Jasminum Sambac Cell Extract kot antioksidantni spodbujevalec proti staranju kože 1. del

Povzetek: Oksidativni stres ima pomembno vlogo v procesu staranja kože s proizvodnjo reaktivnih kisikovih vrst in nastajanjem naprednih končnih produktov glikacije (AGE). Antioksidativne sestavine so torej potrebne na trgu izdelkov za nego kože in uporaba molekul iz rastlinskih celičnih kultur ponuja edinstveno priložnost. V tem prispevku so bile raziskane značilnosti hidroetanolnega ekstrakta, pridobljenega s celicami Jasminum sambac (JasHEx). Antioksidativne in anti-AGE lastnosti so bile raziskane z multidisciplinarnim pristopom, ki združuje masno spektrometrijo in bioinformatiko in vitro in ex vivo poskusov. JasHEx vsebuje derivate fenolne kisline, lignane in triterpene in ugotovljeno je bilo, da zmanjšuje tvorbo citosolnih reaktivnih kisikovih vrst v keratinocitih, izpostavljenih eksogenemu stresu. Pokazal je tudi sposobnost zmanjšanja tvorbe AGE in povečanja proizvodnje kolagena tipa I v zunajceličnem matriksu. Podatki so pokazali, da so bile antioksidativne lastnosti JasHEx povezane z njegovimi aktivnostmi lovljenja prostih radikalov in keliranja kovin ter aktivacijo poti Nrf2/ARE. To lahko dobro razloži protivnetno aktivnost JasHEx, povezano z znižanjem ravni NO v makrofagih, ki jih stimulira LPS. Tako lahko JasHEx štejemo za močan antioksidativni spodbujevalec proti staranju kože, ki ga povzroča oksidativni stres.

Glikozid cistanche lahko tudi poveča aktivnost SOD v srčnem in jetrnem tkivu ter znatno zmanjša vsebnost lipofuscina in MDA v vsakem tkivu, učinkovito lovi različne reaktivne kisikove radikale (OH-, H₂O₂ itd.) in ščiti pred povzročeno poškodbo DNK z OH-radikali. Feniletanoidni glikozidi Cistanche imajo močno sposobnost lovljenja prostih radikalov, večjo redukcijsko sposobnost kot vitamin C, izboljšajo aktivnost SOD v suspenziji semenčic, zmanjšajo vsebnost MDA in imajo določen zaščitni učinek na delovanje membrane semenčic. Cistanche polisaharidi lahko povečajo aktivnost SOD in GSH-Px v eritrocitih in pljučnem tkivu eksperimentalno starajočih se miši, ki jih povzroča D-galaktoza, pa tudi zmanjšajo vsebnost MDA in kolagena v pljučih in plazmi ter povečajo vsebnost elastina. dober čistilni učinek na DPPH, podaljša čas hipoksije pri starajočih se miših, izboljša aktivnost SOD v serumu in upočasni fiziološko degeneracijo pljuč pri eksperimentalno starajočih se miših. Pri celični morfološki degeneraciji so poskusi pokazali, da ima Cistanche dobro antioksidativno sposobnost in ima potencial, da postane zdravilo za preprečevanje in zdravljenje bolezni staranja kože. Hkrati ima ehinakozid v Cistanche pomembno sposobnost čiščenja prostih radikalov DPPH in lahko lovi reaktivne kisikove vrste, preprečuje razgradnjo kolagena, ki jo povzročijo prosti radikali, in ima tudi dober učinek popravljanja poškodb anionov prostih radikalov timina.

