Iridoidni in aciklični monoterpenski glikozidi, kankanozidi L, M, N, O in P iz Cistanche Tubulosa

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

Cistanche tubulosa(SCHRENK) R. WIGHT (Orobanchaceae) je trajna parazitska rastlina, ki raste na koreninah vrste Salvadora ali Calotropis, razširjena v Severni Afriki, Arabiji in azijskih državah.1) Stebla te rastline (Kanka-nikujuyou v japonščini) so bila tradicionalno uporablja se za zdravljenje impotence, neplodnosti, lumbaga in telesne oslabelosti ter kot sredstvo za pospeševanje krvnega obtoka.1,2) Med našimi študijami o bioaktivnih sestavinah iz stebel Cistanche tubulosa,3-6) smo že poročali štiriindvajset feniletanoidnih aminoglikozidov, vključno s kankanozidi H1, H2, I, J1, J2, K1 in K2, ter dvema aciliranima oligosugarjema iz svežih stebel Cistanchetubulosa.5,6) Poleg tega glavnifeniletanoidni glikozidi,ehinakozid, akteozid,in izoakteozidso ugotovili, da zavirajo zvišanje ravni serumske aspartat aminotransferaze (sAST) in alanin aminotransferaze (sALT) v poškodovanih jetrih miši, ki ga povzroči D-galaktozamin (D-GalN)/lipopolisaharid v odmerkih 25-100 mg/kg per os ( Pojasnjene so bile tudi strukturne zahteve feniletanoidnih glikozidov za hepatoprotektivno aktivnost.5) V tej nadaljevalni študiji o sestavinah v svežih steblih Cistanchetubulosa smo nadalje izolirali enajst iridoidnih glikozidov, vključno s kankanozidi L (1), M (2), in N (3), sedem acikličnih monoterpenskih glikozidov, vključno s kankanozidi O (4) in P(5), trije fenilpropanoidi in štirje lignani. Ta članek obravnava izolacijo in pojasnitev strukture petih novih spojin (1–5).

Sveža stebla C. tubulosa (gojijo v Urumuqiju, provinca Xin jiang, Kitajska) smo ekstrahirali z metanolom pod povratnim fluksom, da smo dobili metanolni ekstrakt (8,36 odstotka iz svežih stebel). Iz metanolnega ekstrakta smo frakcije, eluirane z H2O in MeOH (5,63 odstotka oziroma 2,73 odstotka), pridobili s kolonsko kromatografijo Diaion HP-20 (H2O→MeOH), kot je opisano prej.5) Frakcijo, eluirano z MeOH, smo podvržen kolonski kromatografiji s SiO2 in ODS ter na koncu HPLC, da dobimo kankanozide L (1, 0.0026 odstotkov), M (2, 0.{{ 27}}001 odstotek ), N (3, 0.00{{60}}7 odstotkov ) , O (4, 0.0{{90}}2{{105}} odstotkov ) in P (5, {{118} }.0002 odstotka ), 6-deoksikatalpol3,7) (6, 0.197 odstotkov ), barciozid3,7) (7, 0.0583 odstotkov), glurozid3,7) (8, 0.0443 odstotkov), kankanoizid A3) (9, 22,3 mg, 0,0010 odstotka), musaenozidna kislina3,7) (10, 0,0056 odstotka ), 8- epiloganska kislina 3,8) (11, 0,0023 odstotka ), 8-epideoksiloganska kislina 3,7) (12, 0,0004 odstotka ), genipozidna kislina 3,7) (13, 0,0040 odstotkov), kankanozid E3) (14, 0,0026 odstotkov), (2E,6Z)-8-b D-glukopiranosiloksi-2,6-dimetil-2,6-oktadienojska kislina3,9) (15, 31,0 mg, 0,0014 odstotka), (2E,6E){{95 }},7-dimetil-8-hidroksioktadien-1-il-ObD-glu kopiranozid10) (16, 0,0082 odstotka ), 8-hidroksigeraniol 8-Ob-D-glukopiranozid11 ) (17, 0,0044 odstotka), betulalbusid A12) (18, 0,0004 odstotka), koniferin13) (19, 0,0002 odstotka), injekcija13) (20, 0,0015 odstotka), sinapski aldehid 4-ObD-glukopiranozid14) (21, 0,0001 odstotka), ()-pinorezinol ObD-glukopiranozid4,8,15) (22, 0,0010 odstotka), eukommin A16) (23, 0,0002 odstotka), izoevkommin A17) (24, 0,0010 odstotka) in ()-syringaresinol ObD- glukopira nosid4,8,18) (25, 0,0044 odstotka).

