Preiskava učinka hipertiroidizma na stres endoplazmatskega retikuluma in potencial prehodnega receptorja Canonical 1 Channel v ledvicah

za več informacij:ali.ma@wecistanche.com

Nuriye Ezgi BEKTUR AYKANAT^1,*,Erhan ŞAHİN², Sedat KAČAR², Rıdvan BAĞCI³Şerife KARAKAYA²,Dilek BURUKOĞLU DÖNMEZ², Varol ŞAHİNTÜRK²

¹Oddelek za histologijo in embriologijo, Medicinska fakulteta, Univerza Atılım, Ankara, Turčija²Oddelek za histologijo in embriologijo, Medicinska fakulteta, Univerza Osmangazi, Ankara, Turčija ³Oddelek za androloški laboratorij enote IVF, mestna izobraževalna in raziskovalna bolnišnica Adana, Adana, Turčija

Ozadje/namen:Hipertiroidizemje povezana s povečano hitrostjo glomerulne filtracije in povečano aktivacijo renin-angiotenzin-aldosterona. Motnje Ca2 in homeostaze v endoplazmatskem retikulumu (ER) so povezane s številnimi boleznimi, vključno z diabetično nefropatijo inhipertiroidizem. Prehodni receptorski potencial kanoničnega 1 (TRPC1) kanala je prvi klonirani protein družine TRPC. Čeprav je izražena marsikje vledvica, njegova funkcija je negotova. TRPC1 je vključen v uravnavanje Ca2 plus homeostaze in njegova regulacija poveča raven ER Ca2 plus, aktivira razvit proteinski odziv, kar vodi do celične poškodbe vledvica. Ta študija je raziskala vlogo TRPC1 vledvicehipertiroidnih podgan v smislu markerjev stresa ER, ki so z glukozo regulirani protein 78 (GRP78), aktivirajoči transkripcijski faktor 6 (ATF6), (protein kinazi R (PKR) podobna endoplazmatskem retikulumu kinaza) (PERK), encim 1, ki zahteva inozitol (IRE1).

Materiali in metode: Dvajset podganjih samcev je bilo razvrščenih v kontrolno in hipertiroidno skupino (n=10).Hipertiroidizemje bil induciran z dodajanjem 12 mg/L tiroksina v pitno vodo podgan za 4 tedne. Izmerjene so bile ravni T3 in T4 brez seruma (fT3, fT4), TSH, dušika sečnine v krvi (BUN) in kreatinina. Histokemična analizaledvicaodseke za morfološke spremembe ter tudi imunohistokemično in western blot analizo odsekov ledvic za protitelesa GRP78, ATF6, PERK, IRE1, TRPC1.

Rezultati: ravni TSH, BUN in kreatinina so se znižale, medtem ko sta se ravni fT3 in fT4 povečali pri hipertiroidni podgani. Morfološka analiza je pokazala odebelitev kapilarne bazalne membrane v glomerulih in tudi Western blot, imunohistokemični rezultati pa so pokazali povečanje TRPC1, GRP78 in ATF6 pri hipertiroidni podgani (p <>

Zaključek: Skratka, v naši študiji smo prvič pokazali, da je razmerje med ER stresom in TRPC1 ter njuno povečano izražanje povzročilo poškodbo ledvic pri hipertiroidnih podganah.

Ključne besede:Hipertiroidizem, stres endoplazemskega retikuluma (ER), prehodni receptorski potencial kanoničnega 1 (TRPC1),ledvica, podgana

1. Uvod

Trijodtironin (T3) in tiroksin (T4) sta ščitnična hormona, potrebna za normalen razvoj organov in presnovne funkcije [1]. Poleg tega uravnavajo hitrost rasti, delovanje natrijeve/kalijeve črpalke, srčni utrip, krvni tlak, dihanje, porabo kisika, prebavo, metabolizem lipidov, ogljikovih hidratov in beljakovin, delovanje centralnega živčnega sistema, gibanje in presnovne funkcije drugih endokrinih žlez [2] .

Hipertiroidizemima številne učinke na holesterol, trigliceride, lipide, oksidacijo, antioksidante, malondialdehid (MDA), katalizatorski encim katalazo (CAT), jetrne encime, sečno kislino, sečnino, kreatinin in histopatološke spremembe v jetrih in ledvicah [3]. Motnje delovanja ščitnice vplivajo na fiziologijo in razvoj ledvic. Pri hipotiroidizmu, pri katerem ščitnica deluje manj, se zmanjša ledvična masa (razmerje med ledvično in telesno maso), prihipertiroidizempri katerem žleza močno deluje, se poveča ledvična masa [4]. Vendar hud hipertiroidizem povzroči razgradnjo beljakovin in končno atrofijo ledvic. Hipertiroidizem povzroči povečanje ledvičnega krvnega pretoka (RBF) in hitrost glomerularne filtracije (GFR) [5]. Pri hipertiroidizmu se poveča reabsorpcija natrija v proksimalnem tubulu, bazolateralna aktivacija Na plus /K plus ATPaze [6], apikalnega Na plus /H plus modifikatorja [7] in Na plus /Pi kottransporterja [8]. Poleg tega ščitnični hormon aktivira modifikator Na plus /Ca2 plus, po možnosti preko poti, povezane s cAMP, in tako poveča absorpcijo kalcija vledvice[9].

Kalcij je sekundarni posrednik, ki uravnava večino celičnih funkcij, vključno z izražanjem genov in celično homeostazo [10], sproščanjem nevrotransmiterjev in delovanjem nevronov [11], metabolizmom in modulacijo celičnega življenja [12]. Družina kanalov prehodnega receptorskega potenciala (TRP) je ena največjih družin kationskih kanalov. Družina TRP je razdeljena na podskupine TRPC (kanonična), TRPM (melastatin), TRPP (policistin), TRPV (vaniloid), TRPML (bukolična), TRPA (ankirin) in TRPN (NOMPC-podobna). Znano je, da proteini TRPC tvorijo Ca2 plus prepustne, neselektivne kationske kanale in zato igrajo pomembno vlogo pri Ca2 plus signalni transdukciji. Družina TRPC sesalcev ima sedem članov, imenovanih TRPC1-TRPC7 [13]. Člani družine TRPC so izraženi v različnih delihledvica. TRPC1, ki ima pomembno vlogo zlasti pri diabetični nefropatiji, je izražen skoraj povsod, v mezangialnih celicah ledvic, glomerulih, celicah proksimalnih tubulov in v tankem padajočem delu Henlejeve zanke, vendar njegova natančna funkcija še vedno ni znana [14].