Kliknite na Kje lahko kupim Cistanche

【Za več informacij:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Ključne besede: staranje kože; reaktivne kisikove spojine (ROS); končni produkti napredne glikacije (AGE); Jasminum sambac hidroetanolni ekstrakt (JasHEx); masna spektrometrija; metabolomika; Globalno socialno molekularno mreženje naravnih izdelkov (GNPS); eritroidni 2-jedrski faktor 2 (Nrf2)

1. Uvod

Genetski notranji dejavniki in zunanji dejavniki, kot so ultravijolično obsevanje, infrardeče obsevanje, ksenobiotiki in okoljska onesnaževala, povzročajo nastajanje reaktivnih kisikovih vrst (ROS). Nastanejo z aktivacijo mitohondrijske dihalne verige, citokroma p450 in NADPH oksidaz [1]. ROS vključujejo proste radikale (superoksidni anion, hidroperoksilni radikal, alkoksi radikal in hidroksilni radikal) in neradikalne molekule (vodikov peroksid in singletni kisik) [2]. Ko so antioksidativni sistemi preobremenjeni, se ROS kopičijo v celicah in ustvarjajo tako imenovani oksidativni stres, ki je glavni dejavnik staranja kože [3].

Dejansko oksidativni stres povzroči tako poškodbo DNK kot oksidacijo lipidov in beljakovin skupaj s sprožitvijo poti protein kinaz, aktiviranih z mitogenom (MAPK) (AKT, JNK, ERK in p38) [4]. To pa spodbuja izražanje provnetnih citokinov, rastnih faktorjev in adhezivnih molekul s stimulacijo transkripcijskih faktorjev AP-1 in NF-κB. Poleg tega aktivacija poti MAPK povzroči spremembe dermalne matrice z zmanjšanjem ravni kolagena. Pospešuje razgradnjo kolagena z moduliranjem izražanja matričnih metaloproteinaz (MMP) in njihovih tkivnih zaviralcev TIMP ter zmanjšuje sintezo novega kolagena z blokiranjem receptorja TGF tipa II/signaliziranja Smad. Poleg tega oksidativni stres spremeni stanje kože, tako da prekine epidermalni gradient kalcija, ki je bistvenega pomena za celovitost in delovanje poroženele ovojnice, stimulira delovanje žlez lojnic in povzroči degeneracijo melanocitov [5].

Vzporedno s tem tvorba modificiranih biomolekul, znanih kot končni produkti napredne glikacije (AGE), spodbuja oksidativni stres v celicah in tkivih [6]. Razvoj teh biomarkerjev staranja sprožijo različni okoljski dejavniki, kot so cigaretni dim, visoke ravni rafiniranih in enostavnih diet z ogljikovimi hidrati, hrana, kuhana pri visoki temperaturi, in sedeči življenjski slog; AGE so stabilni in ireverzibilni produkti, ki izhajajo iz neencimske reakcije med reducirajočimi sladkorji in beljakovinami, nukleinskimi kislinami ali lipidi, ki ji sledijo nadaljnje preureditve [7]. Dejansko je izhodišče tvorbe AGE Maillardova reakcija, pri kateri karbonilne skupine reducirajočih sladkorjev reverzibilno reagirajo s prostimi amino skupinami proteinov, nukleinskih kislin ali aminofosfolipidov, da tvorijo Schiffove baze. Ti imini se spontano prerazporedijo v bolj stabilen ketamin, imenovan produkt Amadori. Proizvajajo reaktivne dikarbonile (kot glioksal ali metilglioksal), ki reagirajo s funkcionalnimi skupinami proteinov lizina in arginina, kar daje veliko različnih AGE [8, 9]. Razvrščamo jih v različne skupine glede na njihovo sposobnost oddajanja fluorescence in tvorjenja zamreževanj.

Delovanje AGE posredujejo receptorji za AGE (RAGE), ki so transmembranski proteini, ki pripadajo superdružini imunoglobulinov celičnih površinskih molekul tipa I, izraženih v različnih vrstah celic, vključno s keratinociti, fibroblasti in makrofagi. Vezava AGE/RAGE poveča proizvodnjo ROS predvsem z aktivacijo NADPH oksidaz (NOX) in mitohondrijske dihalne verige, kar vodi do oksidativnega stresa in vseh zgoraj opisanih posledičnih učinkov [6,8].

