Inhibitorni učinek izvlečka Gastrodia Elata Blume na melanogenezo, ki jo povzroča alfa-melanocitni stimulacijski hormon, pri mišjem melanomu B16F10
May 17, 2023
OZADJE/CILJI:Gastrodia elata Blume (GEB), tradicionalno zeliščno zdravilo, se v orientalski medicini uporablja za zdravljenje številnih nevroloških motenj (npr. paralize in kapi) in težav s kožo (npr. atopičnega dermatitisa in ekcema). Ta študija je bila zasnovana za raziskovanje, ali izvleček GEB zavira aktivnost melanogeneze pri mišjem melanomu B16F10.
Glede na ustrezne študije je cistanča pogosta rastlina, ki je znana kot "čudežna rastlina, ki podaljšuje življenje". Njegova glavna sestavina je cistanozid, ki ima različne učinke, kot so antioksidativni, protivnetni in spodbujanje imunske funkcije. Mehanizem med cistanho in beljenjem kože je v antioksidativnem učinku cistanche glikozidov. Melanin v človeški koži nastane z oksidacijo tirozina, ki jo katalizira tirozinaza, oksidacijska reakcija pa zahteva sodelovanje kisika, zato radikali brez kisika v telesu postanejo pomemben dejavnik, ki vpliva na proizvodnjo melanina. Cistanche vsebuje cistanozid, ki je antioksidant in lahko zmanjša nastajanje prostih radikalov v telesu ter tako zavira nastajanje melanina.
Kliknite na dodatek Cistanche Tubulosa
Za več informacij:
david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
UVOD
Na barvo človeške kože vpliva genetika in številni dejavniki, predvsem količine in vrste melanina. Melanin nastaja v melanosomih melanocitov in se prenaša iz melanocitov v keratinocite v bazalni plasti povrhnjice kot odgovor na izpostavljenost kože sončni svetlobi, stresu in dejavnikom, ki spodbujajo melanin [npr. alfa-melanocite stimulirajoči hormon (-MSH) , dušikov oksid in endotelin-1] [1,2]. Na primer, -MSH spodbuja melanogenezo z indukcijo transkripcijskega faktorja, povezanega z mikroftalmijo (MITF), ki je močan induktor encimov, specifičnih za melanocite, kot so tirozinaza, protein, povezan s tirozinazo (Trp)1 in Trp2 [1]. Proizvodnja melanina je primarno regulirana s tirozinazo, encimom za apnenje melanogeneze, ki katalizira hidroksilacijo tirozina v 3,4-dihidroksifenilalanin (L-DOPA) z mikofenolatom in oksidacijo L-DOPA v dopakinon z difenolazo, kar je običajen korak za biosintezo eumelanina in feomelanina. Naslednji koraki vključujejo dva dodatna encima, specifična za melanocite, Trp1 in Trp2 (znana tudi kot dopakrom tavtomeraza), za proizvodnjo eumelanina (rjav/črn pigment) in s cisteinom/glutationom povezan neencimski korak za proizvodnjo feomelanina (rdeč/rumen). pigment), oz. Zaviralci tirozinaze, kot so hidrokinon [3,4], kojična kislina [5], askorbinska kislina [6] in arbutin [7], so bili uporabljeni za zdravljenje motenj hiperpigmentacije, vendar so pred kratkim poročali o številnih stranskih učinkih pri ljudeh [1, 2]. Zato se veliko pozornosti namenja iskanju varnejših in učinkovitejših melanogenih inhibitorjev iz naravnih virov, ki lahko sprožijo depigmentacijo brez stranskih učinkov.
