Prirojeni imunski odziv na post in ponovno hranjenje v ledvicah ribice cebrice

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Zongzhen Liao, Dihang Lin, Jirong Jia, Ran Cai, Yang Yu in Wensheng Li *

Državni ključni laboratorij za biokontrolo, ključni laboratorij province Guangdong za vodne gospodarske živali, raziskovalni center za inženirsko tehnologijo province Guangdong za zdravo vzrejo pomembnih gospodarskih rib, Šola znanosti o življenju, Univerza Sun Yat-Sen, Guangzhou 510275, Kitajska;

liaozzh@mail2.sysu.edu.cn (ZL); lindihang2018@sibcb.ac.cn (DL); jiajr3@mail.sysu.edu.cn (JJ); Alan6382@163.com (RC); yuyang65@mail2.sysu.edu.cn (YY)

* Dopisovanje: lsslws@mail.sysu.edu.cn

Cistanche je zelo dober za delovanje ledvic

Povzetek: Živali pridobivajo hranila in energijo s krmljenjem, da dosežejo ravnovesje med rastjo in zdravjem organizma. Ko pride do spremembe v pridobivanju hranil, se stanje rasti spremeni in lahko povzroči tudi spremembe v intrinzičnem imunskem sistemu. Kompenzatorna rast (KG), specifičen pojav rasti, vključuje vprašanje, ali lahko spremembe v rasti spremljajo spremembe prirojene imunosti. Kot ustrezen model lahko služi cebrica (Danio rerio), dobro znani modelni organizem rib. V tej študiji je bila cebrica 3 tedne postena in hranjena 3 do 7 dni. Ugotovljeno je bilo, da je CG mogoče doseči pri cebricah. Po stradanju se je dovzetnost cebric za Streptococcus agalactiae povečala. Poleg tega se je število centrov melanomakrofagov povečalo po postu in delež poškodovanih tubulov se je povečal po ponovnem hranjenju 3 oziroma 5 dni. Poleg tega jeledvicecebric, ki so trpele zaradi lakote, so bile pod oksidativnim stresom in aktivnost več antioksidativnih encimov se je po stradanju povečala, vključno s katalazo, glutation peroksidazo in superoksid dismutazo. Stradanje je vplivalo na prirojene imunske parametre. Poleg tega se je po stradanju povečala aktivnost alkalne fosfataze in lizocima. Ekspresija mRNA imunsko povezanih genov, kot je il-1, je bila po postu z ali brez izziva lipopolisaharidov (LPS) povišana v različni meri. Ta študija je pokazala, da lahko na delovanje prirojenega imunskega sistema pri cebricah vpliva stanje prehranjevanja.

Ključne besede: prirojeni imunski sistem; ledvice; oksidativni stres; kompenzacijska rast; cebrica

1. Uvod

Osnovne življenjske aktivnosti so odvisne od energetske oskrbe organizma. Stanje hranil v živalskem telesu lahko vpliva na delovanje imunskega sistema [1,2]. Kompenzatorna rast (KG) je obdobje hitre rasti po fazi zatiranja rasti, ki je lahko posledica pomanjkanja hrane in drugih okoljskih dejavnikov [3,4]. Ta pojav je bil najprej zabeležen pri sesalcih in so ga sčasoma odkrili pri pticah [3] in teleostih [5]. CG je razdeljen na dve fazi: katabolno fazo in hiperanabolično fazo [6]. Eden od osnovnih vzorcev CG je post in ponovno hranjenje. Po ponovnem hranjenju lahko ribe doživijo delno, popolno, prekomerno ali nič nadomestila [4]. Poseben režim hranjenja CG velja za potencialni način za izboljšanje proizvodne učinkovitosti pri gojenih vrstah [7].

Prirojeni imunski odziv je prva meja obrambe gostitelja, ki ščiti organizme pred patogeni. Organi imunskega sistema pri ribah vključujejo timus,glavoledvica, repna ledvica, škrge, jetra,in črevesje [8,9]. Širok nabor vrst celic sodeluje pri nespecifičnih celičnih obrambnih odzivih pri ribah, vključno z monociti/makrofagi, nespecifičnimi citotoksičnimi celicami in granulociti (nevtrofilci). Imunometabolizem je medsebojno delovanje med imunološkimi in presnovnimi procesi [10]. Presnovni status rib lahko vpliva na njihovo imunsko funkcijo. Pri ljudeh stanje prehranjenosti vpliva na število imunskih celic in njihovo aktivnost [11]. Ugotovljeno je bilo, da lahko na delovanje imunskega sistema pri miših vpliva njihovo presnovno stanje [12–14]. Intermitentno postenje pri krasu (Carassius auratus) je spremenilo združbe črevesnih bakterij in povečalo aktivnost superoksid dismutaze (SOD) in lizocima [15]. Stradanje spremeni tudi gensko izražanje prirojenih imunskih odzivov v jetrih lososa [16]. Poleg tega je študije o učinkih presnovnega stanja na imunski sistem mogoče najti pri drugih teleostih [17–19]. Vendar pa je vpliv presnovnega stanja na imunski sistem pri teleostih še vedno slabo razumljen. Oksidativni stres lahko omeji delovanje prirojenega imunskega sistema in inducira komponente, kot so toll-like receptorji [20,21]. Medtem pa lahko stradanje poveča proizvodnjo ROS in povzroči avtofagijo [22, 23]. Vredno bi bilo raziskati, ali oksidativni stres posreduje v razmerju med stradanjem in imunostjo.

