Dodatek železa upočasni staranje in podaljša življenjsko dobo celic s krepitvijo mitohondrijske funkcije

Ključne besede:železo;kronološko staranje; podaljšanje življenjske dobe celic; mitohondrije; AMPK; Saccharomyces cerevisiae

Kliknite tukaj, če želite pridobiti informacije o Cistanche za preprečevanje staranja

1. Uvod

Thestaranje prebivalstvadramatično raste po vsem svetu [1–3]. Staranjeje največji dejavnik tveganja za številne kronične bolezni, vključno z rakom, nevrodegeneracijo, srčnimi boleznimi, sladkorno boleznijo, kognitivnimi motnjami in upadom imunskega sistema.4–8]. Postopno zmanjševanje presnovnih funkcij povečuje ranljivost za starostne patologije pri starejši populaciji, kar vpliva na zdravje do konca življenja. Nedavne raziskave na različnih organizmih, od enoceličnih kvasovk do živalskih modelnih sistemov, so pokazale, da mehanizme staranja ohranja in nadzoruje visoko medsebojno povezana in funkcionalno redundantna mreža interakcij med genom in beljakovinami celičnega metabolizma.9–11]. Brsteče kvasovkeSaccharomyces cerevisiaeje močan model organizma za preučevanje biologije staranja, saj je veliko njegovih celičnih procesov pri ljudeh ohranjenih. Kvas ima sledljivo kratko življenjsko dobo in je primeren za visoko zmogljivo presejanje v različnih okoljskih pogojih [9–12]. Kvas se obširno uporablja za preučevanje človeškega replikativnega in kronološkega staranja z analizo njegove replikativne življenjske dobe (RLS) in kronološke življenjske dobe (CLS).13–15]. RLS analizira, kolikokrat se matična celica deli, da tvori hčerinske celice, replikativni človeški model staranja za mitotične celice, kot so matične celice. CLS je čas, v katerem je celica, ki se ne deli, sposobna preživeti v stacionarni fazi, kar je kronološki model človeškega staranja za postmitotične celice, kot so nevroni. Stalna prizadevanja v raziskavah biologije staranja so pokazala, da je odložitev staranja izvedljiva z modulacijo bioloških procesov staranja.11,16]. Trenutno sta najbolj obetavni intervenciji proti staranju zdravila z rapamicinom in metforminom.11,16]. Rapamicin zavira visoko ohranjeno tarčo presnovnega regulatorja protein kinaze rapamicinskega kompleksa 1 (TORC1). Metformin poveča aktivnost protein kinaze, aktivirane z adenozin monofosfatom (AMPK). TORC1 spodbuja celične anabolične procese, kot je sinteza beljakovin, nukleotidov in lipidov [17,18]. Po drugi strani pa TORC1 zavira katabolični proces, vključno z oksidativno fosforilacijo in avtofagijo. Vendar pa ima AMPK nasprotne presnovne funkcije, saj potencira katabolne procese in zavira anabolne procese.19]. V pogojih z omejenim vnosom hranil se AMPK aktivira in zavira TORC1. Posledični presnovni odziv poveča proizvodnjo celične energije z induciranjem katabolnih procesov, ki so usklajeni z zmanjšanjem uporabe ATP v anaboličnih procesih.19–21]. Rapamicin in metformin sta v kliničnih preskušanjih za njuno uporabo kot terapevtika proti staranju.16,22]. Železo je pomembno hranilo in bistveno za skoraj vse organizme, vključno z ljudmi [23–26]. Ima ključno vlogo pri celični presnovi in ​​deluje kot kofaktor za številne encimske reakcije. Ker je celični metabolizem glavni dejavnik staranja in je železo ključnega pomena za številne različne presnovne funkcije, smo raziskali učinek dodajanja železa na staranje. Preučili smo učinek dodajanja železa na CLS kvasovk. Ugotovili smo, da dodajanje železa upočasni staranje in podaljša življenjsko dobo celic. Nadalje smo razkrili, da je mehanizem proti staranju dodajanja železa prek izboljšanja mitohondrijskih funkcij. Ugotovili smo, da dodajanje železa izboljša mitohondrijske funkcije in rešuje kratko življenjsko dobo mutanta AMPK.