Poleg tega so proteini zunajceličnega matriksa (ECM), zlasti kolagen, zelo občutljivi na glikacijo. Dejansko so ravni pentozidina strukture AGE, pridobljenega iz kolagena, bistveno višje pri starih kot pri mladih osebah [10]. Glikacija kolagena ne spremeni le mehanskih lastnosti samega kolagena, ki postane trši in bolj krhek [11], temveč tudi lastnosti zunajceličnega matriksa, kar vpliva na obnašanje rezidenčnih celic (rast, diferenciacija, gibljivost, izražanje genov in odziv na citokini) in interakcije matriks–celica [12].

V tem scenariju so antioksidativne sestavine v velikem povpraševanju na kozmetičnem področju za zmanjšanje tvorbe AGE in z njimi povezane oksidativne kaskade: izvlečki, pridobljeni iz vrste Jasminum sambac, ki pripada družini Oleaceae, so zanimivi zaradi svojih antioksidativnih lastnosti in njihove skupne uporabe v ljudski medicini. zdravilo za zdravljenje kožnih bolezni [13]. Vendar pa imajo rastlinski izvlečki več pomanjkljivosti, kot so slaba biološka trajnost, potencialna kontaminacija s pesticidi, gnojili ali patogeni ter spremenljivost njihove kvalitativne in kvantitativne sestave, na katero vplivajo letni časi in okoljski pogoji. Veljavno alternativo rastlinam, kot viru bioaktivnih kozmetičnih sestavin, predstavljajo rastlinske celične kulture, ki ponujajo več prednosti: (i) visoko trajnost proizvodnega procesa, saj niso potrebna kmetijska zemljišča; (ii) stalna dobava naravnih proizvodov brez odvisnosti od geografskega območja, letnega časa in rastlinskega reprodukcijskega cikla; (iii) brez tveganja kontaminacije s patogeni, okoljskimi onesnaževalci in ostanki agrokemikalij; (iv) standardizirani rastni pogoji, ki omogočajo doseganje višjih in bolj ponovljivih stopenj biomase in donosa metabolitov; (v) visoka vsestranskost, saj se lahko koncentracija spojin optimizira s spreminjanjem pogojev gojenja in (vi) lažji in manj zamudni ekstrakcijski protokoli, ki zmanjšujejo potrebo po agresivnih topilih [14,15].

Tu so preučevali hidroetanolni ekstrakt, pridobljen iz celičnih kultur Jasminum sambac (JasHEx). Cilj naše študije je široka kemijska in biološka karakterizacija JasHExa, zlasti raziskovanje njegovih lastnosti proti glikaciji in staranju. Najprej so bili uporabljeni napredni pristopi, ki temeljijo na masni spektrometriji, da bi dobili podrobno strukturno karakterizacijo ekstrakta. Nato so bili izvedeni poskusi in vitro in ex vivo, da bi dokazali biološko aktivnost JasHExa kot antioksidanta.