Območje cebrice (Danio rerio) široko uporabljen model pri preučevanju imunosti in bolezni. Prirojeni imunski sistem cebric se začne razvijati prvi dan embriogeneze, adaptivni imunski sistem pa je odsoten do 4–6 tednov po oploditvi. Zaradi tega je cebrica odličen model za študije prirojenega imunskega sistema [9]. Ledvice so primarni limfoidni organ pri cebricah [24]. Gen havcr1 kodira transmembranski tubularni protein, imenovanmolekula poškodbe ledvic-1 (KIM-1) [25]. KIM-1 je indikator poškodbe tkiva v ledvicah, čezmerna ekspresija KIM-1 pa povzroči poškodbo ledvic pri cebricah [26]. Ugotovljeno je bilo, da lahko postenje spremeni presnovno stanje pri cebricah [27]. Postenje je povzročilo zmanjšano porabo kisika ter vsebnost jetrnih lipidov in glikogena. Prav tako je povečal aktivnost 8-oksidacije in glukoneogeneze v jetrih. Medtem so reaktivne kisikove vrste (ROS) sodelovale pri CG pri cebricah [28]. ROS, proizvedene v jetrih, so bile potrebne za CG pri cebricah, ker so inducirale pot AMPK. V tej študiji smo sprejeli strategijo posta in ponovnega hranjenja, da bi raziskali vzorec CG pri cebricah. Streptococcus agalactiae je povzročil hudo sepso in meningitis pri cebricah in bi lahko okužil več kot 30 vrst rib [29]. Za injiciranje smo izbrali Streptococcus agalactiae in lipopolisaharide (LPS), da bi raziskali vpliv CG na prirojeni imunski sistem v kombinaciji s spremembami imunsko povezanih parametrov in izražanja genov.

2. Materiali in metode

2.1. Cebrice, režimi hranjenja in telesna teža

Odrasle ribe cebrice, uporabljene v poskusu, so bile kupljene na trgu Yuehe Fish-Bird-Flower (Guangzhou, Kitajska) in aklimatizirane dva tedna. Vsa vzreja rib je bila izvedena na poskusni postaji za gojenje rib na univerzi Sun Yat-sen v provinci Guangdong na Kitajskem. Vsi poskusi na živalih so bili izvedeni v skladu s smernicami in odobritvijo odbora za nego in uporabo živali univerze Sun Yat-Sen. Med poskusnim obdobjem se je pH gibal od 7,8 do 7,9, raztopljeni kisik od 6,95 do 7,23 mg/L, temperatura vode pa od 26,5 do 28 oC. Koncentracije amoniaka-N in nitratnega dušika so bile vzdrževane nižje od 0.2 oziroma 0.{{20}}05 mg/L. Slanost vode je bila 0,2 ppt. Cebrica je bila vzdrževana v 12:12-h ciklu svetlo-temno. Da bi raziskali spremembe telesne teže med postom in hranjenjem, so telesno težo beležili enkrat na teden. Začetna telesna teža cebric v poskusu je bila 0,35 ± 0,06 g, stare pa so bile približno 3 mesece. Cebrice so bile naključno razdeljene v 24-litrske posode, vsaka posoda pa je vsebovala 30 rib. Ponudili so jim komercialno prehrano dvakrat na dan z nasičenim hranjenjem. Režimi hranjenja za vsak poskus so prikazani v tabeli 1. Po zdravljenju so bile cebrice anestezirane s prevelikim odmerkom MS-222 (Sigma, Burlington, MA, ZDA) in žrtvovane. Nato so ledvico odstranili v Eppendorfovo epruveto in takoj dali v tekoči dušik. Vzorec smo prenesli iz tekočega dušika in shranili pri -80 oC.

2.2. Izziv Streptococcus agalactiae

Ribice cebrice, ki so bile na tešče in ponovno hranjenje, so bile okužene s Streptococcus agalactiae. Sev Streptococcus agalactiae je prijazno zagotovil profesor Anxing Li, Šola znanosti o življenju, Univerza Sun Yat-sen [30]. Cebrice v vsaki skupini so bile nadalje ločene v štiri majhne skupine, s 15 ribami v vsaki majhni skupini. Cebrice v treh od teh skupin so bile anestezirane z 80 mg/L MS-222 in intraperitonealno injicirane s 5 uL, ki je vsebovala 5 × 106 enot Streptococcus agalactiae, ki tvorijo kolonije. Preostali ribici cebrici smo vbrizgali 5 uL PBS. Vse cebrice so opazovali 4 dni brez hranjenja. Stopnja umrljivosti je bila zabeležena.

