Integrativna analiza Omics razkriva poti, povezane z mikrovaskularnim vnetjem, v biopsijah ledvičnega alogenskega presadka

edmund.chen@wecistanche.com

Pri presaditvi trdnih organov so se mikroRNA (miRNA) izkazale kot ključni akterji pri uravnavanju delovanja celic alogenskega presadka kot odziv na poškodbo. Da bi pridobili vpogled v vlogo miRNA pri zavrnitvi, posredovani s protitelesi, fenotip zavrnitve, histološko definiran z mikrovaskularnim vnetjem,ledvica biopsije alogenskega presadka so bile podvržene profiliranju miRNA, pa tudi messenger RNA (mRNA). Z uporabo edinstvenega večstopenjskega selekcijskega postopka, specifičnega za študijo BIOMARGIN (odkritna kohorta, N=86; selekcijska kohorta, N=99; validacijska kohorta, N=298), je bilo dosledno identificiranih šest različno izraženih miRNA: miR-139-5p (dol) in miR-142-3p/150-5p/155-5p/{ {7}}p/223-3p (gor). Njihova stopnja izražanja je postopoma korelirala z intenzivnostjo mikrovaskularnega vnetja. Specifičnost celice ciljnih genov miRNA so raziskali z integracijo njihovih in vivo ciljev mRNA z enoceličnim sekvenciranjem RNA iz neodvisne kohorte biopsije alogenskega presadka. Ekspresija miR-139-5p, pridobljena iz endotelija, je negativno korelirala z ekspresijo genov, povezanih z MHC. Nasprotno pa je bila prekomerna ekspresija miR-222-3p, ki izvira iz epitelija, močno povezana z oslabljeno ledvično elektrolitno homeostazo in potlačenimi z imunostjo povezanimi potmi. V imunskih celicah je miR-150-5p reguliral aktivacijo NF-kB v limfocitih T, medtem ko je miR-155-5p reguliral spajanje mRNA v celicah, ki predstavljajo antigen. Skupaj nam je integrirana omika omogočila, da smo razkrili nove poti, vključene v mikrovaskularno vnetje, in nakazali, da se presnovne spremembe v tubularnih epitelijskih celicah pojavijo kot posledica zavrnitve, posredovane s protitelesi, onkraj bližnjega endotelnega predela.

Ključne besede:presaditev ledvice, mikroRNA, multi-omika, mikrovaskularno vnetje, s protitelesi posredovana zavrnitev

CISTANCHE BO IZBOLJŠAL LEVIČNE/LEDVIČNE BOLEZNI

UVODnoterpresaditev ledvice(KT), je aloimunska poškodba običajno razdeljena na dve vrsti zavrnitve alogenskega presadka glede na prostorsko porazdelitev imunske infiltracije in informacije o prisotnosti ali odsotnosti za darovalca specifičnih protiteles proti HLA. Diagnoza temelji na biopsiji alogenskega presadka z razvrščanjem histoloških lezij po klasifikaciji Banff International Consensus (1). Tubulitis ("t" lezija) in intersticijsko vnetje ("I" lezija) sta značilni histološki značilnosti T-celično posredovane zavrnitve (TCMR) in sta povezana z neposredno citotoksičnostjo za tubulointersticijski kompartment. S protitelesi posredovana zavrnitev (ABMR) je najpogosteje povezana s krožečimi protitelesi proti HLA z vnetjem, ki cilja na mikrovaskularni del. Aktivne histološke lezije ABMR vključujejo prisotnost mononuklearnih celic v glomerulnih kapilarah ("g" lezija) in v peritubularnih kapilarah ("ptc" lezija), ki jih skupaj imenujemo "mikrovaskularno vnetje" (MVI). Pri kronični aktivni ABMR kronična poškodba tkiva, kot je transplantirana glomerulopatija ali fibroza arterijske intime, prispeva k tem akutnim lezijam (1). Z uporabo trenutnih imunosupresivnih učinkovin, usmerjenih na celice T, velja, da ima TCMR omejen prognostični učinek, medtem ko je ABMR glavni vzrok za odpoved presadka, kar je povezano s pomanjkanjem učinkovitih terapevtskih pristopov (2).

Da bi našli boljše terapije za MVI in ABMR, je potreben boljši vpogled v biološke mehanizme, na katerih temeljijo ti procesi poškodb. Zdi se, da so visoko zmogljive tehnologije omics primerne za ta namen, saj omogočajo natančno in sočasno pregledovanje na tisoče genov, beljakovin in metabolitov (3). Celotno transkriptomsko zaslišanjeledvicabiopsija alogenskega presadka je pokazala globoke spremembe izražanja genov mRNA v poškodovanih rezidenčnih celicah ali v infiltriranih celičnih populacijah med ABMR (4). Medtem so se mikroRNA (miRNA) pojavile kot ključni akterji celičnega metabolizma z uravnavanjem messenger RNA (mRNA) na posttranskripcijski ravni. Pravzaprav so miRNA revolucionirale naše razumevanje natančnega prilagajanja telesnih fizioloških procesov, ki so vključeni v proliferacijo, apoptozo, diferenciacijo in razvoj (5). Ni presenetljivo, da neregulirana ekspresija miRNA povzroči razvoj številnih patologij, vključno zledvična bolezen(6). Ker se profili izražanja miRNA razlikujejo med bolnimi in zdravimi stanji, so številne študije analizirale miRNA same ali v kombinaciji z drugimi bolj tradicionalnimi označevalci, ne samo za diagnosticiranje bolezni in napovedovanje napredovanja bolezni, ampak tudi za načrtovanje potencialnih terapevtskih aplikacij (7).

V kontekstu presaditve trdnih organov so miRNA lahko vključene v zavrnitev zaradi svoje vloge pri uravnavanju delovanja imunskih celic in pri odzivu rezidenčnih celic alogenskega presadka na poškodbo (6,8). Več študij je raziskalo alogenske miRNA kot biomarkerje in/ali efektorje v nastavitvah TCMR (8, 9), vendar se nobena doslej ni osredotočila na MVI in ABMR. V tej študiji smo želeli integrirati različne ravni omike izledvicabiopsije alogenskega presadka, da bi dobili vpogled v vlogo miRNA v tem škodljivem fenotipu zavrnitve.