Cistanche tubulosaizboljša spolno funkcijo

Strukture kankanozidov L (1), M (2) in N (3)

Kankanozid L (1) smo dobili kot bel prah z negativno optično rotacijo ([a]D 26 45,7 v MeOH). Njegov IR spekter je pokazal močan absorpcijski pas pri 3433 in 1{{20}}80 cm 1, kar kaže na glikozidni del. Obstreljevanje s hitrimi atomi (FAB)-MS 1. zagona v načinu s pozitivnimi in negativnimi ioni je pokazalo vrhove kvazimolekularnih ionov pri m/z 371 [M Na] oziroma 347 [MH], molekulska formula pa je bila določena kot C15H24O9 z visokoločljivim merjenjem FAB-MS. Kislinska hidroliza 1 z 1,0 M klorovodikovo kislino (HCl) je sprostila D-glukozo, ki je bila identificirana z analizo HPLC z uporabo optičnega rotacijskega detektorja.3–6) 1H- in 13C-NMR spektra 1 (CD3OD, tabele 1, 2), ki so bili dodeljeni z različnimi poskusi NMR,19) so pokazali signale, ki se lahko označijo za štiri metilene [d 1,43 (1H, br dd, J približno 5, 13 Hz, 4a-H), 1,73 (1H, br dd, J približno 12, 14 Hz, 6a-H), 1,85 (1H, m, 4b-H), 1,93 (1H, br dd, J= približno 8, 14 Hz, 6b-H), 3,50 ( 1H, ddd, J 2,4, 12,5, 13,0 Hz, 3a-H), 3,83 (1H, br dd, J=ca. 5, 13 Hz, 3b-H), 3,78, 4,12 (1H vsak, oba d, J 13,1 Hz, 10-H2)], dva metina [d 2,15 (1H, dd, J 7,2, 8,9 Hz, 9-H) in 2,23 (1H, m, 5- H)] in acetalna skupina [d 4,81 (1H, d, J 8,9 Hz, 1-H)] skupaj z b-glukopiranozilnim delom [d 4,70 (d, J 7,9 Hz, 1 -) H)]. Kot je prikazano na sliki 1, je poskus korelacijske spektroskopije 1 H–1H (1 H–1 H COSY) na 1 pokazal prisotnost delnih struktur, napisanih s krepkimi črtami. V poskusu heteronuklearne korelacije več vezi (HMBC) na 1 so opazili korelacije dolgega dosega med naslednjimi protoni in ogljiki (1-H in 3-C, 8-C; {{ 124}}H in 1-C; 7-H in 8-C, 10-C; 9-H in 8-C; {{131 }}H2 in 7-C, 8-C; 1 -H in 1-C), kot je prikazano na sliki 1. Nato je bila relativna stereostruktura 1 označena s fazno občutljivim jedrskim Eksperiment Overhauserjeve izboljšane spektroskopije (fazno občutljiv NOESY), ki je pokazal korelacije NOE med naslednjimi protonskimi pari (1-H in 3a H; 3a-H in 4a-H; 3b-H in 4b-H; 4b-H in 5-H, 9-H; 5- H in 6b-H, 9-H; 6a-H in 7-H; 7-H in 10-H2), kot je prikazano na sliki 1. 1H- in 13C-NMR spektra 1 sta bila prekrivana s spektri glavne iridoidne sestavine 6-deoksikatalpola (6), razen signalov zaradi do nasičenega d-laktolnega dela. Končno je hidrogenacija 6 dala 1, tako da je bilo pojasnjeno, da je stereostruktura kankanozida L 3,4- dihidro-6-deoksikatalpol (1).