2.3. Injekcija LPS

Cebrice, ki so bile podvržene postenju in ponovnemu hranjenju (F24, S24 in F21R3), so bile izzvane z LPS (Sigma, Burlington, MA, ZDA). Prašek LPS smo raztopili v sterilni vodi do končne koncentracije 1 mg/mL. Pred uporabo smo 1 mg/mL LPS razredčili s PBS in končna koncentracija je bila 20 ug/mL. Cebrice v vsaki skupini so bile ločene v dve majhni skupini in v vsaki majhni skupini je bilo 12 rib. Ribam v obeh skupinah so vbrizgali LPS in PBS. Cebrice so bile anestezirane z MS-222 in intraperitonealno injicirane s 5 uL 20 ug/mL LPS ali PBS. Po 3 urah so bile zebrice anestezirane in žrtvovane. Po tem smo ledvico odstranili in hranili pri -80 oC.

2.4. Histopatologija

Cebrice so vzdrževali s ponovnim hranjenjem 14 dni po 21-dnevnem stradanju. Vzorci so bili vzeti 21., 24., 28. in 35. dan. Po žrtvovanju so bile ledvice cebrice odstranjene in potopljene v 4-odstotni formaldehid. Nato so bile ledvice podvržene parafinskemu rezanju. Odseke smo obarvali s hematoksilin-eozinom (HE) (Beyotime, Šanghaj, Kitajska) in opazovali s svetlobnim mikroskopom (Olympus, Tokio, Japonska). Za količinsko opredelitev spremembe poškodovanih tubulov in melano-makrofagnih centrov (MMC) je bilo iz vsakega diapozitiva zajetih 5 slik brez prekrivanja. Območja poškodovanih tubulov in celoten vzorec smo izmerili s programsko opremo Cellsens (Olympus, Tokio, Japonska). Iz vsake slike smo izračunali delež poškodovanih tubulov tako, da smo površino poškodovanih tubulov delili s površino celotnega vzorca. Količina MMC je bila prešteta na vsaki sliki, nato pa deljena s površino celotnega vzorca. Nato so bile izračunane spremembe gub MMC s skupino F21 kot standardom.

2.5. Povezana analiza biokemijskih parametrov

Vsebnost malondialdehida (MDA) in dušikovega oksida (NO) ter encimske aktivnosti SOD, alkalne fosfataze (ALP), katalaze (CAT), glutation peroksidaze (GSH-Px) in lizocima v ledvicah so bile izmerjene z ustreznimi komercialnimi kompleti. v skladu s protokoli proizvajalca. Na kratko,ledviceodstranjenih iz cebric smo dali v tekoči dušik in shranili pri -80 oC. Pred testiranjem je bila vsaka ledvica vzeta ven in pretvorjena v homogenat v predhodno ohlajenem PBS z motilcem tkiva.Homogenat ledviccentrifugirali pri 4 oC in 12,000× g 10 minut in supernatant vzeli kotledvicaizvleček za odkrivanje. Vsebnost MDA je bila zaznana s kompletom za analizo lipidne peroksidacije MDA (Beyotime, Šanghaj, Kitajska), detekcija pa je temeljila na barvni reakciji med MDA in tiobarbiturno kislino. Uporabljena valovna dolžina je bila 535 nm. Vsebnost NO je bila izmerjena z reagentnim sistemom Griess (Promega, Madison, WI, ZDA). Griessov reagentni sistem temelji na reakciji nitrita s sulfanilamidom in N-1-naftil etilendiamin dihidrokloridom v kislih pogojih. Vsebnost NO je bila izračunana s standardom natrijevega nitrita in normalizirana na vsebnost beljakovin. Absorbanco smo izmerili s filtrom pri 490 nm. Aktivnost lizocima je bila odkrita s kompletom Lysozyme Assay Kit (Thermo Fisher, Waltham, MA, ZDA) po protokolu proizvajalca. Ekstrakt ledvic je bil inkubiran s celično steno Micrococcus lysodeikticus, konjugirano s fluoresceinom. Fluorescenco smo izmerili po 45 minutah inkubacije pri 37 oC, pri vzbujevalnih in emisijskih valovnih dolžinah 485 in 535 nm. Vrednost lizocima je bila izračunana s standardno krivuljo in normalizirana na vsebnost beljakovin. Encimske aktivnosti SOD, ALP, CAT in GSH-Px so bile ločeno odkrite s kompleti za testiranje tipa SOD, kompleti za testiranje alkalne fosfataze, kompleti za testiranje katalaze in kompleti za testiranje glutation peroksidaze (Nanjing Jiancheng, Nanjing, Kitajska). Enota aktivnosti SOD je bila definirana kot količina SOD, ki ustreza 50-odstotni inhibiciji stopnje redukcije nitro modrega tetrazolija na mg beljakovin v 1 ml sistemu. Uporabljena valovna dolžina je bila 570 nm. Enota aktivnosti ALP je bila definirana kot volumen encima, ki je reagiral s substratom, da je proizvedel 1 mg fenola v 30 minutah pri 37 oC in normaliziran na vsebnost beljakovin. Uporabljena valovna dolžina je bila 490 nm. Aktivnost CAT je temeljila na porabi vodikovega peroksida. Uporabljena valovna dolžina je bila 405 nm. Aktivnost GSH-Px smo merili s hitrostjo katalizne reakcije med vodikovim peroksidom in GSH. Če odštejemo neencimsko reakcijo, je bila enota aktivnosti GSH-Px definirana kot zmanjšanje koncentracije GSH za 1 mol/L v vsakem sistemu. Uporabljena valovna dolžina je bila 405 nm. Koncentracijo beljakovin smo izmerili s kompletom BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Šanghaj, Kitajska). Uporabljena valovna dolžina je bila 570 nm.