MATERIALI IN METODE Načrt študijeTa študija je del programa BIOMArkers, ki ga7-financira FPledvičnaRaziskovalni program Graft INjuries (BIOMARGIN, https://cordis.europa.eu/project/id/305499, ClinicalTrials.goy, številka NCT02832661), ki ga vodi evropski raziskovalni konzorcij v iskanju biomarkerjev imunskih lezij alogenskega presadka vpresaditev ledviceprejemnikov, z diagnostično in/ali prognostično vrednostjo. BIOMARGIN je multicentrična, prospektivna, večfazna študija, izvedena na štirihpresaditev ledvicecentri v Evropi (Bolnišnica Necker, Pariz, Francija; Univerzitetne bolnišnice, Leuven, Belgija; Hannover Medical School, Hannover, Nemčija; in Univerzitetna bolnišnica, Limoges, Francija). Vzorci so bili prospektivno zbrani v času presejanja in indikacijskih biopsij med aprilom 2013 in junijem 2015 (slika IA). Vse presaditve so bile izvedene z negativnimi navzkrižnimi ujemanji citotoksičnosti, odvisne od komplementa. V teh štirih kliničnih centrih so poleg indikacijskih biopsij v skladu s prakso lokalnega centra izvajali protokolarne biopsije 3, 12 in včasih 24 mesecev po presaditvi. Institucionalni revizijski odbor na vsaki lokaciji je odobril študijo in vsi bolniki so dali pisno informirano soglasje.

Študijske kohorteŠtudija je bila razdeljena na tri faze (slika 1A). V prvi fazi odkrivanja primera in kontrole je bilo za globalno analizo ekspresije miRNA uporabljenih N=88 vzorcev biopsije (N=754 miRNA, brez potencialnih normalizirajočih miRNA) . Vzorce smo izbrali na podlagi razpoložljivosti in histoloških meril (razen primerov z diagnozo glomerulonefritisa ali nefropatije, povezane s poliomavirusom, in primerov z nejasno diagnozo). Na podlagi lokalnih odčitkov biopsije je bil narejen prvi izbor, ki ga je skupina patologov, neodvisna od prvotnega centra, dodatno izpopolnila z osrednjim odčitavanjem. Statistična analiza (glejte izbor miRNA) je bila uporabljena za izbiro razširjenega seznama miRNA, najbolj različno izraženih med histološkimi fenotipi, ki so bili nato kvantificirani v 2. fazi.

Podobna zasnova študije primera in kontrole je bila uporabljena za drugo (izbirno) fazo, kjer je bila izvedena ciljna analiza izražanja miRNA (N=143) na N=99 vzorcih biopsije. Isti statistični cevovod je bil uporabljen za izbiro še bolj omejenega seznama miRNA, ki jih je treba naknadno kvantificirati v 3. fazi. Končno, v tretji (validacijski) kohorti so bili vsi vzorci, prospektivno in zaporedno zbrani v skladu s protokolom BIOMARGIN med 24. junijem 2014 in 2. julijem 2015 ter z ustreznimiledvicakakovost biopsije alogenskega presadka so ocenili za 38 miRNA, izbranih kot rezultat druge selekcijske faze. V tej kohorti v resničnem življenju ni bila narejena nobena izbira na podlagi histologije, demografije, časa ali katerega koli drugega dejavnika razen razpoložljivosti vzorcev in meril za nadzor kakovosti (ustreznost biopsije in izkoristek RNA).

Izbira miRNARobusten statistični cevovod je bil posebej razvit za študijo BIOMARGIN v R(R Core Team(10), različica 1.0.44), kot razširitev paketa biosignal R (1l). Na kratko, v fazi odkrivanja smo izvedli strategijo izbire funkcij, vključno z univariatnimi in multivariatnimi pristopi. Za univariatno izbiro smo uporabili neparametrični test (Wilcoxon-Mann-Whitneyjev test) in parametrični test (Studentov t-test) ter kohorto Discovery (BIOS-03-0023, BIOS-06-0238). Rezultati napovedi vsakega transkripta miRNA v vsakem multivariatnem modelu so bili integrirani, da bi dobili "multivariatni rezultat". S kombiniranjem rezultatov teh univariatnih in multivariatnih analiz smo lahko razvrstili in izbrali podmnožico kandidatov za miRNA, ki bodo del razširjenega seznama, ki bo kvantificiran v naslednji fazi.Za to posthoc analizo, ki se osredotoča na poti VMI, je bila mediana normalizirane ekspresije vsake miRNA primerjana med primeri in kontrolami z uporabo Wilcoxonovega testa v vseh treh kohortah. Kontrolirali smo večkratno testiranje z metodo stopnje napačnih odkritij Benjamini & Hochberg (FDR).

Klinično-patološka ocenaPosamezne ocene histoloških lezij so bile polkvantitativno ocenjene v skladu z merili Banff 2019 (16). Izraz "mikrovaskularno vnetje" (MVI) je bil uporabljen za označevanje katere koli stopnje kombinacije glomerulitisa (g) in/ali peritubularnega kapilaritisa (ptc). Vsi primeri ABMR so izpolnjevali prvi dve merili klasifikacije Banf 2015 ali Banff 2017 (histološki dokazi o akutni poškodbi tkiva in dokazi o trenutni/nedavni interakciji protiteles z žilnim endotelijem), vendar niso vsi izpolnjevali tretjega kriterija [serološki dokazi protiteles, specifičnih za darovalca (DSA) in/ali obarvanje s CAd]. DSA po presaditvi so bili določeni glede na prakso lokalnega centra, pri čemer je bila pozitivnost DSA definirana kot zaznavna za darovalca specifična serumska protitelesa proti HLA s srednjo vrednostjo intenzivnosti fluorescence (MFI) 500 v času biopsije ali kadar koli prej.

