Zaščita črevesja s proantocianidini vključuje antioksidativno in protivnetno delovanje v povezavi z izboljšanjem občutljivosti za inzulin ter homeostazo lipidov in glukoze 2. del

Prosim kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza več informacij

Ekspresija Tein z uporabo Western blota. Slika 6 prikazuje, da je dodatek Fe/Asc celicam Caco-2/15 zvišal raven dveh pomembnih encimov, vendar sta PAC uravnotežila njihovo z Fe/Asc povzročeno regulacijo.

Ker signalizacija insulina modulira procese lipogeneze, oksidacije FA in glukoneogeneze, je bilo pomembno raziskati vpliv Fe/Asc in PAC na MAPK in PI3K/Akt, dve glavni poti signalizacije insulina. V ta namen so bile celice Caco-2/15 predhodno inkubirane z insulinom pred drugo celico Caco-2/15

Slika 6. Učinki PAC na glukogenezo v celicah Caco-2/15. Proantocianidini (PAC, 250 ug/mL) so bili dodani v prostor za apikalne celice za 24 ur pred obdelavo z Fe/Asc （200 μM/2 mM） za 6 ur pri 37 stopinjah. Ekspresija proteina (A) G6Pase in (B) PEPCK je bila ocenjena z Western blotom.cistanche v prahuRezultati predstavljajo povprečje ± SEM 3 neodvisnih poskusov, vsakega v trojniku. Prikazan je reprezentativni Western blot, ki ponazarja poskus v trojniku na istem gelu in pri enaki izpostavljenosti.*P<0.05 vs="" untreated=""><0.05 vs="" fe/asc="" treated="" cells.="">korenina cistancheG6Paza glukoza-6-fosfataza, PEPCK fosfoenolpiruvat karboksikinaza.

Za več informacij kliknite tukaj

zdravljenja za aktiviranje signalne poti. Medtem ko je Fe/Asc povečal ekspresijo proteina p38-MAPK in razmerje fosfo p38-MAPK/p38-MAPK, so PAC preprečili ta dejanja (sl. 7A-C). Po drugi strani pa medtem ko je Fe/Asc znižal proteinsko maso fosfo Akt (pAkt) in razmerje Akt/Akt, so PAC-ji pokazali sposobnost ohranjanja normalne ravni. Podoben trend je bil opažen za PI3K (slika 7D-I. Zato ta opažanja podpirajo ugodno vlogo PAC pri signalizaciji insulina.

Diskusija

Polifenoli so dobro znani po svojih pleiotropnih bioloških in medicinskih učinkih, kar pojasnjuje privlačnost mnogih znanstvenikov in prehrambene industrije do teh fascinantnih naravnih proizvodov rastlinskega izvora. PAC izstopajo med raznolikostjo in velikim številom polifenolov zaradi svojih farmakoloških in terapevtskih učinkov na kronične bolezni 2021. Kljub njihovim hvalevrednim lastnostim je še vedno veliko neznanega o njihovem vplivu na GI trakt, ki uporablja razširjena prebavna, imunološka, ​​nevronska in metagenomska omrežja2.cistanche spatiIz tega razloga so bila prizadevanja v tej preiskavi namenjena razjasnitvi vloge PAC v črevesnem OxS, antioksidativni obrambi, vnetju, oksidaciji FA, lipogenezi in glukoneogenezi, hkrati pa so poskušali razjasniti osnovne mehanizme, kot je signalizacija insulina in stanje transkripcijskih faktorjev.