2.6. Proizvodnja ROS

Vsebina ROS vledvicasmo določili s fluorescenčno sondo 2/,7/-diklorofluorescein diacetat (DCF-DA) (Sigma, Burlington, MA, ZDA), kot je opisano prej [28]. Na kratko, ledvico, odstranjeno iz ribe cebrice, smo dali v predhodno ohlajeno 100 uL PBS in naredili homogenat z motilcem tkiva. Po 10-minutnem centrifugiranju z 10,000 × g pri 4 oC dodamo 20 uLledvicaekstraktsmo dodali 96-v črne mikroplošče z vdolbinicami in v vsako vdolbinico dodali 25 uM DCF-DA. Mikroploščo smo inkubirali pri 37 oC 30 minut. Fluorescenca je bila izmerjena v bralniku plošč z več oznakami (PerkinElmer Victor X5, Waltham, MA, ZDA) z vzbujevalnimi in emisijskimi filtri, nastavljenimi na 485 in 535 nm. Vsebnost beljakovin v ekstraktu ledvic je bila izmerjena s kompletom za testiranje beljakovin BCA. Vsebnost ROS za vsak vzorec je bila izračunana z normalizacijo vrednosti fluorescence na vsebnost beljakovin. Koncentracijo beljakovin smo izmerili s kompletom BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Šanghaj, Kitajska). Uporabljena valovna dolžina je bila 570 nm.

2.7. Test respiratornega izbruha

Za merjenje aktivnosti dihalnih izbruhov so bile uporabljene cebrice, ki so bile tešče in ponovno hranjene (F24, S24 in F21R3). Protokol za preskus respiratornega izbruha je bil izveden v skladu s predhodno objavljeno metodo [31,32]. Na kratko,ledviceločili od anesteziranih cebric in jih dali v {{0}}mikroplošče z vdolbinicami s 100 uL Dulbeccovega modificiranega Eagleovega medija (DMEM)/F-12. Po 30-minutni inkubaciji plošče pri 28 oC smo dodali 100 uL DMEM/F-12, ki je vseboval DCF-DA, dimetilsulfoksid (DMSO) in forbol miristat acetat (PMA) (Thermo Fisher, Waltham, MA, ZDA). dodamo vsaki zaznani vdolbinici. Medtem smo v vsako kontrolno vdolbinico dodali 100 uL DMEM/F-12, ki vsebuje DMSO. Končne koncentracije različnih raztopin so bile naslednje: 500 ng/mL DCF-DA, 0,2 % DMSO in 200 ng/mL PMA. Fluorescenca je bila izmerjena v bralniku plošč z več oznakami z vzbujevalnimi in emisijskimi filtri, nastavljenimi na 485 in 535 nm. Fluorescenca vsake vdolbinice

smo izmerili takoj po dodajanju raztopin v vdolbino in nato vsakih 15 minut 150 minut. Časovna točka za primerjavo vrednosti fluorescence je bila 150 minut. Vrednosti fluorescence neinducirane kontrolne skupine so bile odštete od fluorescence.

vrednosti posameznih skupin, povzročenih s PMA. Izračunane so bile normalizirane vrednosti fluorescence. Te normalizirane vrednosti fluorescence so bile razvrščene v tri stolpce.

