Vpliv dodajanja alg na koncentracijo glutationa in aktivnost encimov glutationa v jetrih in ledvicah miši

edmund.chen@wecistanche.com

Povzetek: Alge so potencialni in naravni vir dolgoverižnih večkrat nenasičenih maščobnih kislin, kot sta eikozapentaenojska kislina (EPA) in dokozaheksaenojska kislina (DHA). Diatomeja Pinnularia Borealis kopiči visoke ravni EPA in se lahko obravnava kot vir za komercialno proizvodnjo prehranskih dopolnil. V tej študiji smo postavili vprašanje, ali lahko prehransko dopolnilo s P. Borealis poveča antioksidativno obrambo in ublaži dejavnike tveganja za bolezni srca in ožilja. Miši (Mus musculus) smo 7 dni hranili z raztopinami liofilizirane diatomeje različnih koncentracij (1-odstotna, 3-odstotna in 5-odstotna). Nato smo vjetrainledvica. Ugotovili smo, da so koncentracije holesterola in triacilglicerola vjetrain ledvice so bile najnižje pri miših, ki so bile hranjene z najvišjo koncentracijo Pinnularia Borealis, kar kaže na zaščitne lastnosti alg. Poleg tega je najnižja koncentracija Pinnularia Borealis zadostovala za izboljšanje antioksidativne sposobnosti. Naši rezultati kažejo, da se P. Borealis lahko uporablja kot vir prehranskih dopolnil, bogatih z EPA, vendar mora biti količina, ki jo vnesemo v organizem, omejena.

Ključne besede:alge; EPA; dopolnjevanje; glutation; glutationski encimi; oksidativni stres; ledvice; jetra

CISTANCHE BO IZBOLJŠAL DELOVANJE LEDVIC/LEDVIC

Uvod

Prosti radikali in ROS predstavljajo velik izziv za organizme, saj lahko poškodujejo nukleinske kisline, beljakovine in lipide. Tako so organizmi razvili učinkovit antioksidativni obrambni sistem, ki vključuje endogene encimske in neencimske antioksidante. Vendar pa lahko antioksidante, kot so vitamin C, vitamin E, karotenoidi in fenoli, dobimo tudi iz prehrane. Poleg tega lahko polinenasičene maščobne kisline (PUFA), ki hitro oksidirajo in vitro, zmanjšajo oksidativno škodo in vivo [1]. Prehrana, bogata s PUFA, zmanjšuje tveganje za bolezni srca in ožilja ter nekatere vrste raka. Prav tako lahko zmanjša koncentracijo holesterola v plazmi in tako zmanjša tveganje za srčno-žilne in Alzheimerjeve bolezni [1,2] ter ima koristno vlogo pri psihiatričnih motnjah, vidu, astmi in revmatoidnem artritisu [3]. Človeško telo lahko sintetizira veliko vrst maščobnih kislin, vendar morajo biti esencialne maščobne kisline, kot sta -linolenska kislina (omega-3, ω-3) in linolna kislina (ω-6). pridobljeno iz prehrane. Dva derivata -linolenske kisline, eikozapentaenojska kislina (ω-3, EPA) in dokozaheksaenojska kislina (ω{{10}}, DHA), sta pomembni strukturni komponenti celične membrane [4] . EPA in DHA izboljšujeta dejavnike tveganja za srčne bolezni, kot so možganska kap, aritmija in visok krvni tlak [3], ter imata koristno vlogo pri psihiatričnih motnjah, vidu, astmi in revmatoidnem artritisu [4]. Tako EPA kot DHA običajno pridobivamo z vsakodnevno prehrano, predvsem iz ribjega olja. Vendar se med ekstrakcijo iz rib pojavijo težave, kot sta vonj in nestabilnost produktov ekstrakcije [4]. Zato so potrebni alternativni viri. Diatomeje predstavljajo eno od glavnih skupin fotosintetskih alg [5–11] in so znane po visokih ravneh esencialnih ω-3 maščobnih kislin, EPA, DHA in karotenoidov [12,13]. V 2011, Lang et al. objavili profile maščobnih kislin več kot 2000 mikroalg, kar omogoča podrobno študijo profilov VLC-PUFA v diatomejah [14]. Bogate so s srednjeverižnimi in zelo dolgoverižnimi polinenasičenimi maščobnimi kislinami (VLC-PUFA). Prevladujoče maščobne kisline so miristinska kislina (14:0), palmitinska kislina (16:0), palmitoleinska kislina (16:1) in eikozapentaenojska kislina (20:5), medtem ko so C18 maščobne kisline običajno prisotne v sledovih [ 15]. Diatomeje so ekološko zelo razširjene, pojavljajo se v morskih, sladkovodnih in kopenskih habitatih po vsem svetu ter pomembno prispevajo k primarni proizvodnji in globalnemu kroženju ogljika in hranil [16]. Pinnularia Borealis je pogosta kopenska kozmopolitska vrsta, ki jo najdemo v zračnih habitatih (skale, stene, prst, mah) ter v spodnjih in stoječih vodah [17]. V zadnjih letih se diatomeji vedno bolj priznava njihov velik potencial v biotehnoloških aplikacijah, saj proizvajajo visoko vredne spojine, ki se lahko uporabljajo v medicini in kot prehranska dopolnila [18].