2. Materiali in metode

2.1. Kulture rastlinskih tkiv in priprava izvlečkov

Certificiran arabski jasmin (Jasminum sambac) je bil pridobljen iz lokalne drevesnice ("Ladre di Piante", Pistoia, regija Toscana, Italija). Listi Jasminum sambac so bili 1 minuto namočeni v 70 odstotnem etanolu (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, ZDA) in površinsko sterilizirani z 1 odstotkom (v/v) komercialnega belila, dopolnjenega s Tween 2{{ 9}} (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, ZDA) 8 minut, čemur so sledila tri izpiranja v sterilni destilirani vodi. Nato smo liste izrezali na kose 0.5–1.0 cm in gojili na gojišču MS polne jakosti [16], ki je vsebovalo 3 odstotke (m/v) saharoze, 0 .2 mg/L 2,4D in 8 g/L fitoagarja. Eksplantate smo tri mesece subkultivirali na svež gojišče. Ko smo pridobili rumeno-zelen, drobljiv in hitro rastoči kalus, smo rastlinske celice prenesli v tekoči MS medij, dopolnjen s 3 odstotki (m/v) saharoze in 0,2 mg/L 2,4D. Suspenzijo smo mešali v krožnem stresalniku pri 110 pm in 27 ◦C v temni klimatski sobi. Temno gojene celice so vsak teden povečevali iz majhnih v velike bučke, dokler niso bile dosežene tekoče suspenzijske kulture približno 177 g/L. Priprava hidro-etanolnega ekstrakta celične kulture Jasminum sambac (JasHEx) je bila izvedena z dodatkom 2000 mL raztopine etanol/voda (90/10, v/v) 500 g celic. Zmes smo homogenizirali 3 minute pri 1500 obratih na minuto in 6 minut pri 3800 obratih na minuto z uporabo nožnega mlina Grindomix GM300 (Retsch GmbH, Haan, Nemčija). Dobljeno suspenzijo smo mešali pri 400 obratih na minuto 2 uri pri 25 ◦C, pri čemer smo se izognili izpostavljanju svetlobi. Suspenzijo smo nato centrifugirali pri 6300 obratih na minuto 10 minut pri 4 ◦C. Supernatant smo odstranili, filtrirali in nato koncentrirali pod vakuumom v rotacijskem uparjalniku (IKA RV8, IKA-Werke GmbH & Co., Staufen, Nemčija), nastavljenem na 25 ◦C. Končno smo pH naravnali na 7,0 z 10 N NaOH in nato liofilizirali, dokler nismo dobili finega prahu.

2.2. Analiza UPLC–MS/MS za kemijsko karakterizacijo JasHEx

Dosežena je bila dvofazna ekstrakcija butanol/voda. Butanolno frakcijo smo posušili in odtalili v metanolu (10 mg/mL) pred analizo UPLC–MS/MS, izvedeno na klasičnem masnem spektrometru Q-Exactive, opremljenem s sistemom UltiMate™ 3000 UPLC (Thermo Scientific, Waltham, MA, ZDA). ). Vsi kromatografski postopki so bili izvedeni, kot so že opisali Ceccacci et al. [17].

2.3. Analize družbenih molekularnih omrežij Global Natural Products

Za identifikacijo metabolitov je bilo uporabljeno socialno molekularno omrežje Global Natural Products [18]. Vsi tisti signali MS in MSMS, ki jih GNPS ni dodelil, so bili pametno pregledani in dodeljeni v skladu z literaturo. Neobdelane datoteke so bile pretvorjene v format mzXML s programsko opremo splošnega uporabniškega vmesnika MS Converter pred iskanjem spektralne knjižnice GNPS. Izvedeno je bilo z uporabo tolerance mase prekurzorja ionov 0.025 Da, tolerance mase fragmentov ionov 0.02 Da, najmanjšega ujemajočega se vrha 2 in praga rezultata 0,7. Rezultati so bili potrjeni ročno.

Predhodno obdelavo podatkov je izvedel Mzmine (različica 2.53, Softpedia, Bukarešta, Romunija) [19] in opravilo FBMN (Feature-Based Molecular Networking) [20], kot so poročali Ceccacci et al. [17]. Pridobljene omrežne datoteke so bile uvožene v Cytoscape (različica 3.9.1, Nacionalni inštitut za splošne medicinske znanosti ZDA (NIGMS), Bethesda, MD, ZDA) [21].