2. Materiali in metode

2.1. Sevi kvasovk in izbris genov

PrototrofniSaccharomyces cerevisiaeDivji tip CEN.PK je bil uporabljen v vseh poskusih, da bi se izognili učinkom avksotrofije aminokislin na celično rast in preživetje [27,28]. Genski izločeni sev je bil ustvarjen s homologno rekombinacijo, posredovano s PCR, pri čemer je bil celoten lokus nadomeščen z pomnoženim selekcijskim markerjem, ki je vseboval zgornje in spodnje bočne sekvence ciljnega gena [29]. PCR je potrdil stabilno integracijo pomnoženega selekcijskega markerja.2.2. Sestava medija in kemikalijeBogat medij YPD je vseboval 1 odstotek kvasnega ekstrakta, 2 odstotka peptona in 2 odstotka glukoze, YPD agar (2,5 odstotka Bacto agarja), medij SD pa je vseboval 6,7 g/L kvasne dušikove baze z amonijevim sulfatom brez aminokislin (Difco) in 2 odstotka glukoze. FeSO4.7H2O, FeCl3, CaSO4.2H2O, MgSO4.7H2O, CaCl2.2H2O, MgCl2.6H2O in BPS sta bila kupljena pri Sigmi in njuna osnovna raztopina je bila pripravljena v vodi. Antimicin A (Sigma, St. Louis, MO, ZDA), DiOC6(3) (3,30 -diheksiloksakarbocianin jodid) (Invitrogen™, Waltham, MA, ZDA) in raztopina MitoTracker™ Deep Red Stock (Invitrogen™) je bila pripravljena v dimetil sulfoksidu (Sigma). Končna koncentracija DMSO ni presegla 1 odstotka v nobenem testu.

2.3. Pogoji rasti kvasovk

Divji tip in delecijski sevi so bili pridobljeni iz zamrznjene zaloge glicerola na YPDagar medij pri 30◦C. Celice kvasovk smo gojili v mediju SD čez noč pri 30 °C◦C ztresenje pri 22 0 vrt./min. Celične kulture, ki so zrasle čez noč, smo razredčili na OD600nm~0,2 v svežem mediju SD, da smo sprožili test rasti v 96-plošči z vdolbinicami ali bučki z ali brezkemikalije in inkubirali pri 30◦C. Rast celic (OD600 nm) je bila izmerjena pri različnihčasovne točke z uporabo bralnika mikroplošč ali spektrofotometra.

2.4. Preizkus kronološkega staranja

Kronološko staranje je bilo določeno z merjenjem kronološke življenjske dobe (CLS) celic kvasovk, kot je bilo prej poročano z rahlimi spremembami [30,31]. Poskus CLS je bil izveden na {{0}}plošči z vdolbinicami. Celično kulturo čez noč smo razredčili na OD600nm~0,2 v svežem mediju SD in prenesli v 96-ploščo z vdolbinicami, ki vsebuje različne koncentracije kemikalij, in inkubirali pri 30°C.◦C. Celice smo gojili do stacionarne faze, ki je veljala za 1. dan (100-odstotno preživetje celic) za analizo CLS. Preživetje celic kvasovk je bilo kvantificirano v različnih starostnih časovnih točkah s testom rasti. Kronološko stare celice (3µL) v različnih starostnih časovnih točkah so bile prenesene na drugo 96-ploščo z vdolbinicami. YPD srednji (200µL) smo dodali v 96-ploščo z vdolbinicami in inkubirali 24 ur pri 30◦C. Celično rast smo izmerili z absorbanco (OD600 nm) z uporabo bralnika mikroplošč. Preživetje celic za različne starostne točke je bilo kvantificirano glede na 1. dan (šteje se za 100-odstotno preživetje celic) z uporabo formule za izračun: odstotek preživetja=[izrastek OD600nm (starostna točka)/izrastek OD600nm (1. dan)]× 100 2.5. Test oksidativne odpornostiCelice kvasovk smo gojili do stacionarne faze (72 h) v mediju SD. Po tem smo celice sprali in razredčili na OD600nm~0,2 v mediju YPD z različnimi koncentracijami H2O2 in zrasel pri 30◦C. Odpornost na oksidativni stres je bila analizirana s primerjavo celične rasti celic, obdelanih s H2O2-, in neobdelane kontrole.