2.8. Ekstrakcija RNA in PCR v realnem času

Zamrznjeniledvicezmleli v TRIzolu (Omega, Norcross, GA, ZDA) in celotno RNA ločili v skladu s protokolom [33]. Po prebavi z DNazo1 (NEB, Ipswich, MA, ZDA) je bila cDNA proizvedena s kompletom za sintezo prve verige cDNA RevertAid (Thermo Fisher, Waltham, MA, ZDA) z Random Hexamer Primer. qRT-PCR je bil nastavljen v 10 uL reakcijskih mešanic, ki vsebujejo 5 uL 2 × SYBR Green qPCR Master Mix (Bike, Houston, TX, ZDA). Vsi vzorci so bili izvedeni v dvojniku in normalizirani na izražanje eEF1a1a. Zaporedja oligonukleotidnih začetnikov, uporabljenih v tej študiji, so opisana v dodatni tabeli S1. Relativna kvantifikacija mRNA tarče glede na referenčno je bila določena z uporabo metode 2-AACT [34].

2.9. Statistična analiza

Kvantitativni podatki so prikazani kot povprečna vrednost ± SD. Statistične analize so bile izvedene s SPSS različico 24 (SPSS Inc., Chicago, IL, ZDA). Statistične primerjave med dvema skupinama so bile izvedene s pomočjo Studentovega t-testa ali neparametričnega testa, odvisno od rezultata testa normalnosti. Analize za več skupin z normalno porazdelitvijo so bile izvedene z uporabo enosmerne ANOVA, ostale pa z uporabo neparametričnih testov. Vse statistične podatke in metode je mogoče preveriti v tabeli S2.

3. Rezultati

3.1. Spremembe telesne teže in antibakterijskih lastnosti rib cebric med postom in ponovnim hranjenjem

Popolna kompenzacijska rast je bila dosežena pri cebricah. Po 7 do 14-dnevnem postu so cebrice izgubile vsaj 15 odstotkov telesne teže. Po 14 dneh ponovnega hranjenja je telesna teža cebric v skupini na tešče dohitela težo kontrolne skupine (slika 1A–C). Po postu in ponovnem hranjenju, da bi raziskali odpornost cebric na patogene, so jim intraperitonealno injicirali Streptococcus agalactiae. Cebrice v skupini na tešče so imele višjo stopnjo umrljivosti v primerjavi s kontrolno skupino. S podaljšanjem ponovnega hranjenja se je stopnja umrljivosti še naprej zmanjševala (slika 1D).

Slika 1. Model kompenzacijske rasti pri cebricah. A do C: sprememba telesne teže cebric med postom in ponovnim hranjenjem. (A) Cebrice so bile 7 dni tešče in 28 dni ponovno hranjene. (B) Cebrice so bile 14 dni tešče in 21 dni ponovno hranjene. (C) Cebrice so bile 21 dni tešče in 14 dni ponovno hranjene. n=21–22. (D) Stopnja preživetja cebric, ki jim je bila intraperitonealno injicirana S. agalactiae; F: hranjenje; S: stradanje; R: dohranjevanje. n=3, *: p < {{10}}.05,="" **:="" p="">< 0,01;="" ***:="" p=""><>

3.2. Morfološke spremembe ledvic cebric med postom in ponovnim hranjenjem

Theledvicaje glavno imunsko tkivo pri cebricah. Stradanje je povzročilo morfološke spremembe vledvice. Po 21 dneh postenja so ledvice pokazale očitne morfološke spremembe. Ugotovili smo, da se je po ponovnem hranjenju 3 in 5 dni pojavilo več poškodovanih tubulov s hialinskimi kapljicami. Stanje se je izboljšalo po 7 dneh. Poleg tega so opazili, da se število melanomakrofagnih centrov (MMC) vledvicapovečala po stradanju (slika 2A–C). Skupaj s ponovnim hranjenjem je bil ta simptom rešen. Ekspresija mRNA havcr1 se je povečala po postu (slika 2D), kar kaže, da lahko stradanje povzročiledvicapoškodba.

Slika 2. Morfološke spremembe vledvicecebrice med postom in hranjenjem. (A) HE-barvanjeledvicapri cebricah med postom in hranjenjem. Črn trikotnik označuje poškodovane tubule. Rdeča puščica označuje MMC. Rdeča zvezda označuje hialinske kapljice. (B) Statistična analiza deleža poškodovanih tubulov vledvica. (C) Statistična analiza MMC v ledvicah. n=3–4. (D) Relativna ekspresija mRNA gena havcr1 vledvicacebrice med postom in hranjenjem. n {{0}}–10. F: hranjenje; S: stradanje; R: dohranjevanje. *: p <>

3.3. Oksidativni stres se je sprožil med postom in hranjenjem

Vsebnost MDA se je znatno povečala po 21 in 24 dneh postenja in zmanjšala po 3 dneh ponovnega hranjenja (slika 3A). Vendar pa se je vsebnost ROS zmanjšala s 24-dnevnim stradanjem in se obnovila s ponovnim hranjenjem za 7 dni (slika 3B). Vsebnost NO se je povečala po 21-dnevnem postu (slika 3C). Aktivnost antioksidativnih encimov, vključno s SOD, GSH-Px in CAT, se je povečala po postu. Aktivnosti GSH-Px in CAT so se hitro zmanjšale in obnovile 3. dan ponovnega hranjenja. Čeprav se je aktivnost SOD s ponovnim hranjenjem zmanjšala, je bila še vedno večja kot pri kontroli (slika 4).

