Nanocimi, ki zaznavajo vnetje in posnemajo katalazo, lajšajo akutno poškodbo ledvic z odpravo lokalnega oksidativnega stresa Ⅱ

Biodistribucija encima PTC-M pri miših IRI

Biodistribucijo PTC so raziskali pri miših IRI z nalaganjem fluorescentnega barvila IR780 kot modelnega zdravila (PTC-IR780). Primerjali smo tudi biodistribucijo samo PC-IR780 in IR780 ter opazili, da so vse skupine pokazale fluorescenco v glavnih organih, vendar je PTC-IR780 pokazal povečano kopičenje v ledvicah za razliko od skupine PC-IR780 ali IR780 (dodatna datoteka 1: Slika S14 A ). Preverili smo tudi profil biološke porazdelitve PTC-IR780 pri normalnih miših in ugotovili, da kaže večje kopičenje v jetrih, kar je običajno za nanodelce po intravenski injekciji, vendar se ni veliko kopičilo v ledvicah (dodatna datoteka 1: Slika S15). Tako sklepamo, da okrepljenoledvicakopičenjePTC je pretežno posredovan z vnetjem ledvic. V naši študiji smo oblikovali nano micele PTC tako, da krožijo v krvi in ​​se postopoma kopičijo na mestu vnetja, in ko dosežejo mesto vnetja, se PTC destabilizira zaradi prisotnosti izboljšanega ROS in naložen IR780 bo sprosti, ki ostane v ledvicah dlje časa, kar povzroči povečano fluorescenco. Kopičenje v ledvicah med vsemi skupinami so primerjali s kvantificiranjem intenzivnosti fluorescence ex vivo in ugotovili, da je PTC pokazal boljšekopičenje v ledvicahčeprav kaže fluorescenco v drugih večjih organih, kar je neizogibno v primeru sistemskega injiciranja (dodatna datoteka 1: slika S14 B) Kot je prikazano na sliki 6A, so opazili močno intenzivnost fluorescence IR780 v ledvicah 6 ur po injiciranju PTC -IR780. Intenzivnost fluorescence glavnih organov je bila visoka v vrstnem redu jeter, pljuč, vranice in ledvic. Intenzivnost fluorescence drugih organov se je sčasoma zmanjšala, medtem ko je intenzivnost fluorescence ledvic ostala relativno konstantna do 48 ur. Tako jeintenzivnost fluorescence ledvicv primerjavi z jetri sčasoma postopoma naraščala (slika 6B). To bi lahko bilo skladno s prejšnjimi študijami, ki so poročale, da je povečanjevnetje ledviclahko povzroči povečano prepustnost žil in s tem povečano kopičenje NM v ledvicah [16]. Biorazporeditev je bila nadalje potrjena s preverjanjem vsebnosti Mn v različnih organih z analizo masnega spektrometra z induktivno sklopljeno plazmo (ICP-MS). Kot je prikazano na sliki 6C, je koncentracija Mn v obeh ledvicah dosegla vrh 6 ur po injiciranju in postopoma upadala do 48 ur. Če primerjamo koncentracijo Mn v tkivu s koncentracijo drugih glavnih organov, so ledvice kadar koli dosegle višjo koncentracijo Mn v tkivu kot jetra, pljuča in vranica. Da bi potrdili očistek PTCM, smo na koncu študije izvedli ICP-MS analizo vseh organov, iztrebkov in urina in po enem tednu opazili, da je bil večji del Mn prikazan v črevesju in blatu. . Ugotovljeno je bilo, da je bil očistek Mn predvsem hepatobiliarni in ne ledvični očistek. Predvidevamo, da se po kopičenju v ledvicah nanodelec Mn3O4 razgradi na Mn ione, kar sledi običajnemu hepatobiliarnemu očistku Mn (dodatna datoteka 1: slika S16) [17].

Ekološka zelišča za bolezni ledvic

Encim PTC-M zmanjša označevalce poškodb ledvic in oslabi morfološke spremembe v ledvicah miši IRI

Nazadnje smo izvedli poskus in vivo, da bi ugotovili učinkovitost PTC-M za zmanjšanje poškodbe ledvic pri ledvični IRI. Da bi raziskali celotno stanje škode vIRI ledvicsmo izmerili lipokalin, povezan z nevtrofilno želatinazo v plazmi (NGAL), dobro znan marker tubularne poškodbe pri AKI [18]. Raven plazemskega NGAL je bila bistveno višja v skupini IRI kot v lažni skupini, vendar je bila zmanjšana z zdravljenjem s PTC-M (slika 7B). Izvedli smo barvanje s periodično kislino po Schifu (PAS).odseki ledvicza preverjanje morfoloških sprememb (slika 7C). V nasprotju z lažnimi mišmi so opazili otekanje ledvičnih tubulov in dilatacijo, napolnjeno z nekrotičnim materialom. V ledvicah miši IRI so opazili vnetne celice, ki napihnejo intersticijske prostore. Te spremembe so bile izboljšane z zdravljenjem s PTC-M. Otekanje tubulov, nekrotični materiali v tubulih in infiltracija vnetnih celic so bili relativno oslabljeni pri miših IRI, zdravljenih s PTC-M. Za razliko od sprememb v tubulih, v glomerulih v vsaki skupini ni bilo opaznih pomembnih morfoloških razlik.