Gastrodia elata Blume (GEB), orhideja brez klorofila, potrebuje simbiotske glive Mycena osmundicola in Armillaria mellea za kalitev oziroma rast/zorenje [8, 9]. GEB se uporablja kot orientalsko zdravilo za zdravljenje nevrodegenerativnih motenj (npr. paraliza, vrtoglavica, možganska kap, epilepsija in demenca) [9,10]. Iz GEB so bile izolirane različne bioaktivne spojine, najpomembnejše so fenolne spojine, kot so gastrodin, 4-hidroksibenzilalkohol, 4-hidroksibenzaldehid, vanilin, vanilijalkohol in vanilijeva kislina [{{6} }}]. Nedavno so poročali, da imajo bioaktivne spojine GEB zaviralno moč za aktivnost tirozinaze [13-16]. Poleg tega so nedavne študije identificirale ergotionein (Ergo) [8,11] in diosgenin [17] pri GEB. Ergo najdemo predvsem v gobah [18,19], medtem ko je diosgenin v divjem jamu [20]. Obe sta bili leta 2010 uvrščeni med 10 najboljših botaničnih sestavin, prisotnih v kremah proti staranju, zaradi njihove močne antioksidativne aktivnosti [21], kar nakazuje, da se GEB lahko uporablja kot funkcionalno kozmetično sredstvo in tudi v zdravilni hrani.
Čeprav obstajajo poročila o sestavi liofiliziranega in s paro posušenega GEB [22], njegovih kemičnih sestavinah [11,12,23] ter antioksidativnih [12], antitrombocitnih in antitrombotičnih [24] učinkih, le malo je znan o zaviralnih učinkih ekstrakta GEB na sintezo melanina in njegovih ustreznih encimov pri melanomu B16F10. Ker se GEB uporablja kot tradicionalno zdravilo za nevrološke motnje in težave s kožo zaradi njegovih bioaktivnih spojin in antioksidativnih lastnosti, smo analizirali vsebnost melanina in aktivnost tirozinaze ter molekularne ravni transkripcijskih faktorjev in regulacijskih encimov pri mišjem melanomu B16F10.
MATERIALI IN METODE
Priprava izvlečka Gastrodia elata Blume (GEB).
Kultura celic
Test viabilnosti celic
Celice B16F10 so bile nanesene z gostoto 4 × 104 celic/vdolbinico v 24-ploščo z vdolbinicami. 100-odstotno konfluentne celice so bile predhodno obdelane s 0-25 mg/mL ekstrakta GEB 24 ur po obdelavi z/brez 200 nM -MSH (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, ZDA). Medij je bil nadomeščen z 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazolijevim bromidom (MTT; Amresco, Solon, OH, ZDA ) raztopina barvila [5 mg/ml v fiziološki raztopini s fosfatnim pufrom (PBS)] pri 37 stopinjah 3 ure. Supernatant smo dekantirali in soli formazana raztopili v 500 μL izopropanola. Absorbanco smo izmerili pri 570 nm s spektrofotometrom (Gen5.2; Biotek, Winooski, VT, ZDA).
Analiza vsebnosti melanina
Celice B16F10 smo 72 ur obdelali z 0-5 mg/mL ekstrakta GEB ali 400 ug/mL arbutina (pozitivna kontrola; Sigma-Aldrich) po 24-urnem zdravljenju z/brez 200 nM -MSH. Celice smo dvakrat sprali z 1X PBS, čemur je sledila liza v pufru za lizo radioimunoprecipitacijskega testa (RIPA) (Thermo Scientific, Rockford, IL, ZDA) in centrifugiranje pri 14,000 obratih na minuto 10 minut pri 25 stopinjah. Peleto (približno 105 celic) smo raztopili v 1 ml 1N NaOH z 10 odstotki dimetil sulfoksida 2 uri pri 80 stopinjah. Absorbanco supernatanta smo izmerili pri 470 nm. Koncentracija melanina v vzorcih je bila izpeljana iz standardne krivulje sintetičnega melanina (Sigma-Aldrich). Vsak vzorec je bil normaliziran na celotno vsebnost celičnih beljakovin z uporabo metode Pierce® BCA (Thermo Scientific).
Merjenje aktivnosti tirozinaze
Celice B16F10 so bile 72 ur obdelane z 0-5 mg/mL ekstrakta GEB ali 400 ug/mL arbutina (pozitivna kontrola) po zdravljenju z/brez 200 nM -MSH 24 ur. Celice smo dvakrat sprali z 1X PBS, čemur je sledila liza v pufru za lizo RIPA (Thermo Scientific) in centrifugiranje pri 15,000 obratih na minuto 20 minut pri 4 stopinjah. Supernatant (100 μL) smo dali v 96-ploščo z vdolbinicami in zmešali s 100 μL 5 mM L-DOPA ter inkubirali pri 37 stopinjah 2 uri. Absorbanca je bila izmerjena pri 420 nm. Vsak vzorec je bil normaliziran na celotno vsebnost celičnih beljakovin z uporabo metode Pierce® BCA (Thermo Scientific).