Kankanozid M (2) smo dobili kot bel prah z negativno optično rotacijo ([a]D 26 18,7 v MeOH). IR spekter 2 je pokazal absorpcijske pasove pri 3433, 1736, 1655 in 1076 cm 1, ki jih je mogoče pripisati hidroksilnim, d-laktonskim, olefinskim in etrskim delom. FAB-MS spekter pozitivnih ionov 2 je pokazal kvazimolekularni ionski vrh pri m/z 353 [M Na], molekulska formula pa je bila določena kot C15H22O8 z visokoločljivim FAB-MS merjenjem pozitivnih ionov. Kislinska hidroliza 2 z 1,0 M HCl sprosti D-glukozo. 1H- in 13C NMR spektra 2 (CD3OD, tabeli 1, 2) sta pokazala signale, ki jih je mogoče pripisati štirim metilenom [d 1,66, 2,11 (1H vsak, oba m, 4-H2), 2,15, 2,75 (1H vsak , oba m, 6-H2), 4,29 (1H, ddd, J 2,8, 8,4, 14,3 Hz, 3b-H), 4,32, 4,51 (1H vsak, oba d, J 13,1 Hz, 10- H2), 4,35 (1H, ddd, J 3,1, 6,7, 14,3 Hz, 3a-H)], dva metina [d 2,97 (1H, m, 5-H), 3,82 (1H, br s, {{ 84}}H)], olefin [d 5,94 (1H, m, 7-H)] in nasičena laktonska skupina (d C 174,9) skupaj z bD-glukopiranozilnim delom [d 4,32 (1H, d , J 7,9 Hz, 1 -H)]. Kot je prikazano na sliki 1, je eksperiment 1 H–1H COSY na 2 pokazal prisotnost delnih struktur, napisanih s krepkimi črtami, v poskusu HMBC pa so opazili korelacije dolgega dosega med naslednjima protonskima in ogljikovima paroma ({{105 }}H in 1-C; 7-H in 9-C; 9-H in 1-C, 8-C; {{112} }H2 in 7-C, 8-C, 9-C; 1 -H in 10-C). Relativna stereostruktura 2 je bila označena s fazno občutljivim poskusom NOESY, ki je pokazal korelacije NOE med naslednjimi protonskimi pari (3a-H in 4a-H; 3b-H in 4b-H; 4b-H in 5- H; 5-H in 6b-H, 9-H), kot je prikazano na sliki 1. Tako je bila stereostruktura 2 pojasnjena, kot je prikazano.

Kankanozid N (3) smo izolirali kot bel prah z negativno optično rotacijo ([a]D 25 24,6 v MeOH). V FAB-MS s pozitivnimi ioni 3 so opazili vrh kvazimolekularnega iona pri m/z 371 [M Na]. Molekulsko formulo C16H28O8 smo določili z visokoločljivim merjenjem FAB-MS. Kislinska hidroliza 3 z 1.0 M HCl sprošča D-glukozo. Podatki 1H- in 13C-NMR (CD3OD, tabeli 1, 2) so pokazali signale, ki jih je mogoče pripisati metilu [d 1.07 (3H, d, J 7,2 Hz, 10-H3)] , štirje metileni {d 1,37, 1,87 (1H vsak, oba m, 7-H2), 1,65, 1,81 (1H vsak, oba m, 6-H2), [3,65 (1H, dd, J 9,1) , 9,8 Hz), 3,90 (1H, dd, J 5,9, 9,8 Hz), 11-H2] in [3,70 (1H, dd, J 3,3, 12,0 Hz), 3,88 (1H, m), {{ 71}}H2]}, štirje metini [d 1,69 (1H, m, 4-H), 1,75 (1H, m, 9-H), 2,06 (1H, m, 8- H), 2,16 (1H, m, 5-H)] in hemiacetalno skupino [d 4,67 (1H, d, J 7,4 Hz, 1-H)] skupaj z bD-glukopiranozilnim delom [ d 4,26 (1H, d, J 7,9 Hz, 1-H)]. Iridoidna struktura 3 je bila razjasnjena s poskusi 1 H–1 H COZY in HMBC, relativna stereostruktura pa je bila označena s fazno občutljivim eksperimentom NOESY, kot je prikazano na sliki 1. Posledično je bila sterostruktura 3 pojasnjena, kot je prikazano.