Hude motnje Ca2 plus lahko sprožijo poškodbe celic, ki jih povzroči stres endoplazmatskega retikuluma (ER) kot odziv na različna patološka stanja [5,15]. Motnje Ca2 in homeostaze v ER so povezane s številnimi boleznimi [16]. ER je znotrajcelični organel, ki je pomemben za uravnavanje Ca2 in homeostaze ter sintezo in zlaganje beljakovin. Modulacija ekspresije/funkcije Ca2 plus prepustnih kanalov vpliva tudi na znotrajcelične koncentracije Ca2 plus in posledično Ca2 plus povezane procese, kot so celična proliferacija, ER stres, apoptoza in avtofagija. ER stres je stanje, ki moti redoks ravnovesje in luminalno Ca2 plus homeostazo, kar povzroči kopičenje nezvitih/napačno zvitih beljakovin. Aktivacija odziva nezvitega proteina (UPR) povzroči povečanje z glukozo reguliranega proteina 78 (GRP78), spremljevalca ER, kar poveča sposobnost zvijanja proteina ER [17]. Aktivacija stresa ER sproži evolucijsko ohranjeni UPR s tremi glavnimi signalnimi pretvorniki membrane ER: PERK, IRE1 in ATF6. Celična disfunkcija in celična smrt se pojavita v pogojih, ko je ER stres kronično podaljšan in je obremenitev ER z beljakovinami znatno presežena. Znano je, da je ena od poti, ki povzročajo celično smrt, opaženo pri kroničnih boleznih, kot so hipoksija, ishemija/reperfuzijska poškodba, nevrodegeneracija, bolezni srca in sladkorna bolezen, posledica ER stresa [12].

V luči vseh teh informacij smo želeli raziskati razmerje med potmi transdukcije signala TRPC1 in ER-stresom vledvice, ki so prizadeti na splošno vhipertiroidizem.

Kliknite zaCistanche uporablja za simptome bolezni ledvic

2. Materiali in metode

2.1. Živali

Našo študijo je odobril lokalni odbor za etiko živali Univerze Eskişehir Osmangazi (sklep št. 634 na sestanku št. 117 dne 30. 11. 2017) in je sledila Vodniku za nego in uporabo laboratorijskih živali, ki ga je objavil Nacionalni inštitut za zdravje. Dvajset odraslih (7–8 tednov starih) albino podganjih samcev Wistar, pridobljenih iz medicinskega in kirurškega eksperimentalnega raziskovalnega centra (TICAM), je bilo 12 ur vzdrževanih pri 24 ± 2 stopinjah in 55 ± 5 odstotkih vlažnosti v svetlem/temnem okolju med poskus. Živali so za 2 tedna pred poskusom postavili v polikarbonatne kletke in jim pustili, da so se prilagodile razmeram v okolju, nato pa so jih naključno razporedili v kontrolno in hipertiroidno skupino. Kontrolna skupina (euthyroid) je bila med poskusom hranjena s standardno krmo za podgane in vodo iz pipe. Hipertiroidna skupina je bila ustanovljena s standardno krmo za podgane 4 tedne in pitjem vode iz pipe, ki je vsebovala 12 mg/L tiroksina [18]. Ob koncu četrtega tedna so podgane evtanazirali z intramuskularno injekcijo ketamina (45 mg/kg) in ksilazina (5 mg/kg). Vsem živalim so takoj odvzeli vzorce intrakardialne krvi. celaledviceodstranili s postopkom nefrektomije. Nato desno in levoledvicepodgan smo vzdolžno razrezali na dva dela. Oba dela desne in leve ledvice sta bila uporabljena za analizo western blot in svetlobno mikroskopijo

2.2. Biokemijske analize

Vzorce krvi smo centrifugirali pri 11,000 obratih na minuto 10 minut. Serume smo dali v epruvete in shranili pri -80 stopinjah do dneva analize. Ravni T3 brez seruma (fT3), prostega T4 (fT4) in ščitnično stimulirajočega hormona (TSH) so bile nato izmerjene s tehniko ELISA v skladu s protokolom proizvajalca. Stopnje izražanja optične gostote (OD) so bile odčitane pri 450 nm z bralnikom mikroplošč BioTek 800 (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, ZDA), nato so bili rezultati izračunani. Komercialni kompleti za fT3 (YLA0127RA), fT4 (YLA0239RA) in TSH (YLA0047RA) so bili kupljeni pri Shanghai YL Biotech na Kitajskem. Prav tako so bile izmerjene vrednosti dušika sečnine v serumu (BUN) in kreatinina z metodo absorbančne fotometrije Cobas Integra 400 Plus Roche (Roche Diagnostics Ltd., Švica).

2.3. Histološka ocena

Ledvicakoščke, ki smo jih pregledali na nivoju svetlobnega mikroskopa, smo 48 ur fiksirali v 10 odstotnem formaldehidu. Po rutinski obdelavi tkiva so bili pridobljeni parafinski bloki. Nato smo vzeli 5 µm serijske reze in jih obarvali s tehniko Periodna kislina–Schiff (PAS). Opravljeno je bilo mikroskopsko vrednotenje glomerulov in tubulov pod mikroskopom Olympus BX-51 (Olympus America, Inc., New York, ZDA). Odseki so bili ocenjeni na slep, polkvantitativni način z uporabo uveljavljene lestvice točkovanja. Za vsako podgano v skupinah je bilo pregledanih vsaj 10 polj visoke moči (×1000). Odstotek glomerulov, pri katerih je bila glomerularna bazalna membrana zadebeljena, je bil ocenjen na naslednji način: 0=nič, 1 manj kot ali enako 25 odstotkom, 2=25 odstotkov do 50 odstotkov, 3 =50 odstotkov do 75 odstotkov , 4 Večji ali enak 75 odstotkom [19]. Debelina glomerularne bazalne membrane (µm) je bila izmerjena s programsko opremo za mikroskop ZEISS ZEN 3.0 (Carl Zeiss Microscopy GmbH ZEISS Group, München, Nemčija).