2.6. Ekstrakcija RNA, sinteza cDNA in kvantitativno

PCR v realnem časuCelotno RNK smo ekstrahirali iz celic z uporabo mini kompleta RNeasy (Qiagen, Hilden, Nemčija) po proizvajalčevem protokolu za mehanske motnje. Koncentracijo in kakovost RNA smo določili s spektrofotometrom (NanoDrop 2000 Thermo Scientific, Waltham, MA, ZDA). Običajno 1µg skupne RNA smo reverzno prepisali v cDNA z uporabo QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen). Med sintezo cDNA sta bili izvedeni tudi dve negativni kontroli, vključno z brez reverzne transkriptaze in RNA šablone. Vse RT-PCR so bile izvedene v končnem volumnu 20µL, ki vsebuje 20 ng cDNA z uporabo SYBR Fast Universal qPCR Kit (Kapa Biosystems, Boston, MA, ZDA) in analizirano s sistemom Quant Studio 6 Flex (Applied Biosystems, Waltham, MA, ZDA). Pogoj RT-PCR je bil eno zadržanje pri {95◦C, 180 s}, čemur sledi 40 ciklov {95◦C, 1 s} in {60◦C, 20 s} korakov. Po pomnoževanju smo izvedli krivuljo taljenja, da preverimo specifičnost PCR in odsotnost dimerjev primerjev. Kvantitativno številčnost vsakega gena je bila določena glede na gospodinjski zapis ACT1. Relativna genska ekspresija med kontrolnimi in zdravljenimi pogoji je bila izračunana z uporabo 2−∆∆Ctmetoda [32]. Seznam primerjev, uporabljenih za RT-PCR, je na voljo v dodatni tabeli S1.

2.7. Analiza potenciala in strukture mitohondrijske membrane

Kulture kvasovk smo sprali z 1× PBS (fiziološka raztopina s fosfatnim pufrom) in inkubiramoz DiOC6(3) (100 nM) 30 minut v temi. Po inkubaciji celice speremo inponovno suspendiran v 1× PBS. Odčitek fluorescence (vzbujanje pri 482 nm, emisija pri 504 nm)vzorcev je izmeril čitalec mikroplošč. Intenzivnost fluorescence vsakegavzorec je bil normaliziran z OD600nm. Za analizo strukture mitohondrijev so bile celiceoprano z 1× PBS in inkubirali z MitoTracker temno rdečim (100 nM) 30 minut vtemno. Vzorce smo vizualizirali s FL fluorescenčnim mikroskopom pri 100× povečavoslike pa je obdelala programska oprema ImageJ.

2.8. Analiza ATP

150 µL 5 % trikloroocetne kisline in lizirano s steklenimi kroglicami na Precellys® 24 homogenizator(Bertin Technologies, Montiny Le Bretonne, Francija). Raven ATP je bila izmerjena s kompletom reagenta za luciferin/luciferazo Enliten (Promega, Madison, WI, ZDA) v luminometru(Biotek, Winusky, VT, ZDA). Koncentracijo beljakovin smo ocenili z Bradfordovim reagentom(Bio-rad, Hercules, CA, ZDA). Raven ATP v vzorcih je bila normalizirana na skupne beljakovinekoncentracija.