V tej študiji smo postavili vprašanje, ali lahko prehransko dopolnilo s diatomejo Pinnularia Borealis poveča antioksidativno obrambo pri mišjem Mus musculus. Analizirali smo glutationski antioksidativni sistem, ki ima ključno vlogo pri vzdrževanju oksidativne homeostaze, ter koncentracijo malondialdehida, produkta peroksidacije lipidov, kot označevalca oksidativnega stresa. Glutationski antioksidativni sistem sestavljajo reducirane in oksidirane oblike glutationa (GSH oziroma GSSH), glutation peroksidaze in glutation reduktaze. Povečano razmerje med GSSG (glutation disulfid) in GSH kaže na večji oksidativni stres [1]. Glutation se sintetizira v citoplazmi celic injetraje najbolj aktiven organ [1]. Reducirani glutation (L-gama-glutamil-L-cisteinil glicin, GSH) je najpogostejši tiol z nizko molekulsko maso v celicah sesalcev z močnimi antioksidativnimi lastnostmi [19–21]. GSH regenerira tudi druge oksidirane antioksidante, kot sta vitamin C in vitamin E. Sodeluje tudi pri popravljanju strukture beljakovin, lipidov in molekul nukleinske kisline, poškodovanih z oksidacijo [22]. Glutation peroksidaze (GPx) s svojo visoko afiniteto do vodikovega peroksida uporabljajo reducirano obliko glutationa za redukcijo vodikovega peroksida v vodo in njegovo odstranjevanje iz telesa [1]. Redoks cikel GSH sklene glutation reduktaza, ki katalizira redukcijo oksidirane oblike glutationa v reducirano obliko [1]. Ta proces je pomemben za vzdrževanje ustreznega celičnega razmerja glutationa v njegovi reducirani in oksidirani obliki [23].

CISTANCHE BO IZBOLJŠAL LEDVIČNO/LEDVIČNO OKVARJO

Končno glutation S-transferaza (GST) katalizira konjugacijo GSH na široko paleto endogenih in eksogenih elektrofilnih spojin [24–26]. GST konjugacija je prvi korak na poti merkapturne kisline, ki vodi do izločanja strupenih spojin. GST igra pomembno vlogo pri razstrupljanju različnih škodljivih ksenobiotikov, tako eksogenih kot endogenih, pa tudi pri rakotvornih procesih biotransformacije [27]. Pri sesalcih je GST prisoten v vseh organih in tkivih, vendar je največja vsebnost encima vjetra[21]. Drug cilj naše študije je bil preizkusiti napoved, da lahko kratkoročno prehransko dopolnjevanje s Pinnularia Borealis izboljša dejavnike tveganja za bolezni srca in ožilja. Da bi to naredili, smo izmerili koncentracije triacilglicerolov in celotnega holesterola vjetrainledvicelaboratorijskih miši.

Materiali in metode

Ta študija je bila narejena na univerzi Jan Kochanowski v Kielcah na Poljskem. Vse eksperimentalne postopke je odobril lokalni odbor za etiko v raziskavah na živalih v Varšavi na Poljskem (odločba št. 37/2019). Poskus je vključeval dve stopnji študije: (1) pripravo Pinnularia Borealis za uporabo kot prehransko dopolnilo in (2) raziskavo in vivo na 6-teden starih švicarskih miših.