Ekstrakcija RNA iz vzorcev biopsije za profiliranje mRNA in miRNAPri vsakem so bila vzeta jedra z dvema iglamaledvicabiopsija alografta. Ena je bila uporabljena za konvencionalno histološko razvrščanje, vsaj polovica druge pa je bila takoj shranjena v Allprotect Tissue Reagent (Qiagen Benelux BV, Venlo, Nizozemska). Epruvete Allprotect so bile shranjene pri 4C (najmanj 24 ur do največ 72 ur). , in nato shranjen pri -20 stopinjah do ekstrakcije RNA. Totalna RNA je bila izolirana izledvicavzorci biopsije alogenskega presadka z univerzalnim kompletom Allprep DNA/RNA/miRNA (Qiagen Benelux BV) na instrumentu QIAcube (Qiagen Benelux BV). Količino (absorbanco pri 26{{20}} nm) in čistost (razmerje absorbance pri 230, 260 in 280 nm) izolirane RNA smo izmerili s spektrofotometrom NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific/Life Technologies Europe BV, Gent, Belgija). Število integritete RNA (RIN) je bilo ovrednoteno s kompletom Eukaryote nano/pico RNA (Agilent Technologies Belgium NV, Diegem, Belgija) na instrumentu Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies BelgiumNV). Indeksi nadzora kakovosti se niso bistveno razlikovali med VMI in št. MVI skupine [RIN(povprečje±SD):5,6±1,96 proti 5,4±1,97,P=0.66; razmerje 260/280 (povprečje±SD):1,87±0,06 proti 1,87±0,1l,P{{26 }}.40]. Za vzorce RNA z nizkim RIN (<6.5), we="" excluded="" samples="" with="" a="" 260/280=""><1.6. the="" extracted="" rna="" was="" subsequently="" split="" and="" stored="" at="" -80℃℃.half="" of="" the="" rna="" extract="" was="" used="" for="" mirna="" profiling="" and="" the="" other="" half="" for="" mrna="" transcriptomic="" analysis.="" the="" associated="" data="" are="" available="" from="" the="" gene="" expression="">

CISTANCHE BO IZBOLJŠAL DIALIZO LEDVIC/LEDVIC

Profiliranje miRNASpecific reverse transcription of 150ngof total RNA was performed using Megaplex"RT Primers Human Pool A v2.1(Step 1)or Custom RT Primers Human Pool (Step 2 and 3)(Thermo Fisher Scientific, Les Ulis, France), on a Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). No complementary(c)DNA preamplification was required. miRNA expression was assessed by qPCR, using TaqManArray Cards (Applied Biosystems", Thermo Fisher Scientific), where the primers and probe of each miRNA were spottedanddried in duplicate wells of a microfluidic card. We used TaqMan"Array Human MicroRNA A +B Card Sets v3.0 for the discovery cohort(a two-card set enabling quantitation of 754 unselected human miRNAs)and Custom TaqManArray MicroRNA Cards for the selection and validation cohorts. Data analysis was performed by using Expression Suite software version 1.0.3. Assays with a cycle threshold(CT) values >35 jih je bilo ocenjenih kot neizraženih. RNU44 in RNU48 sta pokazala dosledno izražanje v vseh vzorcih (RNU44 plus RNU48), koeficient variacije je bil 3,73 odstotka v Array Card A in 3,79 odstotka v Array Card B] in sta bila uporabljena kot gospodinjski geni za normalizacijo podatkov v vseh podštudijah.

Transkriptomska analiza mRNATranskriptomska analiza je bila izvedena z mikromrežami, kot je že opisano (17). Na kratko, skupna RNA, ekstrahirana iz vzorcev biopsije, je bila najprej pomnožena in biotinilirana v komplementarno RNA (cRNA) z uporabo kompleta reagentov GeneChip 39 IVT PLUS (Affymetrix) in hibridizirana v Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Nizi( Affymetrix), ki je obsegal 54.675 nizov sond, ki pokrivajo celoten genom. Uporabili smo robustno normalizacijo povprečja z več čipi (RMA). Srednjo normalizirano ekspresijo vsake mRNA smo primerjali med primeri in kontrolami z uporabo Wilcoxonovega testa. Inflacijo tveganja alfa zaradi večkratnega testiranja smo nadzorovali z uporabo metode stopnje lažnih odkritij Benjamini & Hochberg (FDR). Podatki mikromrež so bili obdelani v skladu s smernicami Minimum Information About Microarray Experiment.

Analize In SilicoProgramska oprema Biological Interpretation Of Multiomics EXperiments (BIOMEX) je bila uporabljena za diferencialno analizo transkriptomskih podatkov z uporabo opombe Ensembl ID (18). Ingenuity Pathway Analysis (IPA, Build: 478438M Različica vsebine: 44691306, Qiagen) in OMICSnet(19) sta bila uporabljena za določitev nizov genov, ki jih regulirajo izbrane miRNA. OMICSnet je bil uporabljen za izvedbo analize genske ontologije z zbirko podatkov poti Reactome z uporabo celotne poti (20). Gradnja genskih mrež je bila popolnoma nenadzorovana in se je zanašala na število prijavljenih molekularnih interakcij vsakega posameznega gena z vsemi drugimi geni v omrežju. Geni z največjim številom interakcij so bili samodejno postavljeni v središče mreže, medtem ko so bili geni z manjšim številom interakcij razširjeni na obrobje. Celični izvor izbranih miRNA je bil raziskan s pomočjo projekta Fantom5 (21), ki zagotavlja analizo genskega izražanja v človeških celicah in tkivih. Za analizo izražanja miRNA smo upoštevali vseledvica-povezane strukturne celice in vse krožeče hematopoetske celice, brez nadaljnje selekcije.