2.9. Statistična analiza

3. Rezultati

3.1. Dodatek železa podaljša življenjsko dobo celic kvasovk

Raziskali smo učinek železovega(II) sulfata (FeSO4) dopolnjevanje kronološke življenjske dobe (CLS) kvasovk v 96-plošči z jamicami. Najprej smo celice inkubirali z različnimi koncentracijami FeSO4 v sintetično definiranem (SD) mediju, rast pa je bila analizirana v različnih časovnih točkah (16 h, 24 h in 48 h). Rast celic je dosegla nasičenost približno 24 ur po inkubaciji s FeSO4 koncentracije (dodatna slika S1a,b). Nato smo določili CLS celic, inkubiranih z različnimi koncentracijami FeSO4. 48-urno celično kulturo stacionarne faze smo upoštevali kot 1. dan za analizo CLS. Sposobnost preživetja starih celic na različnih točkah je bila normalizirana s 1. dnevom (100 odstotkov sposobnih za življenje) in prikazana na grafu preživetja. Ugotovili smo, da različne koncentracije FeSO4 dopolnitev v mediju je podaljšala CLS kvasovk (slike1a in S1c). Testirali smo tudi železov (III) klorid (FeCl3) in našel podoben rezultat kot FeSO4 (Številke1b in S2a). Da bi pojasnili, ali je FeSO4 in FeCl3 soli, njihove sestavine železo(II) in železo(III) ali sulfat in klorid pa razširjajo CLS, smo pregledali druge soli, ki vsebujejo sulfate in kloride. Celice kvasovk smo inkubirali s CaSO4, MgSO4, CaCl2 inMgCl2 vključno z FeSO4, in FeCl3 v mediju SD. Rast celic, inkubiranih z različnimi solmi, je po 24 urah dosegla nasičenost (dodatna slika S2b). Nato smo izmerili preživetje in ugotovili, da razen FeSO4 in FeCl3, druge soli, ki vsebujejo sulfat ali klorid, niso podaljšale življenjske dobe kvasovk (slika1c). Ti rezultati so pokazali, da železo, ne pa sulfat in klorid, podaljša CLS kvasovk. Za nadaljnjo validacijo smo izčrpali železo in analizirali CLS kvasovk. Batophen nantrolindisulfonska kislina (BPS) je specifična kelatorska spojina železa, ki veže železo in vodi do pomanjkanja železa v celicah [33]. Celice kvasovk smo inkubirali z železom in različnimi koncentracijami BPS v mediju SD. Rast celic različnih koncentracij je dosegla nasičenost po 24 urah (dodatna slika S2c). Nadalje smo izmerili preživetje celic in ugotovili, da dodatek BPS skrajša življenjsko dobo celic z dodatkom železa (slika1d). Skupaj so ti rezultati potrdili, da dodajanje železa podaljša življenjsko dobo kvasovk.

Slika 1.Dodatek železa podaljša kronološko življenjsko dobo kvasovk. Prototrofni sev kvasovk je bil inkubiran z različnimi kemijskimi pogoji v sintetično definiranem (SD) mediju in gojen v {{0}}ploščah z jamicami pri 30 ◦C. Za analizo kronološke življenjske dobe (CLS) so bile celice, gojene do stacionarne faze, obravnavane kot 1. dan (100-odstotno preživetje celic). Preživetje celic je bilo kvantificirano v različnih starostnih časovnih točkah s testom rasti. (a) CLS celic, dopolnjenih z različnimi koncentracijami FeSO4. (b) CLS celic, dopolnjenih z različnimi koncentracijami FeSO4 in FeCl3. (c) CLS celic, dopolnjenih s 100 µM FeSO4, FeCl3, CaSO4, MgSO4, CaCl2 in MgCl2. (d) CLS celic, dopolnjenih s 100 µM FeSO4 v prisotnosti različnih koncentracij BPS. Statistično pomembnost (* p < 0,05) smo določili s Studentovim t-testom.