2.1. Pripravek Pinnularia Borealis Zaplate alg so postrgali z borovih vejic, zbranih v jami Głowoniowa Nyza˙ (Tatre, Poljska), in jih dali v sterilne plastične vrečke ter prepeljali v laboratorij, kjer so alge gojili na steklenih Petrijevih ploščah, ki so vsebovale svež agar, sestavljen iz 1 odstotkov Boldovega bazalnega medija [28]. Kulture so vzdrževali pri temperaturi 20 ◦C v ciklu 12-h svetlobe/12-h teme pri 300{{5{ {60}}}} µEmm2 s悆1 l× (40 W hladne FL fluorescentne cevi). Po približno dveh do treh mesecih od prvega pojava alg je bila opravljena mikroskopska študija. Material je bil opazovan v živem stanju in identificiran s svetlobnim mikroskopom Nikon Eclipse E 600 (Nikon, Tokio, Japonska), fotografije pa so bile posnete z digitalnim fotoaparatom Coolpix 4500 (Nikon, Tokio, Japonska). Celice so bile fiksirane v 3-odstotnem glutaraldehidu v 0,1 M fosfatnem pufru pri pH 7,1, naknadno osmicirane v 1-odstotnem osmijevem tetroksidu in nato infiltrirane v Spurrov medij [29]; mikrofotografije so bile posnete s transmisijskim elektronskim mikroskopom (TEM) TESLA BS 500. Pinnularia Borealis je bila identificirana v skladu z [30] in z obrnjenim mikroskopom Nikon Eclipse Ti ter fotografirana s konfokalno opremo Nikon A1 (Nikon, Tokio, Japonska). Laserske glave 405.488.561 nm in sistem zaznavanja so bili detektor PMT-DU4 v območju 400–820 nm, inverzna leča Plan Apo VC 100XOil, živosrebrna osvetlitev Nikon C-HgFiE in digitalni fotoaparat DS0Fi1C-U3. Z zajemom podatkov v Nikon NIS-Elements so bile pridobljene digitalne slike, ki so bile obdelane s programom Adobe Photoshop CS5 (Adobe, San Jose, CA, ZDA). Profil metilnih estrov maščobnih kislin (FAME) v posušeni Pinnularia Borealis smo analizirali s plinsko kromatografijo in masno spektrometrijo (GC-MS) z uporabo instrumenta Clarus 600T podjetja PerkinElmer (Waltham, MA, ZDA) na podlagi metode Guzmana et al. [31]. Vsebnost zmrznjeno posušene P. Borealis v ωn-3 PUFA je bila naslednja: ωn-3 PUFA (v odstotkih skupnih maščobnih kislin), skupno=28 odstotkov in EPA {{45 }} odstotkov. Identificiranih in izmerjenih je bilo skupno 14 maščobnih kislin: miristinska kislina (C14:0), palmitinska kislina (C16:0), palmitoleinska kislina (C16:1 n-7), heksadekadienojska kislina (C16:2 n{{ 56}}), heksadekatrienojska kislina (C16:3), stearinska kislina (C18:0), oleinska kislina (C18:1 n-9), linolna kislina (C18:2 n-6), - linolenska kislina (C18:3 n-3), arahidonska (C20:4 n-6), eikosapentaenojska kislina (C20:5 n-3), eruka kislina (C22:1 n{{ 79}}) in dokozaheksaenojsko kislino (C22:6 n-3).

2.2. Preskusi na živalih in obdelava tkiv

2.2.1. Skupine živali in zdravljenje

Skupno 40 samcev švicarskih miši, starih 6 tednov z začetno telesno težo 20,5 g ± 0,5 g, smo kupili pri Inštitutu za genetiko in biotehnologijo živali v Poljska akademija znanosti (Jastrz ˛ebiec, Poljska). Živali so bile v standardnih laboratorijskih pogojih pri stalni temperaturi 20–22 ◦C in relativni vlažnosti 55 odstotkov ± 10 odstotkov v 12--urnem svetlobnem ciklu (12L-12D ). Vsi posamezniki so bili nameščeni v standardne polikarbonatne kletke (252 × 167 × 140 mm), prekrite z nerjavnimi pokrovi z vgrajenim zbiralnikom za krmo. Hrana (terenska postaja Łomna-Las, Poljska) in voda sta bili na voljo delirij. Pet osebkov je bilo nameščenih v eno kletko. Vse miši so dobile standardno hrano, ki je vsebovala (glede na težo) 20,5 odstotka beljakovin, 10 odstotkov maščob (0,28 g PUFA), 62 odstotkov ogljikovih hidratov, 6,5 odstotka mineralov (kalcij 1,9 odstotka, fosfor 1,6 odstotka, magnezij 1,2 odstotka, natrij). 0,9 odstotka in kalija 0,9 odstotka) ter 1 odstotek vitaminov (retinol 25.000 IU, holekalciferol 1.000 IU, tiamin 300 mg, riboflavin 20 mg, piridoksin 15 mg, kobalamin 40 mg, askorbinska kislina 58 mg, kinoni 5 mg, tokoferoli 125 mg, folna kislina 3 mg, biotin 100 µg, nikotinska kislina 60 mg, pantotenska kislina 35 mg in holin klorid 1000 mg). Miši so imele ves čas študije prost dostop do hrane in vode. Po enem tednu privajanja na laboratorijske pogoje smo miši naključno razdelili v 4 skupine (10 miši na skupino). Naslednjih 7 dni so miši hranili z različnimi dietami:

(1) kontrolna skupina je prejela standardno dieto; (2) druga skupina je bila hranjena s standardno prehrano, dopolnjeno z 1-odstotno raztopino liofiliziranega P. Borealis (0.16 mg EPA); (3) tretja skupina je bila hranjena s standardno prehrano, dopolnjeno s 3-odstotno raztopino liofiliziranega P. Borealis (0.48 mg EPA); in (4) četrta skupina je bila hranjena s standardno prehrano, dopolnjeno s 5-odstotno raztopino liofiliziranega P. borealis (0.8 mg EPA). Liofilizirane vodne raztopine P. borealis smo dajali peroralno enkrat na dan v volumnu 50 µL. Miši so imele ves čas študije prost dostop do hrane in vode. Pri živalih smo dvakrat (med poskusom) spremljali povečanje telesne mase, dvakrat smo merili tudi njihov vnos hrane. Raztopine liofiliziranih diatomej so bile opremljene s konvencionalno enokanalno mikropipeto p200 (Gilson Pipetteman, Thermo Fischer Scientific, Reinach, Švica) in konico pipete smo ponudili ustom, dokler miš ni začela piti.