Slika 3. Oksidativni stres v ledvicah cebric med postom in ponovnim hranjenjem. (A) Vsebnost MDA v ledvicah. (B) Sprememba ROS v ledvicah. (C) Vsebnost NO v ledvicah. F: hranjenje; S: stradanje; R: dohranjevanje. n=6–10. *: p < 0.05,="" **:="" p="">< 0,01;="" ***:="" p=""><>

Slika 4. Aktivnost encimov v antioksidativnih sistemih vledvicecebrice med postom in hranjenjem. (A) Aktivnost SOD v ledvicah. (B) Aktivnost GSH-Px v ledvicah. (C) Aktivnost CAT v ledvicah. F: hranjenje; S: stradanje; R: dohranjevanje. n=6–10. *: p < 0.05,="" **:="" p="">< 0,01;="" ***:="" p=""><>

3.4. Prirojeni imunski sistem ledvic cebrice je bil prizadet zaradi posta in hranjenja

Aktivnost ALP se je povečala v ledvicah po postu in zmanjšala po ponovnem hranjenju (slika 5A). Pri ponovnem hranjenju 7 dni ni bilo bistvene razlike med skupino, ki je prejemala ponovno hranjenje, in kontrolno skupino. Aktivnost lizocima v ledvicah je pokazala podoben trend kot ALP, ki se je povečal s postom (slika 5B). Po ponovnem hranjenju je hitro upadlo. Odziv na dihalni izbruh v ledvicah ni pokazal bistvenih sprememb v različnih skupinah, vendar je bil odziv višji v skupini na tešče in v skupini, ki je prejemala ponovno hranjenje (slika 5C). Izražanje mRNA proinflamatornega citokina il-1 je pokazalo izjemno povečanje v vseh skupinah na tešče, vendar je po ponovnem hranjenju takoj upadlo (slika 6A). Ekspresija mRNA tgfb1a in tgfb1b je pokazala enak trend kot il-1 (slika 6E,F). Vendar se je ekspresija mRNA nfkb1 opazno povečala le po 24-dnevnem stradanju in zmanjšala po 3-dnevnem ponovnem hranjenju. Izražanje mRNA nfkb2 je pokazalo trend, podoben tistemu pri nfkb1 (slika 6B, C). Gen arg2 kodira arginazo II, ki je povezana s proinflamatornim odzivom. Poleg tega se je izražanje mRNA arg2 izjemno povečalo v vseh skupinah na tešče in se zmanjšalo po ponovnem hranjenju (slika 6D). Po izzivu cebrice, ki je šla skozi post in ponovno hranjenje, je bil odziv močnejši v skupini na tešče. Ekspresija mRNA il-1 in mmp9 v skupini na tešče, zdravljeni z LPS, je bila znatno višja od tiste v kontrolnih skupinah, zdravljenih z LPS, ali skupinah, ki so ponovno hranjene (slika 7).

Slika 5. Parametri prirojenega imunskega sistema priledvicecebrice med postom in hranjenjem. (A) Aktivnost ALP v ledvicah cebric med postom in ponovnim hranjenjem. (B) Aktivnost lizocima vledvicacebrice med postom in hranjenjem. (C) Respiratorni izbruhni odziv ledvic pri cebricah po postu in ponovnem zaužitju. (C1) Vrednost fluorescence/beljakovine ledvic v različnih časih. (C2) Vrednosti fluorescence/proteinaledvicaob 150 min. (C3) Normalizacija vrednosti fluorescence/proteina ledvic pri 150 min. F: hranjenje; S: stradanje; R: dohranjevanje. n=12. *: p < 0,05,="" **:="" p="">< 0,01;="" ***:="" p=""><>

Slika 6. Relativna ekspresija mRNA imunsko povezanih genov v ledvicah cebric med postom in ponovnim hranjenjem. (A–F):il-1, nfkb1, nfkb2, arg2, tgfb1a in tgfb1b. F: hranjenje; S: stradanje; R: dohranjevanje. n=8–1{{10}}. *: p < 0,05,="" **:="" p="">< 0,01;="" ***:="" p=""><>

Slika 7. Relativna ekspresija mRNA imunsko povezanih genov vledvicecebric, ki so bile izzvane s 5 uL 20 ug/mL LPS po postu in ponovnem hranjenju. (A–C) il-1 , mmp9 in nfkb1. F: hranjenje; S: stradanje; R: dohranjevanje. n=8–12. *: p < 0.05,="" **:="" p="">< 0,01;="" ***:="" p=""><>

4. Razprava

V tej študiji smo ugotovili, da se lahko popolna CG realizira pri cebricah po različnih trajanjih stradanja. Tudi po 3 tednih postenja je telesna teža cebric po dveh tednih dosegla težo kontrolne skupine. Ta rezultat je bil skladen s prejšnjim delom [28]. Študije so pokazale, da stradanje in ponovno hranjenje vplivata na presnovno stanje rib cebric [27, 28]. Pri gojenih vrstah je pomen CG v tem, da izboljša učinkovitost proizvodnje. Za gojene vrste je pomembno, da ohranijo antibakterijske lastnosti med postom in hranjenjem. Med tem procesom lahko cebrica trpi zaradi patogenov. Poročali so, da stradanje ni vplivalo na imunski odziv pri okuženem Piaractus mesopotamicus [18]. Na žalost je post povečal dovzetnost cebric za S. agalactiae. Hkrati je stradanje vplivalo na biokemične parametre in izražanje mRNA prirojenega imunskega sistema.