Cistanche tubulosa

Strukture kankanozidov O (4) in P (5)

Kankanozide O (4) in P (5), C16H26O8, prav tako dobimo kot bele prahove z negativnimi optičnimi rotacijami (4: [a]D 23 26,1; 5: [a]D 21 32,7 oba v MeOH). IR spektri 4 in 5 so pokazali absorpcijske pasove pri 3433, 1696, 1647 in 1076 cm 1 za 4 ter pri 3434, 1701, 1647 in 1{{96} }76 cm 1 za 5, ki ga je mogoče pripisati glikozidnim, karboksilnim in olefinskim funkcijam. Njun UV spekter je pokazal skupni absorpcijski maksimum pri 217 nm, kar kaže na prisotnost b-nenasičenega dela karboksilne kisline v obeh. Kislinska hidroliza 4 in 5 je sprostila D-glukozo, medtem ko sta z encimsko hidrolizo z b glukozidazo 4 in 5 dala (2E,6E)-8-hidroksi-2,6-dimetil{{39 }},{{40}}oktadecenska kislina20) (4a) in (2E,6E)-8-hidroksi-3,7- dimetil{{ 48}},6-oktadecenska kislina21) (5a). Podatki 1H- in 13C-NMR za 4 (CD3OD, tabeli 2, 3) so pokazali signale, ki jih je mogoče pripisati dvema metiloma [d 1,71 (3H, br s, 10-H3), 1,81 (3H, d, J 1,0 Hz). , 9-H3)], trije metileni {d 2,19 (2H, br t, J pribl. 7 Hz, 5-H2), 2,36 (2H, m, 4-H2), [ 4,24 (1H, dd, J 7,6, 12,0 Hz), 4,33 (1H, dd, J 6,2, 12,0 Hz), 8-H2]} in dva trisubstituirana olefina [d 5,41 (1H, ddd, J 1,2, 6,2, 7,6 Hz, 7- H), 6,75 (1H, tq, J 7,2, 1,0 Hz, 3-H)] skupaj z bD glukopiranozilnim delom [d 4,34 (d, J 7,8 Hz, 1) -H)]. S primerjavo signalov ogljika v 13C-NMR spektru 4 s signali 4a smo opazili glikozilacijski premik na položaju 8- (d C 4: 65,5; 4a: 59,4). Položaj glukozidne povezave je bil potrjen tudi s poskusi HMBC, kot je prikazano na sliki 2. Posledično je bilo pojasnjeno, da je stereostruktura 4 (2E,6E)-8-bD-glukopiranosiloksi-2,{{ 143}}dimetil-2,6-oktadecenska kislina. Po drugi strani pa podatki 1H- in 13C-NMR za 5 (CD3OD, tabeli 2, 3) kažejo na prisotnost (2E,6E)-8-hidroksi-3,{{158} }dimetil-2,6-oktadecenska kislina [d 1,70 (3H, br s, 10-H3), 2,14 (3H, br s, 9-H3), 2,24 ( 2H, m, 4-H2), 2,27 (2H, m, 5-H2), 4,05, 4,20 (1H vsak, oba br d, J približno 12 Hz, 8-H2) , 5,47 (1H, tq, J 7,1, 0,9 Hz, 6-H), 5,67 (1H, br s, 1-H)] skupaj z bD-glukopiranozilnim delom [d 4,23 (d, J 7,7 Hz, 1 -H)]. Povezljivost bD-glukopiranozilnega dela v 5 je bila pojasnjena na podlagi poskusov HMBC, kot je prikazano na sliki 2. Poleg tega je bil opažen tipičen glikozilacijski premik za signale na položaju 8- (d C 5: 75,6; 5a: 68,8). Na podlagi zgoraj omenjenih dokazov je bilo določeno, da je stereostruktura 5 (2E,6E)-8-bD-glukopiranosiloksi-3,7-dimetil-2,{ {230}}okta dienojska kislina.

Učinki sestavin na citotoksičnost, povzročeno s faktorjem tumorske nekroze-a (TNF-a) v celicah L929