CISTANCHE BO IZBOLJŠAL LEDVIČNE/LEDVIČNE BOLEČINE

2.2.2. Odvzem vzorcev tkiva

Po enem tednu dodajanja hrane so miši obglavili in jihjetrain ledvice so bile razrezane. Thejetraje bil perfundiran z ohlajeno fiziološko raztopino (4 ◦C), da se odstrani vsa preostala kri. Fragmente tkiva (100 mg/1 ml pufra) smo homogenizirali s TH 220-PCRH-Omni TH homogenizatorjem v 0,1 M fosfatnem pufru s pH 7,4, ki je vseboval 10 mM EDTA. Homogenate smo centrifugirali 15 minut pri 12.000 obratih na minuto v laboratorijski centrifugi s hlajenjem MPW-351 R. Po centrifugiranju smo supernatante takoj zamrznili v tekočem dušiku in shranili pri t 40 ◦C za nadaljnjo analizo .

2.2.3. analitične metode,V tkivnih supernatantih smo spektrofotometrično izmerili koncentracijo reduciranega glutationa, aktivnost glutation peroksidaze, glutation reduktaze, glutation transferaze, koncentracije holesterola, triacilglicerolov, beljakovin in malondialdehida [32].

2.3. Reducirani glutation (GSH)Koncentracijo GSH smo določili z Glutation Assist Kit (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Nemčija, kat. št. CS0260), v skladu s postopkom proizvajalca. Vzorci so bili najprej deproteinizirani s 5-odstotno 5-raztopino sulfosalicilne kisline in centrifugirani, da so odstranili oborjene beljakovine. Merjenje GSH uporablja kinetični test, pri katerem katalitične količine GSH povzročijo stalno redukcijo 5,5 ditiobis (2-nitrobenzojske kisline) (DTNB) v 5-tio-2nitrobenzojsko kislino (TNB) , ki ima rumeno barvo. Intenzivnost barve smo izmerili spektrofotometrično pri 412 nm.

2.4. Glutation peroksidaza (GPx)Aktivnost glutation peroksidaze je bila izmerjena s kompletom Glutation Peroxidase Cellular Activity Assay Kit (Sigma–Aldrich, Darmstadt, Nemčija, kat. št. CPG1). Metoda temelji na oksidaciji glutationa (iz GSH v obliko GSSG), ki jo katalizira GPx, ki je povezana z recikliranjem GSSG nazaj v GSH z uporabo glutation reduktaze in NADPH. Zmanjšanje absorbance NADPH, izmerjene pri 340 nm med oksidacijo NADPH v NADP plus, kaže na aktivnost GPx.

2.5. Glutation Transferaza (GST)Glutation transferazo smo izmerili s kompletom za testiranje glutation S-transferaze (GST) (Sigma–Aldrich, Darmstadt, Nemčija, kat. št. CS0410). Načelo preizkusa temelji na dejstvu, da GST katalizira konjugacijo L-glutationa na 1-kloro-2,4- dinitrobenzen (CDNB) prek tiolne skupine glutationa. Konjugat GS-DNB absorbira pri 340 nm. Hitrost povečanja absorpcije je neposredno sorazmerna z aktivnostjo GST v vzorcu.

2.6. Glutation reduktaza (GR)Aktivnost glutation reduktaze je bila izmerjena s kompletom za testiranje glutation reduktaze (Sigma–Aldrich, Darmstadt, Nemčija, kat. št. GRSA). Aktivnost je bila izmerjena s povečanjem absorbance, ki ga je povzročila redukcija DTNB [5,5" ditiobis(2-nitrobenzojska kislina)] pri 412 nm.

2.7. Vsebnost holesterolaVsebnost holesterola smo določili s testom Biochemtest po metodi [33]. Estre holesterola smo hidrolizirali s holesterol esterazo (CE) v prosti holesterol in maščobne kisline. Absorpcijo testnega vzorca smo izmerili pri 505 nm.

2.8. Vsebnost triacilglicerolovVsebnost triacilglicerolov je bila določena s testom Alpha Diagnostic [34]. Načelo preizkusa temelji na dejstvu, da triacilglicerole hidrolizira lipaza v proste maščobne kisline in glicerol, nato pa jih fosforilira ATP. Intenzivnost barve je bila izmerjena pri 520 nm.

CISTANCHE BO IZBOLJŠAL LEDVIČNO/LEDVIČNO DIALIZO

2.9. Koncentracija malondialdehida (MDA).Koncentracijo MDA smo izmerili spektrofotometrično z uporabo testa tiobarbiturne (TBA) kisline. Za izvedbo testa smo {{0}}.5 mL vzorca dodali k reakcijski zmesi (1.0 mL), sestavljeni iz enakih delov 15-odstotne tris kloroocetne kisline (TCA), v 0.25 N HCL in 0.375 odstotkov tiobarbiturne kisline (TBA) v 0,25 N HCL in segrevamo pri 95 ◦C 30 minut. Po ohlajanju in centrifugiranju smo intenzivnost rožnate barve adukta TBA-malondialdehid izmerili spektrofotometrično pri 532 nm [35].