2.4. Imunohistokemična ocena

Odseki parafinskih blokov iz vsakegaledvicatkivo smo vzeli na pozitivno nabita stekelca. Po deparafinizaciji smo stekelca prenesli skozi serijo razgrajenega etanola in nato ksilola. Odseke smo inkubirali s 3 odstotki vodikovega peroksida, da preprečimo aktivnost endogene peroksidaze. Po pridobivanju antigena s citratnim pufrom smo odseke razmejili s pap-peresom, 3 × 5 minut sprali s fiziološko raztopino s fosfatnim pufrom (PBS) in nato blokirali z Ultra V-blokom 1 uro pri sobni temperaturi. Odseke smo inkubirali s kunčjim poliklonskim protitelesom ATF6 (ab203119, Abcam Inc., Cambridge, ZDA), kunčjim poliklonskim protitelesom IRE1 (YID5384, Shanghai YL Biotech Co., Ltd, Kitajska), mišjim monoklonskim protitelesom PERK (sc377400, Santa Cruz Biotechnology Inc ., Heidelberg, Nemčija) in mišje monoklonsko protitelo TRPC1 (sc133076, Santa Cruz Biotechnology Inc.) čez noč pri plus 4 stopinjah v vlažnih pogojih. Po izpiranju 3 × 5 minut s PBS smo odseke inkubirali z ustreznimi sekundarnimi protitelesi (sc2359, sc2781, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) 1 uro pri sobni temperaturi. Nato so jih ponovno sprali 3 × 5 minut s PBS in kontrastno obarvali s hematoksilinom. Predmetna stekelca so nanesli na pokrovno stekelce z mediji na vodni osnovi. Mikroskopski pregled je bil izveden z uporabo mikroskopa Olympus BX51 in računalniško podprtega slikovnega sistema (Olympus America, Inc., New York, ZDA).

Vse imunsko obarvane odseke je na šifriran način ovrednotil glavni avtor, ki je bil zaslepljen glede imena skupine poskusov. Ekspresije TRPC1, ATF6, IRE1 in PERK so bile odkrite predvsem v tubulih in/ali glomerulih. Izraze smo semikvantitativno določili glede na odstotek pozitivnihledvicarazdelki. Intenzivnost obarvanja je bila razvrščena v štiri stopnje: nič ({{0}}), šibko (1), zmerno (2) in močno (3). Odstotek pozitivnih histoloških rezov ledvic je bil razvrščen v 4 stopnje: 0 (0 odstotkov), 1 (1 odstotek –10 odstotkov), 2 (11 odstotkov –49 odstotkov) in 3 (50 odstotkov –100 odstotkov). Skupna ocena je bila produkt dveh točk, končna ocena enega vzorca pa je bila povprečje 10 mikroskopskih polj. TRPC1, ATF6, IE1 in PERK so bili ocenjeni v skladu s prijavljeno metodo [20].

Cistanche-delovanje ledvic

2.5. Western blot analize

Za določitev sprememb v količini specifičnih beljakovin vledvicatkivahipertiroidizemin kontrolni skupini so ledvice razrezali na majhne koščke in izvedli homogenizacijo z dodajanjem liznega pufra RIPA v 2 ml epruvete s kroglicami. Po homogenizaciji smo epruvete inkubirali pri 4 stopinjah vsaj 30 min, nato pa tkivne lizate centrifugirali pri 4 stopinjah, 15,000 g 20 minut. Supernatant, ki je vseboval celotne beljakovine, smo prenesli v novo epruveto. Določanje beljakovin je bilo izvedeno iz supernatanta z napravo Qubit 2.0 (Invitrogen Inc., Waltham, MA, ZDA). V vsako jamico smo naložili 50 µg proteina, podvrgli elektroforezi s SDS-PAGE Bio-Rad MiniTrans Blot (Bio-Rad Laboratories, Inc., Kalifornija, ZDA) in nato prenesli na PVDF membrano z Bio-Rad Trans Turbo napravo. Membrane so bile blokirane s 5 odstotki govejega serumskega albumina (BSA) 1 uro pri sobni temperaturi in nato inkubirane z mišjim monoklonskim protitelesom GRP78 (sc166490, Santa Cruz Biotechnology Inc.), kunčjim poliklonskim protitelesom ATF6 (ab203119, Abcam Inc., Cam bridge, ZDA), kunčje poliklonsko protitelo IRE1 (YID5384, Shanghai YL Biotech Co. Ltd., Kitajska), mišje monoklonsko protitelo PERK (sc377400, Santa Cruz Biotechnology Inc.), mišje monoklonsko protitelo TRPC1 (sc133076, Santa Cruz Biotechnology, Inc. ) in mišje monoklonsko aktinsko protitelo (sc47778, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) (za nadzor obremenitve) čez noč pri 4 stopinjah . Nato so bile membrane 3 × 10 minut sprane s pralno raztopino (TBST), čemur je sledila inkubacija z ustreznimi sekundarnimi protitelesi (sc2005, sc2030, Santa Cruz Biotechnology Inc.). Potem ko so bile membrane 3 × 10 minut sprane s TBST, so nivoji ekspresije proteinov v imunoreaktivnih pasovih spremljali s sistemom za slikanje (C-Digit, Licor, Cambridge, UK). Rezultate slik smo analizirali s programom Image J 1.49v.