PTC-M blaži vnetje in apoptozo v ledvicah miši IRI

Da bi preverili, ali bi PTC-M lahko zmanjšal gibanje dojenčka, ki ga povzroči oksidativna poškodba, smo pregledali raven izražanja beljakovin HO -1 z Western blot analizo, da bi ocenili stopnjo oksidativnega stresa v ledvicah miši IRI. Ugotovili smo precej povišane ravni izražanja HO -1 v ledvicah miši IRI, ki so bile oslabljene z zdravljenjem s PTC-M (slika 8A). Imunohistokemično obarvanje za HO-1 je pokazalo njegovo povečano izražanje v mezangiju glomerulov, periglomerularnih prostorih in peritubularnem intersticijskem prostoru ledvic miši IRI, ki je bilo zmanjšano v ledvicah miši, zdravljenih s PTC-M (slika 8C). Da bi razjasnili aktivno vnetje v ledvicah miši IRI, smo s kvantitativno analizo verižne reakcije s polimerazo (qPCR) preverili nivoje transkriptov proinfammatory citokinov in adhezijskih molekul (slika 8B). Stopnje izražanja mRNA interlevkina (IL)-6, monocitnega kemoatraktantnega proteina (MCP)-1, faktorja tumorske nekroze (TNF)-, znotrajcelične adhezijske molekule (ICAM)-1, adhezije vaskularnih celic molekule (VCAM-1) in transformirajočega rastnega faktorja (TGF)- se je znatno povečalo v ledvicah miši IRI, zdravljenje s PTC-M pa je te spremembe zavrlo (slika 8B). Imunohistokemično barvanje za F4/80, marker mišjih makrofagov, je pokazalo povečano izražanje v periglomerularnih in intersticijskih prostorih ledvic miši IRI, ki je bilo tudi oslabljeno z zdravljenjem s PTC-M (slika 8C). Ti podatki kažejo, da je PTC-M zaviral ledvično vnetje in oksidativni stres pri miših IRI.

Za ovrednotenje stopnje smrti ledvičnih tubularnih celic pri miših IRI je bila ocenjena raven izražanja beljakovin apoptotičnih beljakovin. Imunoblotiranje je razkrilo povečano razmerje Bax/Bcl-2 in razcepljena razmerja med kaspazo 3/kaspazo 3 v ledvičnem tkivu miši IRI, kar nakazuje, da se je apoptoza poslabšala (slika 9A). Teh sprememb niso opazili pri miših, zdravljenih s PTC-M. Zdravljenje s PTC-M je znatno zmanjšalo apoptotične kaskade v ledvicah miši IRI, ki jih povzroča oksidativni stres. Da bi ugotovili, ali je PTC-M zaviral apoptozo, posredovano z ROS, preko mitogen-aktivirane proteinske kinaze (MAPK), smo ocenili spremembe v signalni poti MAPK. Izvedli smo imunoblot analizo za nivoje proteinov poti MAPK in njihove fosforilirane (aktivirane) oblike (slika 9B). Ravni fosforiliranih ERK, JNK in P38 so bile povečane v ledvicah miši IRI v primerjavi z lažnimi mišmi, ki so bile oslabljene s PTC-M, čeprav pomembnega zmanjšanja fosforilirane JNK niso opazili. Barvanje s terminalno deoksinukleotidil transferazo dUDP nickend marking (TUNEL) je pokazalo več TUNEL-pozitivnih tubularnih epitelijskih celic v skorji ledvic miši IRI v primerjavi z lažnimi mišmi, medtem ko je zdravljenje s PTC-M zmanjšalo število TUNEL-pozitivnih celic (sl. 9C). Ti rezultati kažejo, da je PTC-M zmanjšal apoptozo v ledvicah miši IRI z vplivanjem na signalno pot MAPK. Te ugotovitve pri IRI mišjih ledvicah so bile skladne z rezultati pri H2O2-stimuliranih človeških ledvičnih celicah, kar kaže na skupni mehanizem PTC-M zaščite ledvic. H&E barvanje je bilo izvedeno na glavnih organih, zbranih iz normalnih skupin in skupin, zdravljenih s PTC-M, in niso opazili večjih histoloških sprememb, ki bi kazale na poškodbe (dodatna datoteka 1: slika S17).