2.10. Vsebnost beljakovinVsebnost beljakovin je bila določena po metodi [36]. Lowryjev proteinski test temelji na reakcijah bakrovih ionov s peptidnimi vezmi (s Folin-Ciocalteu reagentom, tj. zmesjo fosfovolframove kisline in fosfomolibdne kisline) v alkalnih pogojih (biuretov test) z oksidacijo ostankov aromatskih beljakovin ( predvsem triptofan in tirozin). Cistein je tudi reaktiven na reagent. Koncentracijo obarvanega kompleksa smo izmerili spektrofotometrično pri valovni dolžini λ=750 nm.

2.11. Statistična analizaVsi rezultati so predstavljeni kot povprečja s standardnimi odkloni (SD). Biokemične parametre smo primerjali z analizo variance ANOVA, ki ji je sledil Tukeyjev post hoc test. Spremembe telesne mase in porabe hrane so primerjali s t-testom dveh vzorcev. Te analize so bile narejene s programsko opremo Statistica 9.0 [37]. Podatki so predstavljeni tudi v odstotkih, ob predpostavki, da so kontrolne vrednosti 100 odstotkov. Statistična značilnost je bila nastavljena na p < 0,05="" in="" p="">< 0,01.="" poleg="" tega="" so="" bile="" opravljene="" analize="" neposredne="" ordinacije="" cca="" s="" permutacijskimi="" testi="" monte="" carlo,="" da="" bi="" ugotovili,="" kateri="" izmed="" izmerjenih="" biokemičnih="" parametrov="" pomembno="" razlikujejo="" sklope="" študij.="" te="" analize="" so="" bile="" narejene="" s="" programsko="" opremo="" canoco="" 5.0="" [38],="" ločeno="">jetra in ledvice.

3. Rezultati

Koncentracija oziroma aktivnost vseh delov glutationskega antioksidantnega sistema je odvisna od prehranskih dopolnil, tako vjetra in ledvice. Pred poskusom so miši tehtale 20,5 g ± 0,5 g. Po enem tednu dopolnjevanja z različnimi raztopinami diatomeje se miši niso razlikovale v telesni masi [t== 1.75, p=0.088]. Tudi poraba hrane se med skupinami ni razlikovala in miši so v povprečju zaužile 2,5 ± 0,4 g hrane na dan. Vendar pa se po enem tednu dodajanja vsebnosti holesterola in triacilglicerola vjetraledvic in ledvic zmanjšala v primerjavi s kontrolno dieto, aktivnost glutation reduktaze in koncentracija malondialdehida pa sta se znatno povečala, neodvisno od koncentracije raztopine diatomeje, v obehjetrain ledvice.

V jetrih se je aktivnost GPx nenehno zmanjševala s povečanjem vsebnosti Pinnularia Borealis (F (3, 36)=3.80, p=0.018) (slika 1A). Največje znižanje (78,18 odstotka) je bilo ugotovljeno vjetramiši, hranjenih s 5-odstotno raztopino (slika 1A, tabela 1). V ledvicah je bil vzorec skoraj nasproten (F (3, 36)=13.08, p=6.2 × 10 6 ) (slika 1A) in največja aktivnost GPx so zabeležili pri živalih, ki so prejemale 3-odstotno raztopino diatomeje (slika 1A, tabela 1). Spremembe koncentracije glutationa po prehranskih dopolnilih niso pokazale enotnega vzorca, niti vjetra(F (3, 36)=5.44, p=0.003) (slika 1B) ali v ledvicah (F (3, 36)=23.12, p {{ 11}}.6 × 10悆 8 ) (slika 1B). Po 7 dneh prehranskega dopolnila s 5-odstotno raztopino se je koncentracija GSH vjetrazmanjšala na ~82 odstotkov kontrolnih vrednosti, vendar ta razlika ni bila pomembna (slika 1B, tabela 1). Pomembna razlika v vsebnosti GSH je bila zabeležena le med mišmi, hranjenimi s 3- in 5-odstotno raztopino diatomeje. V ledvicah je bila največja vsebnost GSH zabeležena pri živalih, hranjenih s 3-odstotno raztopino diatomeje (slika 1B, tabela 1).

Aktivnost glutation reduktaze se je znatno povečala, neodvisno od koncentracije raztopine diatomeje, tako vjetra(F (3, 36)=29.34, p=8.9 × 10 10) (slika 1C) inledvica(F (3, 36)=9.85, p=7.0 × 10 5 ) (slika 1C), na splošno pa je bil veliko višji vjetrakot vledvica(p < 0,05).="" aktivnost="" gr="" po="" dodatku="" s="" 5-odstotno="" raztopino="" je="" dosegla="" do="" 290="" odstotkov="" kontrolne="" vrednosti="">jetra(Slika 1C) in do 180 odstotkov kontrolne vrednosti vledvica(Slika 2, tabela 1).