Analiza podatkov sekvenciranja enocelične RNAUporabljeni so bili predhodno objavljeni podatki sekvenciranja človeške enocelične RNA (siRNA-seq) iz dveh biopsij ABMR in štirih zdravih referenc, ki ustrezajo biopsijam za nadzor presaditve. Povezana neobdelana števila ali matrike so bile prenesene iz GEO(GSE145927, https://www.ncbi.nlm. nihgov/geo)(22) inLedvicaProjekt natančne medicine (KPMP, https://atlas.kpmp.org/repository). Surove genske ekspresijske matrice, ustvarjene na vzorec, so bile združene in analizirane s paketom Seurat V4 (23). Parametri, uporabljeni za ustvarjanje in filtriranje objektov Seurat, so bili naslednji: vključitev celic, ki izražajo med 500 in 10000 odkritimi geni in manj kot 25 odstotkov mitohondrijskih transkriptov. Po filtriranju so bili vsi objekti integrirani s potekom dela integracije SCTransform na Seuratu (24). Na kratko, 3000 funkcij je bilo uporabljenih za integracijo s funkcijo PrepSCTIntegration, funkcija FindIntegrationAnchors pa je bila uporabljena za omejitev paketnega učinka. Celoten nabor podatkov o približevanju in projekciji enotnega razdelilnika (UMAP) je bil ustvarjen z uporabo funkcije DimPlot in 16 najboljših glavnih komponent. Gruče so bile zgrajene s funkcijama FindNeighbors in FindClusters z ločljivostjo 0,6. Identifikacija gruče je bila izvedena s funkcijo FeaturePlot z ovrednotenjem izražanja specifičnih markerjev v vsaki gruči. Točkovni izrisi so bili ustvarjeni z uporabo funkcij za izrisovanje DotPlot in FeaturePlot, z normaliziranimi števili v testu RNK kot vhodnimi podatki.

CISTANCHE BO IZBOLJŠAL OKUŽBO LEDVIC/LEDVIC

Statistična analizaZnačilnosti pacientov in darovalcev so bile opisane s številkami, odstotki in frekvencami kategoričnih spremenljivk. Poročali smo o zveznih spremenljivkah z uporabo povprečij in standardnih odklonov (SD), če so normalno porazdeljeni, median in interkvartilnih razponov (IQR) za spremenljivke s poševno porazdelitvijo. Njihove lastnosti smo primerjali s Fisherjevim ali Wilcoxonovim testom, kadar je bilo primerno. Za primerjavo mediane izražanja miRNA glede na intenzivnost MVI smo uporabili Kruskal-Wallisov test, za korelacijsko analizo pa Spearmanov test. Upoštevali smo statistično pomembnost za P-vrednosti, manjše od 0.05. Za statistično analizo in predstavitev podatkov smo uporabili GraphPad Prism (različica 8; GraphPad Software, San Diego, CA) in RStudio (različica 4.0.3). Uporabljeni so bili naslednji paketi R: heatmap3 (heatmap3_1.1.9)za analize toplotnih zemljevidov, fmsb(fmsb_0.7.0)in lestvice (scales_1.1.1)paketi za radarske ploskve, ggplot2 (ggplot2_3.3.5)za palične grafe in complot(corrplot_0.90)za analizo korelacijske matrike.

REZULTATI

Večstopenjska identifikacija miRNA, povezanih z MVIBetween April 2013 and July 2015,646 patients enrolled in the BIOMARGIN study provided 716 indication or surveillance biopsies. Inadequate biopsies (N=49), biopsies with no paired sample for research use(N=135)or samples not passing molecular biology QC(N=49) were excluded, leaving 483 samples from 441 individuals available for this study (Figure 1A). Baseline and clinical characteristics of the study groups are provided in Supplementary Tables S1-3, and the histological characteristics of the biopsies are provided in Supplementary Tables S4-6. In the discovery cohort, a total of 27 patients met the MVI composite endpoint(MVI+), defined as clinical ABMR diagnosis and/or any level of MVI(g and/or ptc>0). Drugih 59 bolnikov (MVI-) je imelo različne diagnoze, vključno s T-celično posredovano zavrnitvijo (TCMR, N=8), intersticijsko fibrozo in tubularno atrofijo (IFIA, N=20) in normalnimi biopsijami (N{{6 }}), ampak MVI. Od 754 kandidatov za miRNA je bilo 18 miRNA različno izraženih med skupinama MVI plus in MVI- (slika 1B). V izbirni kohorti je bil omejen seznam 143 miRNA kvantificiran v 99 vzorcih. V tej selekcijski kohorti je bilo 14 miRNA različno izraženih med primeri z (N=28) in brez (N=71)ABMR (slika 1C). Končno je bilo v največji transsekcijski kohorti kvantificiranih 38 miRNA v 298 vzorcih, od katerih je bilo 12 miRNA različno izraženih med biopsijami ABMR(N=29) v primerjavi z biopsijami brez ABMR (N=269) (slika 1D). ).

Dosledna identifikacija 6 MiRNA, povezanih z MVI, in korelacija s histologijoNato smo presekali 3 sezname različno izraženih miRNA in identificirali 6 miRNA, ki so bile dosledno povezane z MVI ali ABMR v 3 neodvisnih kohortah (slika 2A). miR-142-3p,miR-150-5p,miR -155-5p, miR-222-3p in miR-223-3p so bili prekomerno izraženi v MVI/ABMR, medtem ko je bila ekspresija miR-139-5p zmanjšana. Radarske ploskve (slika 2B) prikazujejo za vsak korak diferencialni izraz med primerom in kontrolami 6 miRNA in podpirajo robustnost profilov miRNA v treh neodvisnih kohortah. Nato smo preučevali, kako je ekspresija 6 miRNA povezana s posameznimi histološkimi lezijami v vseh 483 biopsijah alogenskega presadka skupaj. Izražanje 5 navzgor reguliranih miRNA se je postopoma povečevalo z intenzivnostjo lezij MVI, medtem ko je bilo izražanje miR-139-5p v negativni korelaciji (slika 2C). MiR-139-5p/142-3p/ 150-5p/155-5p/223-3p niso bili le močno povezani z značilnostmi, povezanimi z ABMR (g, ptc, odlaganje C4d), temveč tudi z lezijami, povezanimi s TCMR (i, t ) in lezije IFTA (ct, ci), kar kaže na njihovo vpletenost v običajne, za ABMR nespecifične vnetne procese in procese brazgotinjenja. Druga možnost je, da med lezijami po naravi obstaja nekaj intrinzične kolinearnosti, kar povzroči našo nezmožnost prepoznati pravo specifičnost ene lezije. MiR-222-3p ni bil v korelaciji s histološkimi lezijami TCMR ali IFTA (slika 2D).