2.6. Statistična analiza

Vse statistične analize so bile izvedene s programom statističnega paketa IBM SPSS 21.0 (IBM Corp., Armonk, NY, ZDA). Poskus Western blot smo ponovili trikrat za vsako skupino. Raven pomembnosti je bila sprejeta kot p < 0.05.="" za="" določitev="" normalne="" porazdelitve="" podatkov="" je="" bil="" uporabljen="" shapiro-wilkov="" test.="" test="" homogenosti="" variance="" (test="" levene)="" je="" bil="" uporabljen="" za="" oceno,="" ali="" imajo="" skupine="" enake="" variance.="" izveden="" je="" bil="" t-test="" neodvisnih="" vzorcev="" za="" podatke,="" ki="" kažejo="" normalno="" porazdelitev.="" mann–whitneyjev="" u="" test="" je="" bil="" izveden="" za="" podatke,="" ki="" kažejo="" nenormalno="">

3. Rezultati

3.1. Biokemijski rezultati

Serumske ravni fT3, fT4 in TSH, serumske ravni BUN in kreatinina skupin podgan so prikazane na sliki 1. Rezultati kažejo, da sta se ravni fT3 in fT4 znatno povečali v skupini s hipertiroidom v primerjavi s kontrolno skupino (obe p < {{5="" }}.05).="" poleg="" tega="" so="" ugotovili="" pomembno="" znižanje="" ravni="" tsh="" v="" hipertiroidni="" skupini="" v="" primerjavi="" s="" kontrolno="" skupino="" (p="">< 0.05)="" (slika="" 1a).="" ravni="" serumskega="" bun="" (slika="" 1b)="" in="" kreatinina="" (slika="" 1c)="" so="" se="" v="" skupini="" s="" hipertiroidom="" znatno="" zmanjšale="" v="" primerjavi="" s="" kontrolno="" skupino="" (obe="" p=""><>

3.2. Histokemični rezultati

Histološke spremembeledviceskupin podgan so prikazane na sliki 2. Histologija ledvic (glomeruli, tubuli in vaskularne strukture) je bila tipična v kontrolni skupini (slika 2A). vendarhipertiroidizempovzročila zadebelitev kapilarne bazalne membrane v glomerulu (slika 2B). Debelina glomerularne bazalne membrane se je znatno povečala v skupini s hipertiroidi v primerjavi s kontrolno skupino (slika 3–4), (p < 0.05).="" med="" kontrolno="" in="" hipertiroidno="" skupino="" ni="" bilo="" očitne="" razlike="" v="" smislu="" tubularne="">

Slika 1. Ravni prostega trijodotironina (fT3), prostega tiroksina (fT4) in ščitničnega stimulirajočega hormona (TSH) skupin podgan (a). * Različno od kontrolne skupine (p < 0.05).="" serumske="" ravni="" bun="" (b)="" in="" kreatinina="" (c)="" skupin="" podgan.="" *="" za="" razliko="" od="" kontrolne="" skupine="" (p="">< 0,001)="" je="" bil="" opravljen="" t-test="" neodvisnih="">

Slika 2. Mikrografiledvicatkiva kontrolne (A) in hipertiroidne (B) skupine. V kontrolni skupini je vidna značilna histologija ledvic (A). V skupini hipertiroidizma,hipertiroidizempovzročila zadebelitev kapilarne bazalne membrane v glomerulu. Opazili so zadebelitev kapilarne bazalne membrane v glomerulu (puščica) (B). V meduli ledvic pri obeh skupinah podgan ni očitnih razlik. (Schiffovo (PAS) barvanje s periodično kislino). Palice so 20 µm in 50 µm.

3.3. Imunohistokemijski rezultati

Imunohistokemične reakcije TRPC1, GRP78, ATF6, IRE1, PERK in njihove ekspresije so polkvantitativno določene glede na odstotek pozitivnihledviceskupin podgan (slika 5–9). Tudi njihova povprečna variacija je prikazana v tabeli. V primerjavi s kontrolno skupino se je izražanje beljakovin TRPC1, GRP78, ATF6, IRE1 in PERK znatno povečalo v skupini s hipertiroidi v glomerulih in tubulih (slika 5–9) (p < 0,000).="" rezultati="" so="" pokazali,="" da="" je="" bil="" trpc1="" izražen="" v="" glomerularnih="" in="" tubularnih="" strukturah="" v="" kontrolni="" skupini="" (slika="" 5-1ab)="" in="" je="" bil="" njegov="" izraz="" povečan="" v="" skupini="" s="" hipertiroidi="" (slika="" 5-2ab).="" grp78="" ni="" bil="" izražen="" v="" kontrolni="" skupini="" (slika="" 6-1ab),="" njegovo="" pozitivno="" reakcijo="" pa="" so="" opazili="" v="" obeh="" tubulih="" in="" glomerulih="" v="" skupini="" s="" hipertiroidi="" (slika="" 6-2ab);="" medtem="" ko="" atf6="" ni="" bil="" izražen="" v="" kontrolni="" skupini="" (slika="" 7-1ab),="" so="" se="" njegove="" ekspresije="" pozitivno="" odzvale="" tako="" v="" tubulih="" kot="" v="" glomerulih="" v="" hipertiroidni="" skupini="" (slika="" 7-2ab).="" ire1="" ni="" bil="" izražen="" v="" kontrolni="" skupini="" (slika="" 8-1ab),="" njegovo="" pozitivno="" reakcijo="" pa="" so="" opazili="" v="" obeh="" tubulih="" in="" glomerulih="" v="" hipertiroidni="" skupini="" (slika="" 8-2ab).="" medtem="" ko="" perk="" ni="" bil="" izražen="" v="" kontrolni="" skupini="" (slika="" 9-1ab),="" je="" bilo="" izražanje="" perk="" omejeno="" na="" tubule="" v="" hipertiroidni="" skupini="" (slika="">

Slika 3. Primerjava debeline glomerularne bazalne membrane med kontrolno in hipertiroidno skupino. * Za razliko od kontrolne skupine (p < 0,05)="" je="" bil="" opravljen="" t-test="" neodvisnih="">

Slika 4. Primerjava točkovanja debeline glomerularne bazalne membrane med kontrolno in hipertiroidno skupino. *Za razliko od kontrolne skupine (p < 0,05)="" je="" bil="" izveden="" mann–whitneyjev="" u="">

3.4. Rezultati Western blota

Rezultati Western blota (slika 10) so pokazali statistično značilno povečanje izražanja TRPC1, PERK, ATF6 in GRP78 v skupini s hipertiroidom v primerjavi s kontrolno skupino (p < 0.05).="" povečanje="" ire1="" je="" bilo="" statistično="" značilno,="" čeprav="" ne="" toliko="" kot="" druge="" ravni="" beljakovin="" (p=""><>Hipertiroidizempovzročil povečanje izražanja GRP78 (2,16-krat), ATF6 (2,82-krat), PERK (1,95-krat), IRE1 (1,60-krat) in TRPC1 (1,53-krat) v primerjavi s kontrolno skupino.