Analiza verižne reakcije s polimerazo v realnem času (PCR v realnem času)
Celice B16F10 so bile 72 ur obdelane z 0-5 mg/mL ekstrakta GEB ali 400 ug/mL arbutina (pozitivna kontrola) po zdravljenju z/brez 200 nM -MSH 24 ur. Celotno RNA celic smo izolirali z reagentom Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA) in kompletom za ekstrakcijo RNA (komplet RNase Mini; Qiagen, Hilden, Nemčija). Celotno RNA (2 ug) smo reverzno prepisali z uporabo glavne mešanice reverzne transkripcije (ELPIS, Daejeon, Koreja). PCR v realnem času (LightCycler 96; Roche, Indianapolis, IN, ZDA) je bil izveden z uporabo primerjev: mišji MITF naprej 5'-GGCCAAGGCAGAGCAACTT-3', nazaj 5'-GCCCATGGTGGCAAGCT-3'; tirozinaza naprej 5'-ATAGGTGCATTGGCTTCTGG-3', nazaj 5'-CCAACGATCCCATTTTTCTT-3'; Trp1 naprej 5′-GAGTGACATCCTGTGGCTCA-3′, nazaj 5′-CGATACCCTGGGAACACTTT-3′; Trp2 naprej 5′-GCATCTGTGGAAGGGTTGTT-3′, nazaj 5′-ACTCCTTCCTGAATGGGACC-3′; gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaza (GAPDH) naprej 5′-TCAATGAAGGGGTCGTTGAT-3′, nazaj 5′-CGTCCCGTAGACAAAATGGT-3′. Stopnje ekspresije so bile normalizirane na raven GAPDH.
Western blot analiza
Statistična analiza
REZULTATI
Učinki Gastrodia elata Blume (GEB) na viabilnost celic v celicah B16F10
Da bi preučili potencialno toksičnost izvlečka GEB, smo najprej ovrednotili citotoksičnost GEB z inkubacijo celic B16F10 z različnimi koncentracijami (0-25 mg/mL) izvlečka GEB po obdelavi z/brez 200 nM -MSH 24 h. Ne glede na stimulacijo z -MSH nizke koncentracije GEB (0.5-5 mg/mL) niso zavirale viabilnosti celic, medtem ko so višje koncentracije (10-25 mg/mL) pomembno povzročile toksičnost (slika 1). Viabilnost celic pri 10 in 25 mg/ml GEB je bila 85,9 odstotka oziroma 68,7 odstotka netretirane kontrole. Viabilnost celic pri 10 in 25 mg/ml GEB po stimulaciji z -MSH je bila 89,9 odstotka oziroma 65,3 odstotka neobdelane kontrole. Zato smo v nadaljnjih poskusih uporabili koncentracijo 0-5 mg/mL.
Vpliv Gastrodia elata Blume (GEB) na sintezo melanina in aktivnost tirozinaze v celicah B16F10
Za oceno aktivnosti melanogeneze ekstrakta GEB smo izmerili vsebnost melanina v celicah B16F10, neobdelanih z -MSH, in v celicah B16F10, obdelanih z -MSH. Celice smo predhodno obdelali z/brez -MSH 24 ur, čemur je sledilo zdravljenje z ekstraktom GEB v odmerkih 0-5 mg/mL ali 400 ug/mL arbutina 72 ur. Zdravljenje z GEB je v višjih odmerkih (2-5 mg/mL) znatno zmanjšalo vsebnost celičnega melanina v odvisnosti od odmerka v skupinah, ki so prejemale -MSH, in v vseh skupinah, ki niso prejemale -MSH. Sam -MSH je povečal vsebnost melanina za 180 odstotkov v primerjavi s kontrolo, zdravljenje z GEB pa je izrazito zaviralo sintezo melanina v stanju hiperpigmentacije, ki jo povzroča -MSH, na način, ki je odvisen od odmerka, v primerjavi s skupinami, ki niso prejemale -MSH (slika 2).