Integracija Multi-Omics: Interplay mRNA-miRNA v MVNato smo ovrednotili različno izražene gene med primeri MVI plus in MVI- v predhodno objavljenem naboru odkritij (25). Od 54.675 sond je bilo identificiranih skupaj 2755 različno izraženih genov (DEG) med MVI plus in MVI-

skupine, ki obsegajo 1085 navzdol reguliranih in 1670 navzgor reguliranih genov (slika 3A). Najbolj različno izražene mRNA v vzorcih MVI plus sta bili CXCL9 in CXCL10, v skladu s prejšnjimi poročili (17, 26), da so ti geni najbolj čezmerno izraženi v ABMR. Nato smo uporabili IPA in OMICSnet za identifikacijo in silico domnevnih ciljnih genov za vsako miRNA. Predvideno je bilo, da bo vsaj ena od 6 miRNA tarča skupno 4504 mRNA. Nato smo te 4504 predvidene tarče integrirali z DEG v biopsijah alogenskega presadka. Integrirana analiza miRNA/mRNA je odkrila 61 DEG, na katere cilja miR-139-5p, ki so bili znatno povečani pri biopsijah MVI plus. Ugotovil je tudi, da se je 28, 58, 52, 43 in 27 DEG znatno zmanjšalo pri MVI plus biopsijah, ki so bile ciljno usmerjene z miR-142-3p, miR-150-5p, miR-155-5p, miR{ {22}}p in miR-223-3p (slika 3B).

Celični izvor miRNA, povezanih z MVCelični izvor šestih miRNA je bil označen na različne načineledvičnacelic in podtipov hematopoetskih celic z uporabo atlasa miRNA, ki je na voljo na spletu [baza podatkov Fantom (27)]. Nenadzorovano združevanje v gruče diskriminiranoledvičnamiRNA, pridobljenih iz celic, iz miRNA, pridobljenih iz imunskih celic (slika 4A). Razkril je tudi eno ali dve prevladujoči vrsti celic za vsako miRNA. Zdi se, da se MiR-139-5p večinoma izraža v glomerularnih endotelijskih celicah (EC). MiR-222-3p, čeprav njegovo izražanje ni bilo povezano s tubularnim vnetjem (Banffove lezije"t", slika 2D), je bil predvsem povezan zledvičnaepitelne celice. Štiri preostale miRNA so bile primarno izražene v mononuklearnih celicah periferne krvi (PBMC) ali granulocitih, z miR-142-3p, obogatenim z NK celicami in monociti, miR-150-5p v celicah CD4 plus in CD8 plus T, miR -155-5p v celicah CD19 plus B in makrofagih ter miR-223-3p v nevtrofilcih.

Sekvenciranje enocelične RNA je identificiralo vse ledvične celice in infiltrirane imunske celice Da bi opisali potencialno vlogo vsake miRNA, povezane z MVI, smo analizirali javno dostopne podatke sc-RNAseq iz dvehledvičnabiopsije alogenskega presadka z ABMR in visokimi rezultati MVI (g2, ptc3) (22). Ti nabori podatkov so bili integrirani s 4 zdravimi referenčnimi biopsijami brez MVI. Po nadzoru kakovosti in filtriranju je bilo odkritih 31545 celic in nenadzorovano združevanje je razkrilo 12 grozdov (slika 4B). Uporabili smo dobro uveljavljene markerje (28), da smo identificirali vse glavne rezidenčne in infiltrirajoče podtipe celic in jih označili (dodatna slika S2). Nato smo se osredotočili na celične populacije, iz katerih naj bi izviralo naših šest miRNA. V ta namen smo celice stratificirali v 4 glavne skupine, ki ustrezajo endoteliju, epiteliju, limfocitom in APC (slika 4C). V skladu s prejšnjo analizo teh podatkov (22) v naborih podatkov sc-RNASeg niso bile odkrite niti populacije nevtrofilnih niti NK celic.

miR-139-5p nadzoruje aktivacijo EC in pot predstavitve antigena med MVIMiR-139-5p je bila edina znižana miRNA v naši študiji v primerih z MVI/ABMR (slika 2A) in je bilo ugotovljeno, da v glavnem izvira iz glomerularnega EC (slika 4A). Potrjeno je bilo, da je enainšestdeset njegovih ciljnih genov reguliranih navzgor v množični mikromreži iz primerov MVI plus (slika 3B), njihovo izražanje pa je bilo nadalje raziskano pri ločljivosti ene celice v 3 predhodno identificiranih podskupinah EC (sliki 4B, C). Kot je prikazano na sliki 5A, je bilo aktivirano ECcluster mogoče zaznati samo v vzorcih MVI plus. Poleg tega je bila polovica od 61 genov (N=30) dosledno povečana v biopsijah sc-RNAseq MVI plus, ne glede na tri podgrupe EC. Med temi je bil gen GBP5 najbolj povečan. Nato je analiza genske ontologije z uporabo teh 30 transkriptov, pridobljenih iz endotelija, identificirala UBE2D1 in YWHAG kot osrednja igralca v genski mreži (slika 5B). Natančneje, obogatene so bile imunsko povezane poti in glavne histokompatibilne kompleksne (MHC) obdelave in predstavitvene poti antigena (slika 5C). Analiza psevdočasa je bila izvedena za boljšo karakterizacijo sprememb genske ekspresije med aktivacijo EC, trajektorijo stanja celic (sliki 5D, E), UBE2D1, YWHAG in GBP5, ki so se stalno povečevali med endotelno aktivacijo, povezano z MVI. Zelo podobne trajektorije so bile ugotovljene za gene HLA-A, -B in -DRA, povezane z MHC, pa tudi za bonafidno endotelno aktivacijo in markerje vnetja, kot so VCAM1, CXCL9 in CXCL10, kar kaže, da so vsi ti geni sočasno izraženi med endotelno aktivacijo. Ti rezultati skupaj kažejo, da se miR-139-5p zmanjša med lezijami MV in ne zavira več predstavitvene poti antigena MHC v aktiviranem EC.