Znano je, da TNF-a posreduje pri različnih poškodbah organov s svojo indukcijo celične apoptoze. V primeru jeter so bili biološki učinki TNF-a vpleteni v jetrno poškodbo, ki jo povzročajo jetrni toksini, ishemija/reperfuzija, virusni hepatitis in alkohol.22-24) Zato se TNF-a šteje za pomembno cilj odkriti protivnetna in hepatoprotektivna sredstva. Na podlagi zgoraj omenjenega koncepta smo raziskali zaščitne sestavine iz naravno prisotnih produktov na celično smrt, ki jo povzroči TNF-a, v celicah L929, celični liniji, občutljivi na TNF-a. 25) Prej smo poročali, da več sestavin iz Piper Chaba, 26–29) Boesenbergia rotunda, 30,31) Punica granatum, 32) Helichrysum arenarium, 33–35) in Sapindus rarak, 36–38), so pokazali zaviralne učinke TNF-a -inducirana citotoksičnost v celicah L929. Ker so feniletanoidne sestavine C. tubulosa (npr. ehinakozid, akteozid in izoakteozid itd.) 5) prav tako zavirale to citotoksičnost, smo dodatno pregledali iridoidne, fenilpropanoidne in lignanske sestavine, kot je prikazano v tabeli 4. Kot rezultat, kankanozid A (9, inhibicija: 16,3 2.0 odstotka pri 100 mM), musaenozidna kislina (10, 44,7 8,7 odstotka ), 8-epiloganska kislina (11, 10,7 0,4 odstotka ), 8-hidroksigeraniol Ugotovljeno je bilo, da 8-ObD-glukopiranozid (17, 21,3 2,4 odstotka) in ( )-pinorezinol ObD-glukopiranozid (22, 22,3 1,6 odstotka) kažeta znatno aktivnost. Čeprav so bile njihove aktivnosti šibkejše od aktivnosti ehinakozida (IC50 31,1 mM), akteozida (17,8 mM) in izoaceteozida (22,7 mM), so glavne sestavine feniletanoida.5)

Eksperimentalno

Za pridobivanje spektralnih in fizikalnih podatkov so bili uporabljeni naslednji instrumenti: specifične rotacije, digitalni polarimeter Horiba SEPA-300 (l 5 cm); UV spektri, Shimadzu UV-1600 spektrometer; IR spektri, Shimadzu FTIR-8100 spektrometer; 1H- in 13C-NMR spektri, spektrometra JEOL JNM-ECA600 (600, 150 MHz) in JEOL JNM-ECS400 (400, 100 HMz) s tetrametilsilanom kot internim standardom; FAB-MS in FAB-MS visoke ločljivosti, masni spektrometer JEOL JMS-SX 102A; Detektor HPLC, lomni količnik Shimadzu RID-10A, Shimadzu SPD-10A UV–VIS in detektorji optične rotacije Shodex OR-2. HPLC kolona, ​​Cosmosil 5C18-MS-II in pNAP (Nacalai Tesque Inc., 250 4,6 mm id) oziroma (250 20 mm id) kolone so bile uporabljene za analitične in preparativne namene.

Za kromatografijo so bili uporabljeni naslednji eksperimentalni pogoji: normalnofazna kolonska kromatografija s silikagelom (CC), silikagel 60N (Kanto Chemical Co., Ltd., 63—210 mreža, sferični, nevtralen); silikagel CC z reverzno fazo, Diaion HP-20 (Nippon Rensui) in Chromatorex ODS DM1020T (Fuji Silysia Chemical, Ltd., 100–200 mesh); normalnofazna TLC, predhodno prevlečene TLC plošče s silikagelom 60F254 (Merck, 0,25 mm); TLC z reverzno fazo, predhodno prevlečene TLC plošče s silikagelom RP-18 F254S (Merck, 0,25 mm); HPTLC z reverzno fazo, predhodno prevlečene plošče TLC s silikagelom RP-18 WF254S (Merck, 0,25 mm), detekcija je bila dosežena z razprševanjem z 1 odstotkom Ce(SO4)2–10 odstotki vodne raztopine H2SO4, čemur je sledilo segrevanje .

Rastlinski material

Ta element je bil opisan v prejšnjem poročilu.