Za preverjanje učinkov PAC smo uporabili celično linijo Caco-2/15, priljubljen črevesni model, ki ga predvsem ceni znanstvena skupnost2, Uprava za hrano in zdravila pa priznava za procese privzema in transporta4. Ne samo, da se celice Caco-2/15 spontano diferencirajo v funkcionalno in morfološko podobne človeškim enterocitom3,25, ampak služijo tudi za učinkovito raziskovanje črevesne absorpcije in interakcij, prehrane, toksikologije, živilske mikrobiologije, testov biološke uporabnosti in presejanja prepustnost zdravil v programu odkrivanja2²627. Tako kot v naših prejšnjih poročilih o različnih temah28-3】 je bila celična linija Caco-2/15 ključna v trenutni študiji za razkritje potenciala PAC za uravnavanje različnih presnovnih poti. Pomembno je, da so bile v tej študiji celice posejane na porozne filtre, kar je omogočilo dostop do obeh strani bipolarnega črevesnega epitelija: apikalni in bazolateralni predel, ki ustreza črevesnemu lumnu oziroma seroznemu obtoku. Poleg tega smo predhodno inkubirali Caco-2 /15 s Fe/Asc, saj je bil ta sistem v našem laboratoriju zelo pomemben za induciranje močnega OxS in vnetja, ki ju je posledično izzval širok spekter efektorjev17,1932-3 Omeniti velja, da je Fe/Asc močan kisik - sistem za generiranje radikalov povzroči oksidativno škodo biološkim makromolekulam, spremeni znotrajcelično redoks okolje in je vpleten v številna patološka stanja 2.35,56. Naše ugotovitve kažejo znatno povišanje lipidne peroksidacije (visoke ravni MDA) skupaj z ranljivo antioksidativno obrambo (nizek GPx in ekspresije beljakovin SOD2).koristi cistanche tubulosaPoleg tega zaradi svoje sposobnosti tvorbe lipidnih peroksidov kompleks Fe/Asc spodbuja vnetje, kar dokazuje povečano izražanje TNFa, COX2 in NF-is. Skupaj sedanji rezultati potrjujejo nastanek radikalov in vnetja kot odziv na Fe/Asc

Prisotnost PAC je preprečila peroksidacijo lipidov, posredovano s Fe / Asc. Ker bi neuspeh antioksidativne obrambe lahko pojasnil indukcijo OKS, smo preučili njegovo delovanje na endogene antioksidativne encime. Pravzaprav so PAC lahko obnovili upad SOD2 in GPx, ki ga posreduje Fe/Asc. Da bi razmejili mehanizem za poslabšanje OxS s Fe/Asc in ublažitev s PAC, smo ocenili signalno pot Keap1-NRF2-antioxidant response element (ARE), ki velja za najmočnejši endogeni antioksidant regulator37.cistančev čajNRF2 je celični senzor OCS, katerega funkcija je vzdrževanje redoks homeostaze. V normalnih pogojih. NRF2 je nenehno ubikvitiniran in usmerjen na proteasomsko razgradnjo s svojim negativno vezanim regulatorjem Keap18. V prisotnosti endogenih in eksogenih efektorjev je Keapl inaktiviran in znižan, s čimer se prekine interakcija Keapl-NRF2 in sprosti NRF2, ki se prenese v celično jedro in se veže na promotorje, ki vsebujejo

Slika 7. Učinki PAC na inzulinsko občutljivost v celični liniji Caco-2/15. Proantocianidini (PAC, 250 ug/mL) so bili dodani v predel apikalnih celic za 24 ur pred obdelavo s Fe/Asc（200 μM/2 mM） za 6 ur pri 37 stopinjah. Dve uri pred koncem 6-urne inkubacije z mešanico Fe/Asc smo dodali inzulin (100 nM), da ocenimo občutljivost na inzulin. Ekspresija beljakovin (A) p38-MAPK, (B) fosfor p38-MAPK, (D)Akt, (E)fosfo Akt, (G) PI3k in (H) fosfo PI3k je bila ovrednoteno z Western blotom. Nato so bila izračunana razmerja (C) fosfo p38-MAPK/p38-MAPK, (F)fosfo Akt/Akt in (Dfosfo PI3k/PI3k. Rezultati predstavljajo povprečje ± SEM 3 neodvisnih poskusov vsak v dvojniku. Prikazan je reprezentativni Western blot, ki ponazarja poskus v trojniku na istem gelu in z enako izpostavljenostjo.*P<0.05 vs+/-insulin="" untreated=""><0.05 vs="" fe/asc+/-insulin-treated="" cells.p38-mapkp38-mitogen-activated="" protein="" kinase,="" pi3k="" phosphoinositide="" 3-kinase,="" akt="" protein="" kinase="">