4. Razprava

V tej študiji smo prvič predlagali, kako je prizadeto ledvično tkivo prihipertiroidizemv smislu vloge stresa ER in kanala TRPC1 v tem procesu. V naši študiji je povečana ekspresija TRPC1 povzročila povečanje koncentracije Ca2 plus v celici, zlasti zgoščevanje bazalne membrane kapilar in povečano ekspresijo GRP78 v tubulih, zlasti v glomerulih. Menimo, da ima ER stres aktivno vlogo v tem procesu celične poškodbe, zlasti prek pretvornika signala ATF6 in PERK na poti UPR (odziv na nerazvite proteine).

Kot je razvidno iz številnih študij, kot je naša študija [18], se vrednosti fT3 in fT4 povečajo v primeru hipertiroidizma, medtem ko se raven TSH zniža. Vsaka disfunkcija ščitnice lahko vpliva na proizvodnjo fT3 in fT4, kar je lahko povezano z različnimi patologijami po telesu [21]. Theledviceigrajo ključno vlogo pri izločanju odpadnih produktov in toksinov, kot so sečnina, kreatinin in sečna kislina. Ocena delovanja ledvic je pomembna pri zdravljenju bolnikov z boleznijo ledvic ali patologijami, ki vplivajo na delovanje ledvic. Testi ledvične funkcije so uporabni pri ugotavljanju prisotnosti ledvične bolezni, spremljanju odziva ledvic na zdravljenje in določanju napredovanja ledvične bolezni. Raven kreatinina v serumu se zmanjša pri hipertiroidizmu, ne le zaradi povečanja GFR, ampak tudi zaradi povečanega uničenja mišic. Tudi zmanjšanje koncentracije BUN vhipertiroidizemdomneva se, da je posledica zmanjšanega izražanja akvaporina 1 in 2. Zato sta se ravni BUN in kreatinina zmanjšali v številnih študijah [22], kot v naši študiji. V patoloških pogojih lahko celice izgubijo proteostazo, kar povzroči kopičenje nezvitih in napačno zvitih proteinov v ER, kar sproži UPR ali ER stres [23].

Slika 5. Imunohistokemično barvanje za TRPC1 v kontrolnih (1A-B) in hipertiroidnih (2A-B) skupinah vledvicatkivo. Izražanje TRPC se je povečalo v hipertiroidni skupini v primerjavi s kontrolno skupino (puščice). Palice so 50 µm. *Za razliko od kontrolne skupine (p < 0.000)="" je="" bil="" izveden="" mann–whitneyjev="" u="">

Slika 6. Imunohistokemično barvanje za GRP78 v kontrolnih (1A-B) in hipertiroidnih (2A-B) skupinah vledvicatkivo. Izražanje GRP78 je povečano v hipertiroidni skupini (puščice). Palice so 50 µm. *Za razliko od kontrolne skupine (p < 0.000)="" je="" bil="" izveden="" mann–whitneyjev="" u="">

Slika 7. Imunohistokemično barvanje za ATF6 v kontrolnih (1A-B) in hipertiroidnih (2A-B) skupinah vledvicatkivo. Izražanje ATF6 je povečano v hipertiroidni skupini (puščice). Palice so 50 µm. *Za razliko od kontrolne skupine (p < 0.000)="" je="" bil="" izveden="" mann–whitneyjev="" u="">

Slika 8. Imunohistokemično barvanje za IRE1 v kontrolnih (1A-B) in hipertiroidnih (2A-B) skupinah vledvicatkivo. Izražanje IRE1 je povečano v hipertiroidni skupini (puščice). Palice so 50 µm. *Za razliko od kontrolne skupine (p < 0.000)="" je="" bil="" izveden="" mann–whitneyjev="" u="">

Slika 9. Imunohistokemično barvanje za PERK v kontrolnih (1A-B) in hipertiroidnih (2A-B) skupinah vledvicatkivo. Izražanje PERK je povečano v hipertiroidni skupini (puščice). Palice so 50 µm. *Za razliko od kontrolne skupine (p < 0.000)="" je="" bil="" izveden="" mann–whitneyjev="" u="">

Motnje v ER in citosolni Ca2 plus homeostazi so povezane s številnimi boleznimi, vključno zledvica. Motnja ER Ca2 in homeostaze sproži UPR, ki prepreči nadaljnje kopičenje na novo sintetiziranih beljakovin v ER. Tako kaže obrambni mehanizem za preživetje z zmanjšanjem bremena za ER [24].