Ker je tirozinaza encim, ki omejuje hitrost sinteze melanina, smo ugotavljali zaviralni učinek izvlečka GEB na aktivnost celične tirozinaze v celicah B16F10. -MSH je povzročil aktivnost tirozinaze za 171,2 odstotka v celicah B16F10. Ne glede na zdravljenje z -MSH je ekstrakt GEB znatno zaviral aktivnost tirozinaze. Arbutin je dobro znan kot zaviralec sinteze melanina po poti tirozinaze [7], ki je bil znatno inhibiran za 35-40 odstotkov v primerjavi z netretirano kontrolo tako v skupinah, ki niso prejemale -MSH, kot v skupinah, ki so prejemale -MSH (slika 3). . Vsebnost melanina in tirozinazne aktivnosti ekstrakta GEB pri 2 in 5 mg/ml so bile podobne kot pri 400 ug/ml arbutina, kar nakazuje, da GEB kaže od odmerka odvisno aktivnost proti melanogenezi do ravni pozitivne kontrole in da ta inhibicija melanogeneze z izvlečkom GEB je povezana z zmanjšano aktivnostjo celične tirozinaze (slika 3).
Učinki Gastrodia elata Blume (GEB) na nivoje mRNA in izražanje beljakovin MITF, tirozinaze, Trp1 in Trp2 v celicah B16F10
Da bi ugotovili, ali je bila inhibicija sinteze melanina z izvlečkom GEB povezana z izražanjem genov, povezanih z melanogenezo, smo izvedli PCR v realnem času, da bi preučili nivoje mRNA MITF, tirozinaze, Trp1 in Trp2. Ravni mRNA vseh teh genov so se z izvlečkom GEB običajno znižale na način, ki je odvisen od odmerka, tako v skupinah, ki niso prejemale -MSH, kot v skupinah, ki so prejemale -MSH, vendar so bile zanemarljive v celicah, ki niso bile zdravljene z -MSH. Molekularne ravni MITF, tirozinaze, Trp1 in Trp2 so bile inhibirane pri nizkih koncentracijah GEB (0.5-1 mg/mL) in so bile izrazito, vendar ne bistveno inhibirane pri višjih koncentracijah (2-5 mg /mL) v celicah, neobdelanih z -MSH. -MSH je izrazito induciral ravni mRNA teh genov, vendar jih je ekstrakt GEB zmanjšal. Celo v celicah, zdravljenih z -MSH, so nižji odmerki izvlečka GEB zmanjšali ravni mRNA MITF, tirozinaze, Trp1 in Trp2, medtem ko so višji odmerki izvlečka GEB znatno zavirali ravni mRNA vseh teh genov. Stopnje inhibicije izvlečka GEB pri višjih odmerkih so bile podobne arbutinu, ki je dobro znana sestavina za beljenje kože v kozmetiki (slika 4).
Poleg tega smo ovrednotili izražanje beljakovin tega transkripcijskega faktorja in melanogenih encimov z Western blot analizo. Zdravljenje z -MSH je znatno povzročilo ekspresijo beljakovin kot tudi ravni mRNA vseh teh genov, ki so bili pridobljeni na način, odvisen od odmerka. Medtem ko so nižji odmerki ekstrakta GEB ponavadi zmanjšali z -MSH inducirano ekspresijo proteina MITF, tirozinaze, Trp1 in Trp2, so višji odmerki znatno zavirali vse te markerje v celicah B16F10, obdelanih z -MSH, na način, ki je odvisen od odmerka. Ravni inhibicije izvlečka GEB pri višjih odmerkih so bile enako učinkovite kot arbutin (slika 5).