GST dejavnost vledvicanenehno povečevala z naraščajočo vsebnostjo Pinnularia Borealis v hrani (F (3, 36)=15.59, p=1.2 × 10 6 ) (slika 1D). Najvišja aktivnost je bila zabeležena po dodatku s 5-odstotno raztopino, ko je dosegla 158 odstotkov kontrolne vrednosti (slika 1D). GST dejavnost vjetraje bil opazno višji kot vledvica(p < 0,05).="" čeprav="" dejavnost="" gst="">jetraje bil odvisen od prehrane (F (3, 36)=11.62, p=1.8 × 10 5) (slika 1D), ni pokazal tako pravilnega vzorca kot pri theledvica(Slika 1D). Koncentracija malondialdehida se je stalno povečevala tudi z večanjem vsebnosti Pinnularia Borealis v hrani, tako vjetra(F (3, 36)=4.26, p=0.011) (slika 1E) in vledvica(F (3, 36)=6.74, p=0.001) (slika 1E). V obeh primerih je bila največja koncentracija MDA zabeležena po hranjenju s 5-odstotno raztopino diatomej (slika 1E). Spremenljivke, pomembne za raznolikost nabora podatkov, skupaj predstavljajo 55,9 odstotka celotne variabilnosti vjetrain 53,9 odstotka vledvica(sliki 2 in 3). V ledvicah je bila v kontrolnih vzorcih ugotovljena statistično pomembna povezava med visokim holesterolom in trigliceridi. Pomemben je bil tudi dvig ravni GSH s 3-odstotnim dodatkom diatomeje. Podobno je bilo povečanje GR pomembno povezano z dodatkom 5 odstotkov diatomeje (slika 3). V jetrih je povečanje koncentracije MDA koreliralo s 5-odstotno primesjo diatomeje. Razmerje je bilo statistično pomembno. Statistično značilno je bilo tudi povečanje ravni GSH in GR pri nizkih koncentracijah diatomej v krmi (slika 2).

Triacilgliceroli in vsebnost holesterola vjetrainledvicaso bile podobne (slika 1F,G). Prehranska dopolnila z diatomejami so pomembno vplivala na koncentracijo triacilglicerolov, tako vjetra(F (3, 36)=16.22, p=7.8 × 10 7 ) in vledvica(F (3, 36)=7.89, str=0.0004). V primerjavi s kontrolnimi skupinami je po 3- in 5-odstotni raztopini diatomejejetratriacilgliceroli zmanjšali na 75,25 odstotka oziroma 65,84 odstotka, vledvicana 92 ​​(ns) oziroma 73,16 odstotka. Podobno je obogatitev prehrane z diatomejami zmanjšala vsebnost holesterola, tako vjetra(F (3, 36)=2.57, p=0.07) in vledvica (F (3, 36)=14.90, p =1.8 × 106). Največje znižanje vsebnosti holesterola so zabeležili v organih miši, hranjenih s 5-odstotno raztopino diatomeje.

4. Razprava

V tej študiji smo postavili vprašanje, ali lahko prehransko dopolnilo s Pinnularia Borealis poveča antioksidativno obrambo in ublaži dejavnike tveganja za bolezni srca in ožilja. Ugotovili smo, da so koncentracije holesterola in triacilglicerola vjetrainledviceso bile najnižje pri miših, ki so bile hranjene z najvišjo koncentracijo P. Borealis, kar kaže na zaščitne lastnosti alg. Poleg tega je najnižja koncentracija P. Borealis zadostovala za izboljšanje antioksidativne sposobnosti miši. Alge so potencialni in naravni vir dolgoverižnih polinenasičenih maščobnih kislin (PUFA), kot sta eikozapentaenojska kislina (EPA) in dokozaheksaenojska kislina (DHA). Na splošno se vsebnost lipidov v fototrofnih algah giblje od 10 do 60 odstotkov suhe teže in vsebujejo 10–20 odstotkov ω-3 PUFA [4]. Profili maščobnih kislin v algah so genetsko določeni, vsebnost maščobnih kislin pa je odvisna tudi od intenzivnosti svetlobe in slanosti vode [39]. Ryckebosch et al. [40] so poročali, da se velike količine EPA ali DHA kopičijo v morskih algah: Bacillariophyceae, Chlorophyceae, Chrysophyceae, Cryptophyceae in Florideophyceae. Peltomaa et al. [39] je predlagal, da so lahko sladkovodne alge bogatejše z ω-3 PUFA kot morske in somornice, koničasta sladkovodna diatomeja Nitzschia sp. kot najbolj obetaven sev diatomeje za komercialno proizvodnjo EPA. Nitzschia laevis vsebuje skupaj 75,9 odstotka EPA, 37,4 odstotka EPA se kopiči v obliki triacilglicerola, 22,6 odstotka v obliki monoacilgliceridov in 15,9 odstotka v obliki fosfatidilholina [41]. V P. Borealis, uporabljenem v tej študiji, so ω-3 PUFA predstavljale 28 odstotkov vseh maščobnih kislin, EPA pa 32 odstotkov vseh ω-3 PUFA. Človeški EPA se pridobiva s prehrano, predvsem iz ribjega olja. Je esencialna maščobna kislina s pomembno hranilno vrednostjo in ima sposobnost ublažiti tveganje za številne bolezni. Zato so potrebni alternativni viri ribjemu olju, da bi pokrili naraščajoče potrebe po PUFA. Diatom P. Borealis kopiči visoke ravni (32 odstotkov) EPA in se zato lahko obravnava kot prehransko dopolnilo.