Znano je, da različni dejavniki povzročajo ER stres in sprožijoledvicapoškodbe. Stres ER v ledvicah lahko povzroči diferenciacijo tubularnih epitelijskih celic z mezenhimskim prehodom iz epitelija, izgubo ledvičnih tubularnih epitelijskih celic z apoptozo in končno ledvično patologijo, vključno z izgubo nefrona, ki zmanjša filtracijsko zmogljivost ledvic. V študiji Dickhouta et al. je bil prikazan epitelijsko-mezenhimski prehodni proces v celični liniji ledvičnih proksimalnih tubulov HK-2, ki ga povzroči ER stres, za kronično ledvično bolezen [25]. Poleg številnih študij [9], kot je razvidno iz naše študije,hipertiroidizempovzročila zadebelitev kapilarne bazalne membrane v glomerulu. Predlagano je bilo, da je povečano zgoščevanje bazalne kapilarne membrane v glomerulih nastalo kot posledica epitelno-mezenhimskega prehodnega procesa zaradi povečane ekspresije GRP78 in pretvornikov ER-stresnega signala. Pomen ER stresa se je pokazal pri kroničnemledvicabolezni v številnih patoloških stanjih. V modelu sladkorne bolezni, povzročene s streptozotocinom, pri miših C57BL/6 se je razvil ER stres in huda nefropatija, ki se je pojavila v dvaindvajsetem mesecu, je bila povezana z regulacijo CHOP/GADD153, ene od komponent poti apoptoze, ki jo povzroča ER [26]. ]. Pri bolnikih z nefrotskim sindromom, nefropatijo IgA, primarnim mezangialnim proliferativnim glomerulonefritisom in membransko nefropatijo, vključno z bolniki z minimalnimi simptomi, so bili imunohistokemični izrazi GRP78 in inducibilnega endoplazmatskega retikuluma (ER) spremljevalne molekule kisika reguliranega proteina 150 (ORP150) povečani v primerjavi s kontrolami. Povečana je bila tudi ekspresija CHOP/GADD153 in opažena jedrna lokalizacija v epiteliju proksimalnega tubula nefrotičnih bolnikov. V človeških ledvičnih celicah, izpostavljenih visokim ravnem serumskega albumina, so opazili indukcijo stresa ER, ki je pokazala, da povzroča apoptozo preko poti CHOP/GADD153 [25]. Tubulointersticijski ER stresni odziv je bil odkrit pri glomerulnih boleznih z apoptozo tubularnih celic, povezano z nefrozo puromicin amino nukleozida, preobremenitvijo s proteini in proteinurijo, povezano z eksperimentalno ali humano diabetično nefropatijo [27]. Lorz et al. poročali, da paracetamol, analgetik in antipiretik, povzroča poškodbo ledvičnih tubulov in apoptozo zaradi ER stresa [28]. Paracetamol inducira ER odziv na stres, vključno z indukcijo CHOP in cepitvijo kaspaze-12. Prekomerno kopičenje sekretornih proteinov povzroči ER stres, kar povzroči poškodbe podocitov [29]. Napad komplementa povzroči tudi stres ER in aktivira pot PERK, kar vodi do poškodbe glomerulnih epitelijskih celic. Vse te ugotovitve kažejo, da je ER stres eden glavnih vzrokov za poškodbe ledvic in da je odziv na ER stres obrambni mehanizem protiledvicaškoda [30]. V naši študiji menimo, da hipertiroidizem, ki ga povzroči 12 mg/l tiroksina, povzroča ER stres v ledvičnem tkivu in škodo, ki jo povzročihipertiroidizemv ledvičnem tkivu je povezan z regulacijo zlasti ATF6 in PERK.

Prvi klonirani kanal TRP pri sesalcih, ionski kanal TRPC1, najdemo v celici znotraj ER, plazemske membrane, intracelularnih veziklov in primarnega ciliarja. Izraža se skoraj povsod v tkivih ljudi in glodalcev. TRPC1 sodeluje z različnimi proteinskimi skupinami, vključno s podenotami ionskih kanalčkov, receptorji in citosolnimi proteini, da posreduje njegov učinek na signal Ca2 plus. Deluje kot neselektivni kationski kanal v poteh, ki nadzorujejo dotok Ca2 in kot odgovor na aktivacijo receptorjev na celični površini. S to funkcijo so na voljo tudi proliferacija, preživetje, diferenciacija, izločanje in celična migracija ter funkcije, kot so nevronski rastni stožci in fuzija mioblastov kemotropnih celično specifičnih funkcij [12].

Obstaja veliko študij o spremembi izražanja TRPC1 v številnih patoloških stanjih, ki povzročajo ER stres. Sukumaran et al. je pokazalo, da obstaja povezava med stresom ER in izražanjem TRPC1, ki bi lahko spremenila preživetje celic v žlezi slinavki. Izrazili so, da se je izražanje TRPC1 zmanjšalo v pogojih stresa ER in da je bila tudi celična smrt zaradi stresa ER odvisna od izražanja CHOP. Opazili so povečan ER stres in infiltracijo v celicah žlez slinavk TRPC1-/- knock-out miši [16].

Slika 10. TheledvicaStopnje ekspresije beljakovin GRP78, ATF6, TRPC1, IRE1 in PERK ter graf spremembe gub. Povečanje vseh beljakovin je bilo statistično značilno (*p < 0.05),="" opravljen="" je="" bil="" t-test="" neodvisnih="">

Kdajledvicemodelov diabetičnih podgan, so poročali, da se je izražanje mRNA TRPC1 zmanjšalo [31]. Pri bolnikih z diabetično nefropatijo ali diabetičnimi podganami Zucker v primerjavi s kontrolami je zmanjšana ekspresija TRPC1 pokazala, da TRPC1 vpliva na razvoj diabetične nefropatije [32]. TRPC1 ima ključno vlogo pri vzdrževanju ER Ca2 plus homeostaze, zmanjšana funkcija pa vodi do podaljšane aktivacije poti UPR in moti aktivacijo AKT, kar nato vodi do nevrodegeneracije. Zmanjšanje izražanja TRPC1 so opazili pri modelu mišje Parkinsonove bolezni, ki ga povzroča nevrotoksin. Povečano izražanje TRPC1 poveča preživetje nevronov z uravnavanjem poti AKT/mTOR, kljub stresu ER in UPR, ki ga povzroča nevrotoksin [33]. Li et al. poročali, da se je izražanje TRPC1 povečalo tudi pri hipertrofiji kardiomiocitov, ki jo povzroča Namptin, odvisno od časa. Ko je bil gen TRPC1 utišan, je to povzročilo inhibicijo srčne hipertrofije, ki jo povzroča nikotinamid fosforibozil transferaza. Vendar naj bi s prekomerno ekspresijo TRPC1 nikotinamid fosforiboziltransferaza inducirala hipertrofijo kardiomiocitov po poti, ki jo povzroči stres ER. S tega vidika ima lahko utišanje gena TRPC1 zaščitno vlogo pri preprečevanju srčne hipertrofije [34]. V naši študiji sta se znatno povečala tudi ER stres in TRPC1. To nakazuje, da je zadebelitev bazalne kapilarne membrane posledica povečanega stresa ER v ledvičnem tkivu zaradihipertiroidizemje posledica povečanega izražanja TRPC1.