ARE in pospešuje prepisovanje antioksidativnih encimov39. Po naših podatkih je obdelava celic Caco-2/15 s PAC zatrla Keapl in verjetno omogočila NRF2, da se prenese v jedro, kar omogoči vezavo na ARE (jedrno zaporedje: 5'TGACnnnGC3') v promotorski regiji antioksidantnih genov (SOD2 in GPx), kar ima za posledico stimulacijo njihove transkripcije in usklajeno regulacijo navzgor. V skladu s temi podatki je fenolna spojina resveratrol preprečila OxS v fibroblastom podobnih sinoviocitih revmatoidnega artritisa, zdravljenih s H, O, s spodbujanjem izražanja NRF2 in zmanjšanjem izražanja Keap12. Poleg tega je po mnenju Kanzakija et al lahko aktivacija antioksidativnih in citoprotektivnih encimov povezana z razmerjem NRF2/Keapl1.

Kot je bilo pričakovano glede na izboljšanje OKS, so PAC znatno zmanjšali vnetje, kar dokazuje znižana regulacija TNFa in COX2. Ker je NF-KB ključni regulator vnetnih citokinov, smo preučili njegov odziv na PAC. V skladu s trendom povzročiteljev vnetja so PAC odpravili indukcijo NF-KB, ki jo posreduje Fe/Asc, in zmanjšali razmerje NF-KB/IikB. Tako lahko razumno domnevamo, da PAC pomagajo zaščititi pred vnetjem, ki ogroža funkcije črevesnih celic prek nadzora NF-kB, glavnega regulatorja vnetnega odziva. Omeniti velja, da lahko PAC ščitijo pred vnetjem s spodbujanjem celičnih antioksidativnih obrambnih mehanizmov, saj obstaja tesna povezava med biomarkerji redoks neravnovesja in vnetjem2.

Namen te študije je bil raziskati učinke Paca na homeostazo lipidov v črevesju. Naše zanimive ugotovitve so pokazale, da so PAC na eni strani regulirali CPTla in znižali FAS, ki predstavljajo biomarkerje oksidacije FA oziroma lipogeneze. Zato so ti encimi možne tarče PAC, kar kaže na polifenolni potencial za preprečevanje kopičenja lipidov, ki velja za patološko manifestacijo vnetja OxSand v številnih tkivih*3. Molekularni mehanizmi so verjetno povezani s povečano regulacijo PPARa in znižano regulacijo SREBPlc, dveh transkripcijskih faktorjev, ki uravnavata presnovo lipidov. FAS je osrednji encim v lipogenezi, odgovoren za kataliziranje pretvorbe malonil-CoA v FAs45. Na svoji strani ACC katalizira tvorbo malonil-CoA, bistvenega substrata za FAS. V skladu z našimi ugotovitvami je bilo tudi ugotovljeno, da polifenoli Solanum nigrum zmanjšujejo FAS in SREBP, hkrati pa povečujejo CPTla in PPARa v hepatocitih, obdelanih z oleinsko kislino"6.

Mehanizmi delovanja polifenolov so na splošno povezani z aktivacijo fosforilacije AMKa7. Pomembno je, da je bila fosforilirana AMKa v naši študiji znižana s Fe/Asc, vendar stimulirana s PAC, kar pojasnjuje znižano regulacijo fosfo ACC, kar ima za posledico inhibirano lipogenezo in povečano presnovo energije. Vendar pa je bila ekspresija proteina AMKa povečana z Fe/Asc-induciranim OxS v celicah Caco2/15. V skladu s tem lahko ROS in OxS inducirata AMPKa prek različnih kinaz navzgor8.