miR-222-3p oslabi obojeledvičnaFiziološke in imunsko povezane poti v epitelnih celicah med MVI Nato smo se osredotočili na miR-222-3p, navzgor regulirano miRNA v vzorcih MVI zledvičnaizvora epitelijskih celic in bolj ekskluzivno korelacijo s histološkimi lezijami, povezanimi z ABMR (sliki 2A, D, 4A). V masivnem tkivu alografta je bila ekspresija 43 njegovih ciljnih genov znižana (slika 3B) in nadalje ovrednotena pri ločljivost celic v različnihledvičnaepitelijske populacije, ki smo jih prej identificirali (sliki 4B, C). Ogromno zmanjšanje 41 od teh 43 (95 odstotkov) genov med vsemi identificiranimiledvičnagrozdi epitelijskih celic kažejo na utišanje genov

profil v VMI (slika 6A). Zanimivo je, da pri tem sodelujejo 4 geniledvičnafiziološke poti (ERBB4, ATPIB1, TIMM50 in KIF3B), ampak tudi imunsko povezani geni (TRAPI in PEBPI) so bili identificirani kot osrednji geni v mreži (slika 6B). Genska ontologija genov 43 je razkrila obogatitev v signalnih poteh ErbB, pa tudi v imunsko povezanih poteh in citokinski odziv (slika 6C) ter ekspresija ERBB4 je bila dodatno potrjena v vsehledvičnacelice (slika 6D). Ti rezultati skupaj kažejo, da je med VMI visoka raven-222-3p inledvičnaepitelijskih celic je povezana z močnim zatiranjem genov, ki sodelujejo tako priledvičnapoti elektrolitske homeostaze in imunsko povezane poti v epiteliju.

miR-150-5p uravnava aktivacijo NF-kB v limfocitih T med MVI. Podobno smo raziskali regulativno vlogo (povečanega) miR-150-5p med MVI v grozdu T-celic, kjer je bil najbolj dominantno izražen (Slika 4A). Narisali smo 58 zmanjšanih DEG, povezanih z MVI, identificiranih v vzorcih biopsije množičnega alogenskega presadka (slika 3B) in jih soočili z izražanjem genov v grozdu T-celic sc-RNAseq (slika 7A). Delež genov, na katere cilja miR150-5p in specifično premalo izraženih v T-celicah med MVI, je bil presenetljivo nizek (15/58, 25,9 odstotka), kar kaže na to, da globalno zmanjšanje teh genov in vivo ni bilo izključno posledica Kompartment limfocitov T. Kljub temu smo iz tega zelo izbranega seznama 15 genov in z uporabo platforme OMICSnet izdelali gensko mrežo (slika 7B) in opravili analizo genske ontologije (slika 7C). Opazili smo, da je prekomerna ekspresija miR-150-5p povezana z NF -KB regulacija v limfocitih T med MVI.

miR-155-5p Uravnava spajanje mRNA v APC med MV Končno je bila popolnoma ista strategija uporabljena za 52miR-155-5p-tarčne gene, ki so bili premalo izraženi med MVI (slika 3B). V nasprotju z miR-150-5p v limfocitih T smo opazili, da sta skoraj dve tretjini ciljnih genov miR-155-5p se je dosledno zmanjšalo v skupini APC sc-RNAseq (31/52, 59,6 odstotka, slika 8A). Analiza genske mreže je pokazala, da sta bila AIFMI in CIAO1 osrednja gena (slika 8B). Poleg tega je genska ontologija razkrila močno obogatitev poti, povezanih s spajanjem mRNA (slika 8C).

DISKUSIJAS svojo edinstveno zasnovo je študija BIOMARGIN tipičen okvir za integracijo podatkov z več omikami. Dejansko so bili zelo robustni cevovodi uporabljeni tako v kohortah odkrivanja, selekcije kot validacije, ki so zajemale veliko število bolnikov iz različnih transplantacijskih centrov. V treh neodvisnih kohortah smo sočasno opazovali in potrdili nenavaden profil izražanja 6 miRNA med MVI: miR-139-5p je bil zmanjšan, medtem ko je bil miR-142-3p/150-5p/{{5} }p/222-3p in miR-223-3p sta bila povečana. Pomembno je, da je bila raven vsake od teh 6 miRNA povezana z resnostjo MVI, kar kaže na od odmerka odvisen mehanizem regulacije. Nato smo uporabili silicijeve platforme za raziskovanje vsakega celičnega izvora miRNA. Presenetljivo je, da so opazili dve različni skupini miRNA: prvo, ki izhaja iz infiltriranih imunskih celic, in drugo, ki je bolj specifična za prebivalceledvičnacelice. Nato so bile tako miRNA kot mRNA izmerjene v istem odkritem nizu vzorcev biopsije, kar je omogočilo integrirano analizo in vivo validiranih različno izraženih mRNA/miRNA, povezanih z MVI. Nazadnje smo po opisu povezave mRNA/miRNA pri ločljivosti velikega tkiva potrdili medsebojno delovanje mRNA/miRNA pri ločljivosti ene celice za štiri od 6 identificiranih miRNA.