Ugotovili smo, da je prehransko dopolnilo z raztopinami liofilizirane diatomeje P. Borealis različnih koncentracij povzročilo od odmerka odvisno znižanje koncentracije holesterola in triacilglicerola. Zaradi velikih razlik v vsebnosti holesterola v kontrolni skupini ta učinek ni dosegel stopnje pomembnosti vv živor (p=0.07), vendar je bil očiten dosleden trend. Vledvica,koncentracija holesterola pri miših, ki so jim dodali najvišjo 5-odstotno raztopino diatomeje, se je zmanjšala za ~30 odstotkov. Dosledno se je vsebnost triacilglicerola izrazito zmanjšala, tako vjetrainledvica. Predvidevamo, da je bilo zmanjšanje vsebnosti holesterola in triacilglicerola posledica prehranskih dopolnil s PUFA, ki so znane po svojem zaščitnem učinku [1]. P. Borealis je kserofitna diatomeja, ki ne vsebuje le visoke koncentracije EPA, ampak tudi več bioaktivnih spojin, kot so pigmenti, vlakna in fitosteroli, ki so vsi koristni za zdravje [5,8]. Podobne rezultate so dobili Sano et al. [42], ki je opazil pomembne antilipidemične in antiaterosklerotične učinke dodajanja diete z algami Chlorella Vulgaris pri kuncih, ki so bili 10 tednov hranjeni z dieto z visoko vsebnostjo holesterola. Fallah et al. [43] so dokazali, da lahko uživanje klorele zniža tudi raven holesterola pri bolnikih s hiperholesterolemijo. Te možne koristi za zdravje pripisujejo posebnim sestavinam klorele, kot so minerali, prehranske vlaknine, beljakovine in ω-3 PUFA. Cherng et al. [44] je prav tako pokazalo, da ima Chlorella pyrenoidosa sposobnost preprečevanja dislipidemije pri modelih podgan in hrčkov, hranjenih z dieto z visoko vsebnostjo maščob, ki vsebuje 20 odstotkov hidrogeniranega kokosovega olja (bogato z nasičenimi maščobnimi kislinami). Več študij je pokazalo, da je pri živalih, hranjenih z visoko vsebnostjo maščob, večja verjetnost za razvoj dislipidemije in hiperglikemije [45], insulinske rezistence [46], jetrne steatoze [47], agregacije trombocitov [48] in oksidativnega stresa [49]. Tako lahko pravilna prehrana, bogata s PUFA, zmanjša dejavnike tveganja za te bolezni.