DISKUSIJA
V tej študiji smo ugotovili, da izvleček GEB zavira melanogenezo ter aktivnost in molekularno izražanje njegovih ustreznih encimov, kot so MITF, tirozinaza, Trp1 in Trp2, v mišjih celicah melanoma B16F10. Ekstrakt GEB v odmerkih 0.{5-5 mg/ml je zaviral markerje, povezane z melanogenezo, na način, ki je odvisen od odmerka. Medtem ko so manjši odmerki (0.5-1 mg/mL) izvlečka GEB zmanjšali melanogenezo, aktivnost tirozinaze, ravni mRNA in ekspresijo beljakovin MITF, tirozinaze, Trp1 in Trp2, medtem ko so višji odmerki ({{12} } mg/mL) izvlečka GEB je pomembno inhibiralo vse te markerske celice na način, ki je bil odvisen od odmerka, tako v B16F10, ki ni bil obdelan z -MSH, kot v zdravljenem z -MSH. Ti zaviralni učinki ekstrakta GEB pri višjih koncentracijah so bili podobni tistim pri 400 ug/ml arbutina.
Melanin se tvori iz L-tirozina v melanosomih in določa značilno barvo kože, las in oči [1]. Čeprav ima melanin zaščitno vlogo pred ultravijolično (UV) svetlobo in stresom, prekomerna proizvodnja in kopičenje pigmenta melanina povzroči hiperpigmentacijo in številne težave s kožo, kot so pege, starostne pege in melazma pri sesalcih [25]. Zato je zaviranje melanogeneze skrb vzbujajoče pri medicinskih in kozmetičnih zdravljenjih depigmentacije in posvetlitve kože. Vezava -MSH na receptor melanokortina-1 (MC1R) poveča ciklični adenozin monofosfat (cAMP) in posledično aktivira MITF. MIFT učinkovito nadzira izražanje melanogenih encimov, vključno s tirozinazo, Trp1 in Trp2, ki imajo strukturno 40-45 odstotkov podobne identitete [1,2]. Predvsem pa je zaviranje tirozinaze najpogostejši pristop k doseganju hipopigmentacije kože, ker ta encim katalizira stopnjo pigmentacije, ki omejuje hitrost. Tako Trp1 kot Trp2 sta vključena v posledično biosintezo melanina [1,2].
Lee et al. [26] so pregledali 100 rastlinskih izvlečkov za kozmetično uporabo z merjenjem inhibitornih aktivnosti tirozinaze in avtooksidacije DOPA ter poročali, da veliko rastlinskih izvlečkov, kot so Gastrodia elata, Chaenomeles speciosa, Dryopteris crassirrhizoma, Glycyrrhizaglabra, Morusalba, Myristicafragrans, Rheum palmatum in Sophora japonica je pokazala inhibicijo aktivnosti tirozinaze gobe. Chen et al. [2] so prav tako pregledali 78 zdravilnih zelišč in ugotovili, da ima korenika GEB potencial za zaviranje aktivnosti tirozinaze. Čeprav je bil GEB uporabljen kot orientalsko zdravilo za zdravljenje nevrodegenerativnih motenj, obstaja velika možnost uporabe GEB kot zaviralca tirozinaze iz teh presejalnih študij.
Nedavna študija [9] je poročala o 64 komponentah GEB z uporabo različnih kromatografskih tehnik. Med njimi so najpomembnejše fenolne spojine gastrodin [4-(-d-glukopiranoziloksi) benzil alkohol], 4-hidroksibenzil alkohol (4-HBA), 4-hidroksi- benzaldehid, vanilin (4-hidroksi-3-metoksibenzaldehid), vanilil alkohol (4-(hidroksimetil)-2-metoksifenil) in vanilijeva kislina (4-hidroksi{{14 }}metoksibenzojska kislina) [8-12]. V GEB so nedavno našli nove naravne spojine; bis (4- hidroksifenil) sulfid [2], Ergo [8] in diosgenin [17]. Struktura hidrokinona in glavnih fenolnih spojin GEB je precej podobna [27]. Hidroksilna skupina (-OH) hidrokinona je substituirana s hidroksimetilno skupino (-CH2OH) v 4-HBA [27] in karbonilno skupino (-CHO) v 4-hidroksibenzaldehidu. Metoksi skupina (-OCH3) je dodana hidrokinonu, da nastane vanilil alkohol, oziroma 4-hidroksibenzaldehidu, da nastane vanilin. Vanilinska kislina je oksidirana oblika vanilina.
