) Test izpodrivanja, pri katerem so bile celice predhodno inkubirane s S. Typhimurium ali EIEC (108 CFUs/mL) 2 uri in nato dodani laktobacili (108 CFUs/mL) in nadalje inkubirani 2 uri. Ob koncu tega časa smo okužene monosloje temeljito sprali v PBS, nato lizirali z raztopino 0,1 % Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA) v PBS 10 minut pri sobni temperatura za štetje internaliziranih bakterij. Alikvote celičnih lizatov smo serijsko razredčili in nasadili na Hektoen agar (OXOID) ter inkubirali pri 37 ◦C čez noč, da smo kvantificirali celotno preživetje celično povezanih bakterij (CFU/mL). Za teste invazivnosti smo po inkubaciji z bakterijami okužene monosloje temeljito sprali s sterilnim PBS in dodatno inkubirali še dodatni 2 uri v mediju DMEM, dopolnjenem z gentamicinsulfatom (250 µg ml–1) (Sigma-Aldrich), da uničimo zunajcelične bakterije, nato celice liziramo in nasadimo, kot je opisano prej, da kvantificiramo skupno število internaliziranih bakterij (CFU/mL).

2.7. Statistična analiza

Pomembne razlike med skupinami so bile ocenjene z dvosmerno ANOVA z uporabo GraphPad Prism 8.0, primerjava med povprečji pa je bila izračunana s Študentovim t-testom. Podatki so izraženi kot srednje vrednosti ± standardni odklon (SD) treh neodvisnih poskusov.

Naravno zeliščno zdravilo za lajšanje zaprtja - Cistanche

Cistanche je rod parazitskih rastlin, ki spada v družino Orobanchaceae. Te rastline so znane po svojih zdravilnih lastnostih in se že stoletja uporabljajo v tradicionalni kitajski medicini (TCM). Vrste Cistanche najdemo predvsem v sušnih in puščavskih regijah Kitajske, Mongolije in drugih delov Srednje Azije. Za rastline Cistanche so značilna mesnata, rumenkasta stebla in so zelo cenjene zaradi potencialnih koristi za zdravje. V TKM se verjame, da ima Cistanche tonične lastnosti in se običajno uporablja za hranjenje ledvic, povečanje vitalnosti in podporo spolne funkcije. Uporablja se tudi za reševanje težav, povezanih s staranjem, utrujenostjo in splošnim dobrim počutjem. Čeprav ima Cistanche dolgo zgodovino uporabe v tradicionalni medicini, znanstvene raziskave o njeni učinkovitosti in varnosti še potekajo in so omejene. Znano pa je, da vsebuje različne bioaktivne spojine, kot so feniletanoidni glikozidi, iridoidi, lignani in polisaharidi, ki lahko prispevajo k njegovim zdravilnim učinkom.

Wecistanchejevacistanche prašek, cistanche tablete, cistanche kapsulein drugi izdelki so razviti z uporabopuščavacistanchekot surovine, vse skupaj pa dobro vpliva na lajšanje zaprtja. Specifični mehanizem je naslednji: Cistanche naj bi imel potencialne koristi za lajšanje zaprtja na podlagi tradicionalne uporabe in nekaterih spojin, ki jih vsebuje. Medtem ko so znanstvene raziskave o učinku Cistanche na zaprtje omejene, se domneva, da ima več mehanizmov, ki lahko prispevajo k njegovemu potencialu za lajšanje zaprtja. Odvajalni učinek:Cistanchese že dolgo uporablja v tradicionalni kitajski medicini kot zdravilo za zaprtje. Domneva se, da ima blag odvajalni učinek, ki lahko pomaga spodbujati gibanje črevesja in povzroči zaprtje. Ta učinek je mogoče pripisati različnim spojinam v Cistancheju, kot so feniletanoidni glikozidi in polisaharidi. Vlaženje črevesja: Na podlagi tradicionalne uporabe velja, da ima Cistanche vlažilne lastnosti, posebej usmerjene na črevesje. Spodbujanje hidracije in mazanja črevesja lahko pomaga zmehčati orodja in olajšati lažji prehod ter tako ublažiti zaprtje. Protivnetni učinek: zaprtje je lahko včasih povezano z vnetjem v prebavnem traktu. Cistanche vsebuje določene spojine, vključno s feniletanoidnimi glikozidi in lignani, za katere se verjame, da imajo protivnetne lastnosti. Z zmanjšanjem vnetja v črevesju lahko pomaga izboljšati rednost odvajanja blata in lajša zaprtje.