Pri cebricah so odsotne bezgavke, ledvica pa je primarni limfoidni organ, enakovreden kostnemu mozgu sesalcev [24]. Pri odraslih cebricah so ledvice glavno mesto hematopoeze [35]. Populacije v ledvičnem mozgu vsebujejo veliko tipov hematopoetskih celic, vključno z makrofagi, nevtrofilci in limfociti [36,37]. Pravilno delovanje ledvic je pomembno za prirojeni imunski sistem pri cebricah. V tej študiji smo opazili nekatere morfološke spremembe v ledvicah rib cebric, ki so bile izpostavljene stradanju. Odlaganje MMC v ledvicah se je po stradanju bistveno povečalo. Prej je bilo ugotovljeno, da lahko stradanje povzroči odlaganje melano-makrofagov (MM) v ledvicah in vranici pri ribah [38]. MMC se večinoma pojavljajo v ledvicah, jetrih in vranici ter so v ledvicah razpršene in manj strukturirane [39]. Za MMC velja, da delujejo tako v imunski obrambi kot v normalnih, neimunoloških, fizioloških procesih. Primarna funkcija MMC je fagocitoza. Menijo, da lahko MMC sodelujejo pri prirojenih in adaptivnih imunskih odzivih. Dodatek MMC po stradanju je lahko posledica hemofagocitoze in čiščenja celičnih ostankov. Poleg tega so v prvih dneh ponovnega hranjenja opazili strukturo hialinskih kapljic. Prisotnost hialinskih kapljic naj bi bila indikativna predvsem za alfa2u-globulin v tubularnih epitelijskih celicah [40]. Poleg tega so v modelu histiocitnega sarkoma neoplastični histiociti proizvajali lizocim, lizocim pa se je kopičil v tubularnih epitelijskih celicah [41]. Če povzamemo, do tvorbe hialinskih kapljic pride, ker ledvice ne morejo prebaviti beljakovin, ki se kopičijo v celicah tubularnega epitelija. Raven KIM-1 (kodirana s havcr1) lahko kaže na strukturno poškodbo tubulov [42]. Po stradanju se je ekspresija mRNA havcr1 opazno povečala in zmanjšala s ponovnim hranjenjem. Lahko predvidevamo, da je delovanje ledvic s postom oslabljeno, s ponovnim hranjenjem pa se delovanje ledvic povrne. Zahteve pa so obremenjujoče na začetku dohranjevanja.

Fagocitoza je pomemben obrambni proces v prirojenem imunskem sistemu rib. Oksidativni stres bo omejil imunski odziv [20]. Antioksidativna obramba je odvisna predvsem od encimov. SOD, GPx in katalaza so pomembne sestavine antioksidativnih sistemov [43]. SOD posreduje pretvorbo superoksidnega aniona in H2O2. Katalaza sodeluje pri razstrupljanju H2O2 v vodo. GPx katalizira hidroperokside (npr. H2O2 in lipidne hidroperokside) v H2O z oksidacijo glutationa (GSH) v glutation disulfid (GSSH) [43–45]. MDA je eden glavnih produktov oksidacije lipidov in se proizvaja iz polinenasičenih maščobnih kislin (PUFA) s kemičnimi reakcijami in reakcijami, ki jih katalizirajo encimi. ROS lahko peroksidira PUFA, da ustvari MDA. Vsebnost MDA je biomarker, ki se pogosto uporablja za oceno oksidativnega stresa [46]. V pričujočem delu se je kljub zmanjšanju vsebnosti ROS vsebnost MDA v ledvicah izjemno povečala, povišana pa je bila tudi aktivnost vseh encimov, ki pripadajo antioksidativnemu sistemu. Odkrivanje ROS je prehoden odziv. Sprememba aktivnosti antioksidativnega encima je bila posledica dolgotrajnega postenja. Nasprotni trendi med ROS in antioksidativnimi encimi so morda posledica dejstva, da običajni procesi celične aktivnosti proizvajajo ROS, medtem ko dolgotrajno stradanje vodi do zmanjšane celične aktivnosti. Ta rezultat je pokazal, da je stradanje kronično povzročilo oksidativni stres v ledvicah. Vztrajajoči oksidativni stres lahko povzroči poškodbe snovi v celicah, kot so lipidi in proteini, in končno povzroči apoptozo in kopičenje oksidiranih molekularnih agregatov [20]. Pri teleostih so poročali, da je stradanje povzročilo vsebnost MDA v jetrih in črevesju ter povečalo aktivnost antioksidativnih encimov [47–49]. Ti rezultati kažejo, da čeprav je bil antioksidativni sistem aktiviran, to ni bilo dovolj za odpravo škode, ki jo je povzročilo stradanje. Medtem lahko oksidativni stres aktivira širok nabor transkripcijskih faktorjev, kot so NF-kB, Nrf2 in HIF-1a. Nato ti transkripcijski faktorji inducirajo izražanje številnih citokinov in kemokinov. Tako lahko oksidativni stres povzroči kronično vnetje [44].