CISTANCHE BO IZBOLJŠAL OKUŽBO LEDVIC/LEDVIC

Lee et al. [50] je pokazalo, da je pri moških korejskih kadilcih dodatek Chlorella Vulgaris ohranil status antioksidantnih hranil v plazmi in izboljšal aktivnost antioksidativnih encimov v eritrocitih. Reaktivne kisikove vrste in prosti radikali so lahko škodljivi za lipide, beljakovine in DNK ter lahko sprožijo številne človeške bolezni, kot so nevrodegenerativne in kardiovaskularne bolezni [51]. V tej študiji smo predvideli, da bi prehranski dodatek s P. Borealis ublažil oksidativni stres, ker lahko PUFA zmanjšajo oksidativno škodo in vivo [1]. Najvišja pa je bila koncentracija malondialdehida (MDA), markerja oksidativnega stresa, tako vjetrainledvica, pri miših, dopolnjenih s 5-odstotno raztopino diatomeje (sliki 2 in 3). Malondialdehid je v veliki meri posledica peroksidacije PUFA, in čeprav je manj nevaren, kot se je prej mislilo, je še vedno toksičen, imunogen in mutagen [1]. Vendar pa MDA lahko izvira ne samo iz lipidne peroksidacije, ampak tudi iz hrane. Tako je verjetno, da visoka vsebnost MDA ni povezana z oksidativnim stresom, temveč z visoko vsebnostjo EPA v prehranskem dopolnilu. Dejansko se aktivnost glutation peroksidaze (GPx) ni spremenila ali se je celo zmanjšala po dodatku k prehrani (slika 2). Encimi GPx katalizirajo redukcijo vodikovega peroksida in ščitijo organizem pred oksidativnimi poškodbami. Torej, če bi se oksidativni stres povečal, bi se aktivnost GPx povečala. Nerazumljivo se je aktivnost GPx povečala vledvicamiši, hranjenih s 3-odstotno raztopino diatomeje, vzporedno s povečanjem vsebnosti GSH (slika 3). Najverjetneje je zato koncentracija GSH pojasnila 23,7 odstotka variance vledvica(Slika 3). Ti rezultati bi lahko nakazovali povečanje oksidativnega stresa v tej skupini. Vendar aktivnost glutation reduktaze (GR) vjetrainpovečana ledvicapo dodatku k prehrani, neodvisno od raztopine diatomeje (slika 2). V jetrih je aktivnost GR pojasnila 39,7 odstotka variance (slika 2). Ta encim je ponovno pretvoril oksidirani glutation v njegovo reducirano obliko, da je ohranil ustrezen oksidacijsko-redukcijski potencial in zaščitil -SH skupine proteinov pred oksidacijo [22]. Približno 2–2.5-kratno povečanje aktivnosti GR v vseh skupinah kaže, da so tudi z najnižjo raztopino Pinnularia Borealis antioksidativni mehanizmi izboljšani. Koncentracija reduciranega glutationa (GSH) se je zmanjšala samo pri miših, ki so jim dodali 5-odstotno raztopino diatomeje. Lahko kaže, da so nižje koncentracije bolj koristne. GSH je močan antioksidant, ki je tudi kofaktor za glutation peroksidaze in glutation transferaze [1]. Glutation transferaze so skupina encimov, ki sprožijo razstrupljanje endogenih in eksogenih celičnih škodljivih spojin, vključno z reaktivnimi kisikovimi spojinami. Najvišja aktivnost glutation transferaze (GST) pri miših, dopolnjenih s 5-odstotno raztopino diatomeje, lahko pojasni tudi najnižjo vsebnost GSH pri teh živalih. Tako sklepamo, da je prehransko dopolnilo s P. Borealis koristno za redoks sistem GSH, če ga uporabimo v raztopini do 3 odstotkov. Višje koncentracije imajo lahko škodljive učinke, ki jih ni mogoče nadomestiti z znižanjem vsebnosti holesterola ali triacilglicerola. Vendar pa se prehranske PUFA lahko vgradijo v celične lipide v različnih obsegih in imajo lahko kot take različne učinke, odvisno od celične strukture ali tkiva [52]. To bi lahko delno pojasnilo razlike v parametrih antioksidativnega sistema medledvicain jetra. Poleg tega so lahko maščobne kisline, pridobljene s hrano, desaturirane ali podaljšane, predvsem v endoplazmatskem retikulumu [53]. Vsebnosti EPA nismo merili vjetrainledvica,zato ne moremo natančno reči, kakšna je bila vsebnost EPA v tkivih, vendar smo prepričani, da rezultati niso naključni, saj je najnižja koncentracija P. Borealis zadostovala za izboljšanje antioksidativne sposobnosti

Poleg tega je vedno več dokazov, da različne PUFA, ki se uporabljajo kot prehranska dopolnila, niso enake, saj imajo PUFA ne samo pro-, ampak tudi antioksidativne lastnosti in tako lahko modulirajo endogeno antioksidativno obrambo [52]. Učinki PUFA niso le povezani z dolžino ogljikove verige ali s številom in položajem dvojnih vezi. Med petimi različnimi raziskanimi PUFA (arahidonska (20:4 ω-6), linolna (18:2 ω-6), -linolenska (18:3 ω-3), eikosapentaenojska (20: 5 ω-3) in dokozaheksaenojska (22:6 ω-3)) samo DHA je povečala antioksidativno obrambo v kulturi celične linije človeškega hepatoma, medtem ko je arahidonska kislina povzročila oksidativno škodo [51,54]. V drugih študijah in vitro so avtorji [55] pokazali, da imata eksogena EPA in DHA najmočnejše antioksidativne lastnosti in sta veliko bolj učinkovita pri odstranjevanju ROS kot ω-6 PUFA.

Kolikor nam je znano, je to prva študija P. Borealis kot prehranskega dopolnila. Alge lahko sintetizirajo številne spojine z močnimi zdravstvenimi koristmi [56]. Koyande et al. [45] so pokazali, da imajo aktivne spojine v algah antikarcinogene, antioksidativne in antihipertenzivne lastnosti. Eden od naravnih načinov za odpravo tveganj za nevrodegenerativne in srčno-žilne bolezni je lahko prehrana, bogata z ω-3 PUFA [38]. Nekatere alge so razvrščene kot vir hrane v kategorijo GRAS [57], diatomeja P. Borealis pa je bila priznana kot bogat vir večkrat nenasičenih maščobnih kislin, kot je EPA [58]. Človeški EPA se danes pridobiva s prehrano, predvsem iz ribjega olja. Je esencialna maščobna kislina s pomembno hranilno vrednostjo in zmožnostjo zmanjšanja tveganja za številne bolezni. Zato so potrebni alternativni viri ribjemu olju, da bi pokrili naraščajoče potrebe po PUFA. Diatom P. Borealis kopiči visoke ravni (32 odstotkov) EPA in se zato lahko obravnava kot prehransko dopolnilo.

5. Sklepi

Rezultati naše raziskave kažejo, da se Pinnularia Borealis lahko uporablja kot prehransko dopolnilo, ki ima koristi za zdravje. Če je zaužit v ustrezni količini, lahko poveča antioksidativno obrambo in ublaži dejavnike tveganja za bolezni srca in ožilja. Alge so dobra alternativa ribjemu olju, saj odpravljajo težave z vonjem in nestabilnostjo produktov ekstrakcije.