Zanimivo je, da je bila miR-139-5p edina miRNA v negativni korelaciji z lezijami MVI. Izvira predvsem iz EC in poročajo, da uravnava gene, povezane z MHC. Med njegovimi ciljnimi geni je bil UBE2D1 med endotelno aktivacijo, povezano z MVI, močno reguliran. Družina UBE2D je družina encimov E2, ki konjugira ubikvitin, v sistemu ubikvitin-proteasom (29, 30) in pokazalo se je, da UBeD1 povečuje vseprisotnost March-I, kar vodi do povečane regulacije proteinov MHC razreda II (31). Poleg tega je bil GBP5 najbolj zastopan gensko inaktiviran EC med MVI, kar je v skladu z našimi nedavnimi poročili, ki kažejo, da je GBP5 močno reguliran v biopsijah ABMR (17), pa tudi v vzorcih krvi (32). Zanimivo je, da se je izkazalo, da se ekspresija GBP5 inducira z interferonom tipa II v mikrovaskularnih endotelijskih celicah človeške maternice, skupaj s CXCL9 in CXCL10 (33). Zgodnja vloga teh dveh proinflamatornih kemokinov pri akutnih zavrnitvenih procesih je dobro dokumentirana in predlagana je njihova raven v urinu za spremljanje tveganja akutne zavrnitve pri rutinskem nadzoru prejemnikov ledvic (34). Druga tarča miR-139-5p je koda YWHAG.YWHAG za družino proteinov HLA-F in je bila opisana kot različno izražena med aktivnim profibrotičnim procesom pri diabetični nefropatiji (35). Možna vloga miR-139-5p pri fibrozi, končni skupni poti po vnetju, je še toliko bolj pomembna, ker je bil IFTA pred kratkim vključen v sestavljen rezultat za napovedovanje preživetja ledvičnega alogenskega presadka po ABMR (36). Ti rezultati skupaj kažejo, da miR-139-5p ne zavira več ekspresije antigena MCH na površini anethuma med MVI in bi lahko sodeloval pri kemoatrakciji in procesu fibroze, vendar je treba te mehanizme še eksperimentalno potrditi ekspresijo na površini endotelija med MVI in bi lahko sodelovali pri procesih kemoatrakcije in fifibroze, vendar je treba te mehanizme še eksperimentalno potrditi.

Drugiledvična-izvedena miRNA, ki smo jo identificirali, je miR-222- 3p, katerega izražanje je bilo ugotovljeno, da je bolj specifično za lezije MVI: povezano je z rezultati g in PTC kot tudi z odlaganjem C4d, ne pa tudi z lezijami i ali t. Vendar pa izvira predvsem iz epitelijskih celic. Po multiomski integraciji pri celični ločljivosti smo ugotovili, da miR-222-3p v glavnem zavira signalizacijo ErbB, ki je ključnega pomena za temeljne celične funkcije, kot so proliferacija, migracija, rast in diferenciacija (37). V človeški biologiji je potrebna fiziološka signalizacija ErbBledvičnaelektrolitsko homeostazo in vzdrževanje celovitosti ledvic (38). Naši rezultati so identificirali tudi ADAM22, NRG1, ZNF91 kot gene, povezane z ErbB signalizacijo, ki so med MVI izrazito potlačeni v epiteliju. Drugi geni, ki so bistveni za fiziologijo ledvic, kot sta ATP1B1 in KIF3B, so bili prav tako potlačeni v ledvičnem epiteliju z miR-222-3p med MVI. Pred tem sta Baker et al. je pokazalo, da ATP1B1 (b1 podenota Na plus /K plus -ATPaze) poganjaledvičnatubulna reabsorpcija natrija (39). Poleg tega Aguado-Fraile et al. so identificirali člana 3B družine kinezinov (KIF3B), ki je vpleten v trgovino s celicami v celicah proksimalnih tubulov podgan. KIF3B se zdi ključni mediator odziva celic proksimalnih epitelijskih tubulov na ishemijo/reperfuzijo s potencialno uporabo vledvičnazdravljenje ishemične poškodbe (40). Tako lahko špekuliramo, da miR-222-3p zavira bistvene fiziološke poti med MVI v epiteliju. Poleg tega so imunsko povezane poti regulirane tudi s prekomerno ekspresijo miR-222-3p: pomembni geni, kot sta TRAP1 in PEBP1, so bili v vzorcih z močnim MVI popolnoma inhibirani. Zanimivo je, da se je pokazalo, da TRAP1 izboljša stanjeledvičnatubulointersticijska fifibroza pri miših z enostransko obstrukcijo sečnice z zaščitoledvičnamitohondrije tubulnih epitelijskih celic (41). Poleg tega PEBP1 zagotavlja protivnetne učinke z zaviranjem poti MAPK in NF-kB v homeostatskih/bazalnih pogojih (42). noterledvičnaepitelija, študija Marka in sod. elegantno pokazalo, da postishemična aktivacija NF-kB poslabša tubulno poškodbo in poslabšuje vnetje (43). V naših rokah je miR-222-3p popolnoma zatrl PEBP1, kar kaže na to, da se pot NF kB sprosti med MVI. Ti rezultati skupaj kažejo, da je epitelijska biologija med MVI inledvičnaepitelne celice se aktivno odzivajo na poškodbe MVI, medtem ko se vpletenost tega tkiva v MVI redko obravnava. Te molekularne ugotovitve bi lahko osvetlile lezije akutne tubularne poškodbe, dobro uveljavljeno, a dolgo zanemarjeno merilo ABMR. Poleg tega je bilo dokazano, da lahko epitelijske celice izločajo eksosomski miR-222-3p in inducirajo fenotip M2 v makrofagih (44). Medtem so Li et al. pred kratkim so poročali, da makrofagi M2 prekomerno izražajo miR-155 in dostavljajo to miRNA v mikrookolje, tudi prek izločanja eksosomov. Pri presaditvi ledvice se je miR-155 povečal v različnih stanjih (IFTA, akutna zavrnitev in TCMR) in v telesnih tekočinah ali tkivih (45). Zanimivo je, da lahko miR- 155 spodbuja epitelijsko-mezenhimski prehod s ciljanjem na RASSF4 v epitelijskih celicah (46). Ta preslušavanje na osnovi miRNA med makrofagi inledvičnaepitelijskih celic je treba še ocenitipresaditev ledvicein še posebej v kontekstu MVI. V skladu s temi ugotovitvami smo opazili, da miR-155-5p v glavnem izražajo APC, ki zajemajo monocite in makrofage. V tej določeni podskupini je miR- 155-5p-target-geni ontologija razkrila obogatitev v poteh spajanja premRNA. Zanimivo je, da Janssen et al. poročali, da je vnetje pljuč povzročilo poti spajanja pred mRNA v alveolarnih makrofagih. Poleg tega se je aktivacija spajanja pred mRNA razlikovala pri makrofagih, ki prebivajo v tkivu, v primerjavi z makrofagi, pridobljenimi iz monocitov (rekrutirani s krvjo). Poročali so o spremembah presnove jedra v rekrutiranih makrofagih, s povečanim izlivom skozi glikolizo in zmanjšanim izlivom skozi cikel trikarboksilne kisline (cikel TCA, tj. Krebsov cikel) (47). V zvezi z miR-150-5p smo ugotovili, da je bila njegova prekomerna ekspresija med MVI povezana s potjo NF-kB v skupini limfocitov, ki zajema tako prirojene NKT celice kot adaptivne T celice. Zanimivo je, da je miR-150-5p ključnega pomena za ustvarjanje zrelih in funkcionalnih celic NK (48) in da so CD8 in celice T s pomanjkanjem miR-150-5p manj citotoksične (49). Poleg tega lahko celice T CD8 izločajo tudi miR-150-5p v eksosomih (50), kar bi lahko nato spodbudilo aktivacijo fibroblastov v tubularnih epitelijskih celicah in posledičnoledvičnafifibrozo, kot kažejo nedavna poročila (51, 52).