Ta študija ima nekaj omejitev. Namesto podganjega modela hipertiroidizma, povzročenega s tiroksinom, bi lahko uporabili gensko spremenjene miši. Z urinom, zbranim s presnovnimi kletkami, nekateriledvicafunkcijske teste bi lahko izmerili tudi v urinu. Spremembo ravni stresa ER bi lahko raziskali z uporabo inhibitorja TRPC1.

Kot rezultat našega pregleda literature je bil v tej študiji prvič prikazan učinek hipertiroidizma na razmerje med stresom ER in kanalom TRPC1 v ledvičnem tkivu. Ugotovljeno je bilo, dahipertiroidizempovzročil povečanje izražanja TRPC1, ki inducira stres ER. Predlagamo, da je zmanjšanje izražanja TRPC1 lahko potencialna terapevtska strategija za hipertiroidno povzročenoledvicain morda druge poškodbe organov.

Reference

1. Kim D, Kim W, Joo SK, Bae JM, Kim JH et al. Subklinični hipotiroidizem in nizko normalno delovanje ščitnice sta povezana z nealkoholnim steatohepatitisom in fibrozo. Klinična gastroenterologija in hepatologija 2018; 16 (1): 123-131. DOI: 10.1016/j.cgh.2017.08.014

2. Bolkiny Y, Toulson E, El-Atrsh A, Akela M, Farg E. Izvleček korenine Costus ublaži biokemične motnje krvi pri eksperimentalno povzročenih hipo- inhipertiroidizempri miših. Annual Research & Review in Biology 2019; 31 (5): 1-10. DOI: 10.9734/arb/2019/v31i530063

3. Sakr S, Abdel-Ghafar FR, Abo-El-Yazid SM. Selen izboljša s karbimazolom povzročeno hepatotoksičnost in oksidativni stres pri albino podganah. Revija Coastal Life Medicine 2015; 3 (2): 930-936. DOI: 10.1016/j.jtemb.2010.07.002

4. Vargas F, Moreno JM, Rodríguez-Gómez I, Wangensteen R, Osuna A, et al. Vaskularna in ledvična funkcija pri eksperimentalnih motnjah ščitnice. European Journal of Endocrinology 2006; 154 (2): 197-212. DOI: 10.1530/tee.1.02093

5. Rhee CM. Interakcija med ščitnico inledvicabolezen: pregled dokazov. Trenutno mnenje v endokrinologiji 2016; 23 (5): 407-415. DOI: 10.1097/Med.0000000000000275

6. Wijkhuisen A, Djouadi F, Vilar J, Merlet-Benichou C, Bastin J. Ščitnični hormoni uravnavajo razvoj encimov presnove energije v proksimalnem zvitem tubulu podgan. American Journal of Physiology-Ledvična fiziologija 1995; 268 (4): 634-642. DOI: 10.1152/ajprenal.1995.268.4.F634

7. Baum M, Dwarakanath V, Alpern RJ, Moe OW. Učinki ščitničnega hormona na neonatalni ledvični kortikalni Na plus /H plus antiporter. Kidney International 1998; 53 (5): 1254-1258. DOI: 10.1046/j.1523-1755.1998.00879.x

8. Alcalde AI, Sarasa M, Raldúa D, Aramayona J, Morales R et al. Vloga ščitničnega hormona pri uravnavanju ledvičnega transporta fosfatov pri mladih in starih podganah. Endokrinologija 1999; 140 (4): 1544-1551. DOI: 10.1210/endo.140.4.6658

9. Iglesias P, Bajo MA, Selgas R, Díez JJ. Disfunkcija ščitnice in bolezen ledvic: posodobitev. Pregledi v endokrinih in presnovnih motnjah 2017; 18 (1): 131-144. DOI:

10,1007/s 11154-016-9395-710. Selvaraj S, Watt JA, Singh BB. TRPC1 zavira apoptotično celično degeneracijo, ki jo povzroča dopaminergični nevrotoksin MPTP/MPP plus. Cell Calcium 2009; 46 (3): 209-218. DOI: 10.1016/j.ceca.2009.07.008

11. Goda Y, Südhof TC. Regulacija sproščanja nevrotransmiterjev s kalcijem: zanesljivo nezanesljivo? Current Opinion in Cell Biology 1997; 9 (4): 513-518. DOI: 10.1016/s0955-0674(97)80027-0

12. Sukumaran P, Schaar A, Sun Y, Singh BB. Funkcionalna vloga TRP kanalov pri modulaciji ER stresa in avtofagije. Cell Calcium 2016; 60 (2): 123-132. DOI: 10.1016/j.ceca.2016.02.012

13. Goel M, Sinkins WG, Zuo CD, Estacion M, Schilling WP. Identifikacija in lokalizacija kanalov TRPC pri podganahledvica. American Journal of Physiology-Ledvična fiziologija 2006; 290 (5): 1241-1252. DOI: 10.1152/ajprenal.00376.2005

14. Chubanov V, Kubanek S, Fiedler S, Mittermeier L, Gudermann T et al. Ledvične funkcije kanalov TRP v zdravju in bolezni. V: Emir TLR (urednik). Nevrobiologija kanalov TRP. 1. izd. Boca Raton, Florida, ZDA: CRC Press/Taylor & Francis; 2017. str. 187-212.