Ekstrakcija in izolacija

Sveža stebla C. tubulosa (2,98 kg) smo drobno narezali in trikrat ekstrahirali z metanolom pod refluksom 3 ure. Uparitev topila pod znižanim tlakom je dala metanolni ekstrakt (249,1 g, 8,36 odstotka). Metanolni ekstrakt smo izpostavili Diaionu HP-20 CC (5.0 kg, H2O→MeOH), da smo dobili frakcije, eluirane s H2O in MeOH (167,84 g, 5,63 odstotka in 81,21 g, 2,73 odstotka, oz.). Z MeOH eluirano frakcijo (61.00 g) smo izpostavili CC normalne faze silikagela [1,8 kg, CHCl3–MeOH–H2O (15 : 3 : 0).4→1{{ 36}} : 3 : 0.5→6 : 4 : 1, v/v/v)→MeOH], da dobimo sedem frakcij [Fr. 1 (1,12 g), 2 (9,56 g), 3 (0,89 g), 4 (10,69 g), 5 (8,84 g), 6 (12,52 g) in 7 (4,6{{104}} g)], kot je bilo opisano prej. 5) Frakcijo 1 (1,12 g) smo ločili s silikagelom CC z reverzno fazo [55 g, MeOH–H2O (4 0 : 60, v/v)→MeOH], da dobimo pet frakcij [Fr. 1-1 (132,8 mg), 1-2 (267.0 mg), 1-3 (182,8 mg), {{80}} (31{{ 156}},9 mg) in 1-5 (91,4 mg)]. Frakcijo 1-1 (132,8 mg) smo nadalje očistili s HPLC [Cosmosil 5C{{9{{160}}}}MS-II, CH3CN–1 odstotek vodne AcOH (1{{166} } : 90, v/v)], da dobimo kankanozid M (2, 2,8 mg, 0.{{203}}{{22{{24{{248 }}}}}}01 odstotek ), barciozid (7, 5,2 mg, 0.0002 odstotka ), sinapinski aldehid {{1{{295 }}6}}O- bD-glukopiranozid (21, 1,4 mg, {{3{{3{{3{{310}}9}}5}}{{320} }}}.0001 odstotek ). Frakcijo 1-2 (267.{{350}} mg) smo nadalje očistili s HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1 odstotek vodne AcOH (7 : 93, v/v)], da dobimo (2E,6E)-3,7-dimetil-8-hidroksioktadien{{13{{360}}}}il-O- bD -glukopiranozid (16, 15,8 mg, {{370}}.{{4{06}}007 odstotkov), 8-hidroksigeraniol 8-ObD glukopiranozid (17, 5,2 mg, 0,0002 odstotka), ( )-pinorezinol ObD-glukopiranozid (22, 22,0 mg, 0,0010 odstotka), eukommin A (23, 5,0 mg, 0,0002 odstotka), izoeu kommin A (24, 21,3 mg, 0,0010 odstotka) in ()-syringaresinol ObD-glukopy ranoside (25, 98,0 mg, 0,0044 odstotka). Frakcijo 2 (9,56 g) ločimo s silikagelom z reverzno fazo CC [400 g, MeOH–H2O (10 : 90, v/v)→MeOH→ aceton], da dobimo pet frakcij [Fr. 2-1 (55,9 mg), 2-2 (4,48 g), 2-3 (3,42 g), 2-4 (1,16 g) in 2-5 (31,9 mg) ], kot je bilo opisano prej.5) Frakcijo 2-2 (500,0 mg) smo izpostavili HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1 odstotek vodne AcOH (5 : 95, v/v). )], da dobimo kankanozid L (1, 6,6 mg, 0,0026 odstotka ) in 6-deoksikatalpol (6, 455,5 mg, 0,182 odstotka ). Frakcijo 2-3 (1,00 g) smo izpostavili HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1 odstotni vodni AcOH (7 : 93, v/v)], da smo dobili sedem frakcij [Fr . 2-3-1 (66,5 mg), 2-3-2 (20,4 mg), 2-3-3 (26,0 mg), 2-3-4 (136,6 mg), 2-3-5 [ 7 (380,6 mg) , 0,0581 odstotka )], 2-3-6 [ glurozid (8, 285,1 mg, 0,0435 odstotka )] in 2-3-7 (84,9 mg)]. Frakcijo 2-3-4 (106,6 mg) smo dodatno očistili s HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN–1 odstotek vodne raztopine AcOH (5 : 95, v/v)], da smo dobili 6 (68,4 mg, 0,0134 odstotka) skupaj s salidrozidom5) (13,7 mg, 0,0027 odstotka). Frakcijo 2-4 (1,16 g) smo izpostavili HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1 odstotek vodnega AcOH (15 : 85, v/v) in Cosmosil pNAP, CH3CN–1 odstotek vodni AcOH (10 : 90 ali 15 : 85, v/v)], da dobimo kankanozide N (3, 15,6 mg, 0,0007 odstotka), O (4, 44,1 mg, 0,0020 odstotka) in P (5, 4,2 mg, 0,0002). odstotkov), 6 (24,0 mg, 0,0011 odstotkov), 8 (17,7 mg, 0,0008 odstotkov), kankanoizid A (9, 22,3 mg, 0,0010 odstotkov), 8-epideoksiloganska kislina (12, 8,1 mg, 0,0004 odstotkov), kankanozid E (14, 58,1 mg, 0,0026 odstotka ), (2E,6Z)-8-bD-glukopi ranosiloksi-2,6-dimetil-2,6-oktadienoična kislina (15, 31,0 mg, 0,0014 odstotka), 16 (168,6 mg, 0,0075 odstotka), 17 (94,3 mg, 0,0042 odstotka), betulalbusid A (18, 8,1 mg, 0,0004 odstotka), koniferin (19, 3,8 mg, 0,0002 odstotka). ) in siringin (20, 33,9 mg, 0,0015 odstotka ). Frakcijo 4 (10,69 g) ločimo s silikagelom CC z reverzno fazo [500 g, MeOH–H2O (30 : 70, v/v)→MeOH→aceton], da dobimo štiri frakcije [Fr. 4-1 (878,2 mg), 4-2 (7,06 g), 4-3 (1,57 g) in 4-4 (792,8 mg)], kot je bilo opisano prej.5) frakcijo 4-1 (500,0 mg) smo očistili s HPLC [Cosmosil 5C18-MS-II, CH3CN–1 odstotek vodne AcOH (10 : 90, v/v)], da smo dobili musaenozidno kislino (10, 39,1 mg, 0,0031 odstotka) in genipozidne kisline (13, 51,2 mg, 0,0040 odstotka). Frakcijo 5 (8,84 g) ločimo s silikagelom CC z reverzno fazo [400 g, MeOH–H2O (20 : 80→30 : 70, v/v)→MeOH→aceton], da dobimo sedem frakcij [Fr. 5-1 ​​(870,2 mg), 5-2 (478,9 mg), 5-3 (3,72 g), 5-4 (979,9 mg), 5-5 (1,19 g), 5-6 (1,27 g) in 5-7 (130,1 mg)], kot je bilo opisano prej. 5) Frakcija 5-1 (870,2 mg) je bila nadalje prečiščena s HPLC [Cosmosil pNAP, CH3CN –1 odstotek vodne raztopine AcOH (5 : 95, v/v)], da dobimo 10 (55,3 mg, 0,0025 odstotka ) in 8-epilogansko kislino (11, 51,5 mg, 0,0023 odstotka).