Nedavne študije so pokazale, da ima večina teh spojin zaviralno delovanje proti gobji tirozinazi in melanogenezi v celicah melanoma B16 [14,28] in HM3KO [13], normalnih človeških fibroblastih kožice [29] in modelih cebric in vivo [2,29]. Na primer, izolirana fenolna frakcija iz GEB, ekstrahiranega z butanolom [14], je imela zaviralne učinke na melanogenezo z zmanjšanjem aktivnosti tirozinaze, Trp1 in Trp2 ter izražanja mRNA in beljakovin teh encimov. Gastrodin [15] in 4-HBA [16] sta zavirala melanogenezo z zaviranjem aktivnosti tirozinaze v celicah melanoma B16. Hidroksilne skupine gastrodina in 4-HBA so medsebojno delovale predvsem s histidinskimi ostanki v aktivnem mestu tirozinaze, kar je povzročilo inhibicijo aktivnosti tirozinaze [30]. Kisik iz fenolnega OH 4-HBA vpliva na katalitično aktivnost tirozinaze z nukleofilnim napadom [31]. Hidroksi in metoksi skupine vanilinske kisline in vanililalkohola delujejo kot zaviralci difenenolazne aktivnosti tirozinaze [32] in zlasti pretvorbe CH2OH v vanilijal alkoholu v -COOH (vanilinska kislina), kar vodi do izrazitega povečanja inhibicije tirozinaze [32]. ]. Vanilinska kislina, izolirana iz Origanum vulgare, je zmanjšala aktivnost celične tirozinaze, DOPA oksidaze in vsebnosti melanina ter znižala izražanje MC1R, MITF, Trp1 in Trp2 v celicah B16F10, stimuliranih z -MSH. Vanilin ni pokazal inhibicije aktivnosti tirozinaze [29]. Pred kratkim je naravni produkt, izoliran iz GEB, bis(4-hidroksi benzil)sulfid, deloval kot močan konkurenčni zaviralec tirozinaze za blokiranje sinteze melanina v človeških epidermalnih melanocitih in modelih cebric, tako da je pokazal koordinacijo žveplovega atoma bis ({{ 33}}hidroksi benzil) sulfida z bakrovimi ioni v aktivnem mestu tirozinaze z računalniškim molekularnim modeliranjem [2]. Ti rezultati kažejo, da lahko različne fenolne spojine GEB delujejo kot inhibitorji tirozinaze z interakcijo z bakrovimi ioni in/ali ostanki histidina v aktivnem mestu tirozinaze.
Ergo in diosgenin sta bila izbrana kot ena izmed 10 najboljših botaničnih sestavin v kremah proti staranju leta 2010 [21]. Ergo je naravna v vodi topna tiolna aminokislina [18,19], nedavno najdena v GEB [8]. Pri fiziološkem pH obstaja Ergo predvsem v tionski (= S) namesto v tiolni (-SH) obliki [19]. Zaradi njegove počasne razgradnje, odpornosti na tvorbo disulfida in avtooksidacije je bolj stabilen kot glutation [18,19]. Prisotnost z žveplom substituiranega imidazolnega obroča v Ergu je zavirala aktivnost gobje tirozinaze na način, odvisen od odmerka [33]. Druga spojina, diosgenin iz ekstrakta divjega jama (Dioscorea villosa), ima depigmentacijski učinek in se zato lahko uporablja pri melazmi, melanodermatitisu in sončnem lentigu [34]. Študija, izvedena na celicah melanoma, je pokazala, da je učinek depigmentacije povezan z aktivacijo poti celične fosfatidilinozitol- 4,5-bifosfat 3-kinaze, kar kaže, da je diosgenin lahko učinkovit zaviralec hiperpigmentacije [34]. Poleg tega ima protivnetne lastnosti in lastnosti proti staranju, saj inducira aktivnost proti kolagenazi [35].
V regulacijo melanogeneze so vključene vsaj tri možne signalne poti; kinazne signalne poti, odvisne od cAMP, Wnt in zunajcelični signal [1]. Vse te signalne poti uravnavajo encime, povezane z melanogenezo, tj. tirozinazo, Trp1 in Trp2 preko ekspresije in/ali aktivnosti MITF [1]. Potencialno vpletenost teh signalnih poti v zatiranje melanogeneze z GEB je treba v prihodnosti še raziskati.
NASPROTJE INTERESOV
REFERENCE
Za več informacij: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