15. Jeschke MG, Gauglitz GG, Song J, Kulp GA, Finnerty CC et al. Kalcij in ER stres posredujeta jetrni apoptozi po opeklinski poškodbi. Revija za celično in molekularno medicino 2009; 13 (8b): 1857-1865. DOI: 10.1111/j.1582-4934.2009.00644.x

16. Sukumaran P, Sun Y, Zangbede FQ, Nascimento da Conceicao V, Mishra B et al. Izražanje in delovanje TRPC1 zavirata stres ER in celično smrt v celicah žlez slinavk. FASEB BioAdvanc es 2019; 1 (1): 40-50. DOI: 10.1096/fab.1021

17. Zhao Y, Yan Y, Zhao Z, Li S, Yin J. Dinamične spremembe markerjev stresne poti endoplazmatskega retikuluma GRP78 in CHOP v hipokampusu diabetičnih miši. Bilten raziskav možganov 2015; 111: 27-35. DOI: 10.1016/j.brainresbull.2014.12.00618. Araujo A, Schenkel P, Enzveiler A, Fernandes T, Partita W et al. Vloga redoks signalizacije pri hipertrofiji srca, povzročeni z eksperimentomhipertiroidizem. Journal of Molecular Endocrinology 2008; 41 (6): 423-430. DOI: 10.1677/JME-08-002419. Wang Z, do Carmo JM, Aberdein N, Zhou X, Williams JM et al. Sinergistična interakcija hipertenzije in sladkorne bolezni pri spodbujanju poškodbe ledvic in vloga stresa endoplazmatskega retikuluma. Hipertenzija 2017; 69 (5): 879-891. DOI: 10.1161/hipertenzijaha.116.08560

20. Zhang LY, Zhang YQ, Zeng YZ, Zhu JL, Chen H et al. TRPC1 zavira proliferacijo in migracijo raka dojke s pozitivnim estrogenskim receptorjem in daje boljšo prognozo z zaviranjem poti PI3K/AKT. Raziskave in zdravljenje raka dojke 2020; 182 (1): 21-33. DOI: 10.1007/s10549-020-05673-8

21. Aldubayan MA. Proantocianidin iz grozdnih pečk ublaži oksidativni stres in apoptozo, vključeno v jetra hipertiroidnih miši. Letne raziskave in pregled biologije 2019: 1-11. DOI: 10.9734/arb/2019/v33i630138

22. Sonmez E, Bulur O, Ertugrul DT, Sahin K, Beyan E et al.Hipertiroidizemvpliva na delovanje ledvic. Endokrine 2019; 65 (1): 144-148. DOI: 10.1007/s12020-019-01903-2

23. Yan M, Shu S, Guo C, Tang C, Dong Z. Stres endoplazmatskega retikuluma pri ishemičnem in nefrotoksičnem akutnemledvicapoškodba. Annals of Medicine 2018; 50 (5): 381-390. DOI: 10.1080/07853890.2018.1489142

24. Brezprozvanny I, Mattson MP. Napačno ravnanje z nevronskim kalcijem in patogeneza Alzheimerjeve bolezni. Trendi v nevroznanosti 2008; 31 (9): 454-463. DOI: 10.1016/j.tins.2008.06.005

25. Dickhout JG, Carlisle RE, Austin RC. Medsebojna povezava med srčno hipertrofijo, srčnim popuščanjem in kronično ledvično boleznijo: stres endoplazmatskega retikuluma kot mediator patogeneze. Circulation Research 2011; 108 (5): 629-642. DOI: 10.1161/circresaha.110.226803

26. Wu J, Zhang R, Torreggiani M, Ting A, Xiong H et al. Indukcija sladkorne bolezni pri starih miših C57B6 povzroči hudo nefropatijo: povezava z oksidativnim stresom, stresom endoplazmatskega retikuluma in vnetjem. American Journal of Pathology 2010; 176 (5): 2163-2176. DOI: 10.2353/ajpath.2010.090386

27. Cybulsky AV. Stres endoplazmatskega retikuluma pri proteinurični bolezni ledvic.LedvicaMednarodno 2010; 77 (3): 187-193. DOI: 10.1038/ki.2009.389

28. Lorz C, Justo P, Sanz A, Subirá D, Egido J et al. Paracetamolinducirana ledvična tubularna poškodba: vloga ER stresa. Journal of the American Society of Nephrology 2004; 15 (2): 380-389. DOI: 10.1097/01.asn.0000111289.91206.b0

29. Inagi R, Nangaku M, Onogi H, Ueyama H, Kitao Y et al. Vpletenost stresa endoplazmatskega retikuluma (ER) v poškodbo podocitov, ki jo povzroči čezmerno kopičenje beljakovin.LedvicaMednarodno 2005; 68 (6): 2639-2650. DOI: 10.1111/j.1523-1755.2005.00736.x

30. Yoshida H. ER stres in bolezni. Revija FEBS 2007; 274 (3): 630-658. DOI: 10.1111/j.1742-4658.2007.05639.x

31. Nesin V, Tsiokas L. TRPC1. V: Nilius B, Flockerzi V (uredniki). Kationski kanali prehodnega receptorskega potenciala sesalcev (TRP). 24. izd. Berlin, Heidelberg, Nemčija: Springer; 2014. str. 15-51.

32. He F, Peng F, Xia X, Zhao C, Luo Q et al. MiR-135a spodbuja ledvično fibrozo pri diabetični nefropatiji z uravnavanjem TRPC1. Diabetologia 2014; 57 (8): 1726-1736. DOI: 10.1007/s00125-014-3282-0

33. Selvaraj S, Sun Y, Watt JA, Wang S, Lei S et al. Stres ER, ki ga povzroči nevrotoksin, v mišjih dopaminergičnih nevronih vključuje znižanje regulacije TRPC1 in inhibicijo signalizacije AKT/mTOR. Journal of Clinical Investigation 2012; 122 (4): 1354-1367. DOI: 10.1172/JCI61332

34. Li J, Wu W, Zhao M, Liu X. Vpletenost TRPC1 v hipertrofijo kardiomiocitov, ki jo povzroča Nampt, z aktivacijo ER stresa. Celična in molekularna biologija 2017; 63 (4): 33-37. DOI: 10.14715/CMB/2017.63.4.6