Kankanoside L (1): bel prah, [a]D 26 45,7 (c 0,48, MeOH). FAB-MS s pozitivnimi ioni visoke ločljivosti: izrač. za C15H24O9Na [M Na] 371,1318; Najdeno 371.1309. IR (KBr, cm 1 ): 3433, 2928, 1080. 1H-NMR (600 MHz, CD3OD) d: podan v tabeli 1. 13C-NMR (150 MHz, CD3OD) d C: podan v tabeli 2. Pozitivna- ion FAB-MS m/z: 371 [M Na] . FAB-MS z negativnimi ioni m/z: 347 [MH].

Kankanozid M (2): bel prah, [a]D 26 18,7 (c 0.11, MeOH). FAB-MS s pozitivnimi ioni visoke ločljivosti: izrač. za C15H22O8Na [M Na] 353,1212; Najdeno 353.1208. IR (KBr, cm 1 ): 3433, 2924, 1736, 1655, 1076. 1H-NMR (600 MHz, CD3OD) d: podan v tabeli 1. 13C-NMR (150 MHz, CD3OD) d C: podan v tabeli 2. FAB-MS s pozitivnimi ioni m/z: 353 [M Na].

Kankanozid N (3): bel prah, [a]D 25 24,6 (c 1.00, MeOH). FAB-MS s pozitivnimi ioni visoke ločljivosti: izrač. za C16H28O8Na [M Na] 371,1682; Najdeno 371.1686. IR (KBr, cm 1 ): 3415, 2874, 1076, 1028. 1H-NMR (600 MHz, CD3OD) d: podan v tabeli 1. 13C-NMR (150 MHz, CD3OD) d C: podan v tabeli 2. FAB-MS s pozitivnimi ioni m/z: 371 [M Na].