Pri napadu s Streptococcus agalactiae so cebrice v skupini na tešče utrpele večjo smrtnost kot tiste v kontrolni skupini. Medtem se je aktivnost ALP in lizocima s stradanjem izboljšala. Lizocim je pomembna sestavina prirojenega imunskega sistema rib in sodeluje pri procesu fagocitoze [50]. Glede na rezultate je stradanje povzročilo izražanje mRNA il-1, nfkb1, tgfb1a, tgfb1b in arg2. Te spremembe so lahko posledica oksidativnega stresa. TGFB1 je citokin, ki ima pro- in protivnetne učinke [51]. Rekombinantni TGFB1 je pokazal imunosupresivno aktivnost in zmanjšal izražanje pro-vnetnih citokinov v levkocitih teleostov. Pri cebricah je izražanje tgfb1a povzročilo vnetje v jetrih [52]. Kronična indukcija tgfb1a je aktivirala vnetje, njegova ekspresija pa je povzročila jetrno fibrozo pri zgodnjem hepatocelularnem karcinomu pri cebricah. Arginaza je primordialni encim in je odgovoren za pretvorbo L-arginina v L-ornitin in sečnino. Arginaza ima dva izoencima (arginazo I in arginazo II) [53,54]. Arginaza II je imunsko povezan gen in je bilo ugotovljeno, da je povezana s proinflamatornimi odzivi v makrofagih preko mitohondrijskih ROS. Ti podatki so pokazali, da lahko stradanje povzroči imunski odziv v ledvicah. Pri miših je stradanje zmanjšalo občutljivost na LPS in ni vplivalo na izražanje il-1 [55]. Vendar so ribe cebrice, stimulirane z LPS, pokazale grob odziv na LPS, izražanje il-1 in mmp9 pa je bilo znatno višje kot v drugih skupinah. V nasprotju z mišmi so zebrice po stradanju postale bolj občutljive na LPS, zato lahko stradanje zmanjša njihovo sposobnost čiščenja patogenov.

5. Sklepi

V tej študiji smo predhodno raziskali vpliv posta in hranjenja na prirojeni imunski sistem rib cebric. Pri cebricah je bila realizirana kompenzatorna rast, ki jo je spremljala povečana dovzetnost za patogene po stradanju. Oksidativni stres – ki ga povzroča stradanje in z nevarnostjo povezani molekularni vzorci, ki jih proizvajajo poškodovani ledvični tubuli – je morda prispeval k vnetju. Potrebna je nadaljnja študija, da bi raziskali, kako stradanje poveča dovzetnost in kako presnovno stanje vpliva na različne vrste imunskih celic.

Dodatni materiali: Naslednji so na voljo na spletu na naslovu https://www.mdpi.com/article/10.3390/biom11060825/s1, tabela S1: seznam primerjev, uporabljenih v tej študiji; Tabela S2: Statistični rezultat poskusa.

Avtorski prispevki: Konceptualizacija, ZL in WL; Urejanje podatkov, JJ; Formalna analiza, ZL in DL; Pridobivanje sredstev, WL; Preiskava, ZL, DL, RC in YY; Metodologija, ZL; Nadzor, WL; Pisava—izvirni osnutek, ZL; Pisanje – pregled in urejanje, WL Vsi avtorji so prebrali in se strinjali z objavljeno različico rokopisa.

Financiranje: To delo so financirali Kitajski nacionalni ključni raziskovalni in razvojni program (2018YFD0900101), Kitajski kmetijski raziskovalni sistem MOF in MARA (CARS-46) in Program za kitajske izjemne talente v kmetijskih znanstvenih raziskavah ({{3 }}) za Wensheng Li.

Izjava institucionalnega nadzornega odbora: Študija je bila izvedena v skladu s smernicami Helsinške deklaracije in jo je odobril odbor za nego in uporabo živali univerze Sun Yat-Sen.

Izjava o informiranem soglasju: Ni primerno.

Izjava o razpoložljivosti podatkov: Ni uporabno.

Navzkrižje interesov: Avtorji izjavljajo, da nimajo navzkrižja interesov.