OCS in vnetje močno povzročita insulinsko rezistenco in dodatne presnovne motnje 9, 50, kar nas je spodbudilo, da ocenimo sposobnost Paca za uravnavanje nekaterih ključnih beljakovin glede na insulinsko signalno pot. Najprej smo se osredotočili na p38-MAPK, katerega ekspresijo je OxS uravnal navzgor, medtem ko je motil signalno kaskado insulinskega receptorja. Analiza fosforilacije p38-MAPK in izračun razmerja fosfo p38-MAPK/p38-MAPK sta pokazala znatno povečanje odziva na Fe/Asc, kar je združljivo z oslabljenim IS pri Caco{ {6}}/15 celic. Validacija je bila pridobljena z upadom pAkt in PI3K. V nasprotju s tem so PAC obrnili trend, saj so pokazali sposobnost zmanjšanja fosforilacije p38-MAPK in razmerja fosfo p38-MAPK/p38-MAPK, hkrati pa izboljšajo signalno pot PI3K/Akt, za katerega je znano, da posreduje pri glavnih bioloških učinkih insulina z uravnavanjem transporta glukoze, sinteze beljakovin, celične proliferacije, celičnega preživetja in glukoneogeneze. Okvara IS zaradi OxS in kroničnega vnetja lahko vpliva tudi na proces glukoneogeneze3,54. Analiza dveh glavnih encimov, vključenih v novo sintezo glukoze (PEPCK, G6Pase), je pokazala znatno povečanje odziva na Fe/Asc, medtem ko jih je dajanje PAC vrnilo na normalne ravni v celicah Caco2/15.

Skratka, številne študije v znanstveni literaturi s posrednimi dokazi dokazujejo pomembne učinke fenolnih spojin na zdravje bodisi kot specifične fenolne molekule bodisi kot mešanice več polifenolov. Pričujoče delo poudarja ključni učinek PAC (kompleksnih flavanolov) v črevesni homeostazi s preprečevanjem OxS, vnetja in s tem povezanih presnovnih motenj. Ker tanko črevo morda ne bo v celoti absorbiralo PAC, so potrebne nadaljnje študije za raziskovanje mehanizmov, ki so vključeni v njihove koristne učinke na zdravje v tankem črevesu.

Material in metode

Intestinalna kultura Caco-2/15 in zdravljenje. Za vse poskuse smo uporabili celično linijo človeškega epitelijskega kolorektalnega adenokarcinoma Caco-2/15, stabilen klon starševskih celic Caco-2 (American Type Culture Collection, Rockville, MD, ZDA), ki je bil pridobljen od dr. JF Beaulieuja (Oddelek za celično biologijo, Medicinska fakulteta, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Kanada). Celična linija Caco-2/15 ima edinstveno lastnost, da se in vitro diferencira v polarizirane zrele enterocite in tvori neprepusten mon-over. Celice Caco-2/15 so bile kultivirane, kot je opisano prej323455, in uporabljene za študij celične celovitosti, OCS in vnetja17,19 in IS56.

Analiza izražanja beljakovin z imunoblotingom. Po inkubaciji z različnimi obdelavami smo celice Caco-2/15 lizirali v ledeno hladnem pufru, ki je vseboval 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 mM Na2E-DTA, 1 mM EGTA, 1 odstotek NP -40, 1 odstotek deoksiholata, 2,5 mM natrijevega pirofosfata, 1 mM Na2VO4, 1 ug/mL leupeptina in 1 mM PMSF. Koncentracijo beljakovin vsakega vzorca smo določili z uporabo Bradfordove metode （Bio-Rad）. Proteine ​​smo nato 5 minut denaturirali v vzorčnem pufru, ki je vseboval SDS in ß-merkaptoetanol. Homogenate, ki so vsebovali 15 ug skupnih proteinov, smo ločili na 10-odstotnem SDS-poliakrilamidnem gelu glede na molekulsko maso proteina in jih elektroblotirali na nitrocelulozne membrane. Mleko brez maščobe je bilo uporabljeno za blokiranje nespecifičnih mest na membranah pred dodajanjem primarnih protiteles čez noč pri 4 stopinjah. O redčenju protiteles poročajo v Dodatnih informacijah in v naši nedavni publikaciji. Reaktivni pasovi so bili zajeti s ChemiDoc MP Imaging System (Bio-Rad). Vsi podatki so izraženi kot razmerje med ciljnim proteinom in -aktinom v istem vzorcu.

Statistična analiza. Vse vrednosti so izražene kot povprečje ± SEM vsaj treh različnih poskusov, izvedenih v treh izvodih. Podatki so bili analizirani z enosmerno ANOVA, ki ji je sledil Tukeyjev test večkratne primerjave z uporabo PRISM 7.0(Programska oprema GraphPad, San Diego, CA, ZDA). Razlike so veljale za pomembne pri P<>

Ta članek je izvleček iz znanstvenih poročil|(2021) 11:3878|https://doi.org/10.1038/s41598-020-80587-5