Kankanozid O ​​(4): bel prah, [a]D 23 26,1 (c 2,30, MeOH). FAB-MS s pozitivnimi ioni visoke ločljivosti: izrač. za C16H26O8Na [M Na] 369,1525; Najdeno 369.1528. UV [l max (log e), MeOH, nm]: 217 (4,04). IR (KBr, cm 1 ): 3433, 2926, 1696, 1647, 1076. 1H-NMR (600 MHz, CD3OD) d: podan v tabeli 3. 13C-NMR (150 MHz, CD3OD) d C: podan v tabeli 2. FAB-MS s pozitivnimi ioni m/z: 369 [M Na].

Kankanozid P (5): bel prah, [a]D 21 32,7 (c 0,18, MeOH). FAB-MS s pozitivnimi ioni visoke ločljivosti: izrač. za C16H26O8Na [M Na] 369,1525; Najdeno 369.1520. UV [l max (log e), MeOH, nm]: 217 (4,08). IR (KBr, cm 1 ): 3434, 2926, 1701, 1647, 1076. 1H-NMR (600 MHz, CD3OD) d: podan v tabeli 3. 13C-NMR (150 MHz, CD3OD) d C: podan v tabeli 2. FAB-MS s pozitivnimi ioni m/z: 369 [M Na].

Kislinska hidroliza kankanozidov L–P (1–5): Raztopine 1–5 (vsaka 1.0 mg) v 1.0 M HCl (1.0 ml) so bile segrevamo pri 8 0 stopinj 3 ure. Po ohladitvi smo reakcijsko zmes nevtralizirali z Amberlite IRA-400 (OH oblika) in smole odstranili s filtracijo. Po odstranitvi topila pod znižanim tlakom smo ostanek ločili s kolono s kartušo Sep-Pak C18 (H2O→MeOH). Frakcijo, eluirano s H2O, smo podvrgli analizi HPLC pod naslednjimi pogoji: kolona HPLC, Kaseisorb LC NH2-60-5, 4,6 mm id 250 mm (Tokyo Kasei Co., Ltd., Tokio, Japonska); detekcija, optična rotacija [Shodex OR-2 (Showa Denko Co., Ltd., Tokio, Japonska); mobilna faza, CH3CN–H2O (85:15, v/v); 0,8 ml/min]. Identifikacija D-glukoze, prisotne v frakcijah 1–5, eluiranih s H2O, je bila izvedena s primerjavo njihovih retenzijskih časov in optične rotacije z avtentičnim vzorcem [tR 17,9 min (pozitivno)].

Hidrogeniranje {{0}}deoksikatalpola (6) Suspenzija 6 (12.0 mg) in 10 odstotkov paladijevega ogljika (5.0 mg) v MeOH (2,0 ml) mešamo pri sobni temperaturi v atmosferi H2 2 uri. Katalizator odfiltriramo in filtrat kondenziramo pod znižanim tlakom, da dobimo 1 (12,0 mg, kvant.).

Encimska hidroliza kankanozidov O (4) in P (5) z b-glukozidazo Raztopini 4 (8.0 mg) v H2O (1,5 ml) smo dodali b-glukozidazo (4,7 mg, iz mandljev, Oriental Yeast Co., Tokio, Japonska), raztopino pa smo mešali pri 37 stopinjah 24 ur. Reakcijo smo pogasili z dodatkom EtOH (5.0 ml), zmes kondenzirali pod znižanim tlakom. Ostanek smo ekstrahirali z EtOAc in z uparjenjem topila smo dobili (2E,6E)-8-hidroksi-2,{{20}}dimetil-2,{{22} }oktadecenska kislina20) (4a, 3,9 mg, 92 odstotkov). S podobnim postopkom (2E,6E)-8-hidroksi-3,7-dimetil-2,6-oktadecenska kislina21) (5a, 0,9 mg, 94 odstotkov ) je bil pridobljen iz kankanozida P (5, 1,8 mg).

Metoda biološkega preizkusa Inhibitorni učinek na TNF-a-inducirano citotoksičnost v celicah L929 je bil testiran z metodo, opisano v prejšnjem članku.5)

Statistične vrednosti so izražene kot povprečja SEM. Za statistično analizo je bila uporabljena enosmerna analiza variance (ANOVA), ki ji je sledil Dunnettov test. Vrednosti verjetnosti (p), manjše od 0,05, so veljale za pomembne.

zelišče cistanche