CISTANCHE BO IZBOLJŠAL DELOVANJE LEDVIC/LEDVIC

Naša študija ima nekaj omejitev. Našo raziskavo smo osredotočili na 6 miRNA, ki so bile dosledno identificirane v naši večstopenjski zasnovi. Vendar smo nadaljevali s postopnim izborom miRNA, pri čemer je le del vseh znanih miRNA kvantificiran v validacijski kohorti. Statistična pot za izbiro miRNA je temeljila na začetni zasnovi BIOMARGIN, ki je bila primerna za identifikacijo diagnostičnih biomarkerjev za več končnih točk (ABMR, pa tudi TCMR in IFTA). Zato miR-146a ni bila kvantificirana v validacijski kohorti, čeprav se je znatno povečala v kohortah za odkrivanje in izbor (slika 2A). S tem je bila miR-146a de facto izključena iz našega izbirnega postopka, čeprav literatura nakazuje vlogo pri ishemiji/reperfuziji pri presaditvi ledvice (53) in pri nadzoru aloimunskih odzivov, ki ga posreduje Treg (54). Poleg tega ne moremo izključiti, da bi močnejša velikost vzorca dala več miRNA, kot sta miR-138 (dol) in miR-511 (gor), ki so bile različno izražene v primerih ABMR izbirne kohorte in pokazala trend v isto smer v kohorti odkritij. Poleg tega nismo izvedli analize sc-RNAseq na lastnih vzorcih biopsije, ampak smo uporabili nabor podatkov sc-RNAseq, ki je na voljo na spletu. V času načrtovanja študije in zbiranja vzorcev biopsije tehnologija scRNAseq dejansko še ni bila na voljo in potreba po sveže zbranih vzorcih ni dovoljevala retrospektivne uporabe zamrznjenih ali parafinsko vdelanih vzorcev. Podobno je bilo profiliranje mRNA opravljeno z uporabo mikromrež, takratne referenčne tehnologije, ki jo zdaj prekaša naslednja generacija RNA-seq. Uporaba spletnega nabora podatkov sc-RNAseq omejuje našo sposobnost poročanja o osnovnih demografskih značilnostih bolnikov. Te manjkajoče informacije bi lahko povzročile zaskrbljenost glede reprezentativnosti skupin prebivalstva. Poleg tega nismo nadzorovali nobenega tehničnega vidika zaporedja. Zato pri izbrani ločljivosti naša analiza sc-RNAseq v teh vzorcih ni odkrila nobenega grozda nevtrofilcev ali celic NK. Zato so bile naše nadaljnje analize miR-142-3p in miR-223-3p omejene na izgradnjo njihove ustrezne ciljne genske mreže in ontologije (dodatna slika S2) in niso dovolile raziskovanja ločljivosti ene celice. Vendar pa je genska mreža in ontologija 27 ciljnih genov miR-223-3p razkrila obogatitev cikla TCA (dodatna slika S2) skupaj s signalizacijo ERBB. Tako lahko špekuliramo, da imata miR-155-5p v monocitih in miR-223-3p v nevtrofilcih vlogo pri presnovi in ​​vnetnem odzivu, ki ga te celice izvajajo med MVI. Poleg tega se je že pokazalo, da se miR-142-3p poveča pri zavrnitvi ledvičnega alogenskega presadka (9, 55, 56), vendar do zdaj ni bil posebej povezan z ABMR. Druga omejitev naše študije je, da se specifične spremembe izražanja genov v redkih celicah, ki se infiltrirajo, lahko prikrijejo v analizi množične izražanja genov. Potrebne so nadaljnje študije, ki vključujejo več vzorcev, da se omogoči pravilna preiskava vseh, tudi redkih podtipov celic, vendar so trenutno omejene z relativno visokimi stroški tehnike.

Za zaključek smo tukaj raziskali molekularne poti, povezane z MVI, glavno histološko poškodbo, povezano z ABMR. Uporabljeni integrirani omični pristop nam je omogočil razkritje novih poti, vključenih v MVI, in nakazuje, da se spremembe presnove tubularnega epitelija pojavijo kot posledica ABMR, onkraj bližnjega endotelijskega predela. Naša študija ponazarja velik potencial multiomike za razkrivanje mehanizmov bolezni in utira pot novim raziskavam za nadaljnjo razjasnitev navzkrižnega pogovora medledvičnarezidenčne celične podskupine in celice, ki infiltrirajo alogenski presadek.