2.4. Kvantitativna analiza lignanov in triterpenov

Iste nastavitve UPLC, navedene za kvalitativne poskuse, so bile uporabljene za kvantitativno analizo lignanov, medtem ko so bile za triterpene izboljšane za ločevanje dveh parov izomerov, arjunolne/azijske kisline in oleanolne/ursolinske kisline. Analiza je bila izvedena na klasičnem masnem spektrometru Q-Exactive, kot je bilo predhodno definirano. Ločitev je bila izvedena s Phenomenex Kinetex (Torrance, CA, ZDA) EVO C18 300 Å (150 × 2,1 mm, velikost delcev 5 µm). Mobilna faza je bila sestavljena iz A (5 mM vodne raztopine amonijevega acetata, pH 9.00, prilagojen z amonijevim hidroksidom) in B (1{{40}}0 odstotkov acetonitrila) z uporabo gradientna elucija 13–28 odstotkov B pri 0–20 minutah, 28–65 odstotkov B pri 20–24 minutah, 65–75 odstotkov B pri 24–28 minutah, 75–95 odstotkov pri 28–28,5 minutah, 95 odstotkov pri 28,5 –32 min, 95–13 odstotkov pri 32–32,1 min in 13 odstotkov pri 32,1–44 min. Hitrost pretoka je bila 0,450 ml/min in volumen injekcije je bil 5 µL. Za lignane in triterpene so bili podatki pridobljeni z masno metodo, ki so jo opisali Ceccacci et al. [17]. Kupili smo nortahelogenin (#LCA52174) pri Biosynth Carbosynth, matairesinol (#80497) in maslinsko kislino (#83209) pri PhytoLab GmbH & Co.KG, sekoizolariciresinol (#60372) in arjunolno kislino (#SMB00119) pri Sigma-Aldrich (Saint Louis). , MI, ZDA), azijsko kislino (#0027), oleanolno kislino (#0041 S) in ursolno kislino (#0037 S) podjetja Extrasynthèse (Genay, Francija). Umeritvene krivulje so bile pridobljene z vbrizgavanjem standardov v koncentraciji od 0,05 do 25 µM za lignane in 0,1 do 25/250 µM za triterpene. Meja detekcije (LOD) in meja kvantifikacije (LOQ) za standarde sta bili določeni na podlagi razmerja signal/šum (S/N).

2.5. Kulture kožnih celic in eksplantati

Imortalizirani človeški keratinociti (HaCaT), kupljeni pri Addexbio Technologies (San Diego, CA, ZDA), so bili shranjeni v Dulbeccovem modificiranem mediju Eagle (DMEM; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, ZDA), ki je bil dopolnjen z 10 odstotki fetalnega govejega seruma. (FBS; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, ZDA) v 95 odstotkih zraka, 5 odstotkih CO2 in navlaženem ozračju pri 37 ◦C. Človeški dermalni fibroblasti (HDF) so bili shranjeni v Dulbeccovem modificiranem mediju Eagle (DMEM; Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, ZDA), dopolnjenem z 10 odstotki fetalnega govejega seruma (FBS; Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, ZDA). ) v 95 odstotkih zraka, 5 odstotkih CO2 in navlaženem ozračju pri 37 ◦C. Kožni eksplantati, pridobljeni iz kože zdravih darovalk (starih 31 in 40 let) v kirurškem centru Villa Cinzia (Neapelj, Italija), so bili gojeni v 24-transwell ploščah v DMEM/FBS plus antibiotiki v pogojih zrak-tekočina pri 37 ◦C v navlaženem zraku s 5 odstotki CO2. Vsi darovalci so dali pisno informirano soglasje za uporabo kožnih tkiv v skladu s Helsinško deklaracijo.

2.6. Citosolni ROS test v celicah HaCaT pod stresom H2O2-

Za ta postopek smo 1,8 × 104 HaCaT zasejali v 96-plošče z vdolbinicami in gojili 20 h. Celice smo nato 2 uri obdelovali z različnimi koncentracijami JasHEx (0.0006 odstotkov, 0,002 odstotkov in 0,006 odstotkov p/v) ali s 500 µM askorbinske kisline, uporabljene kot pozitivna kontrola. Po tem smo jih sprali v PBS (s fosfatnim pufrom) in inkubirali pri 37 ◦C s 100 µL/vdolbino raztopine, ki je vsebovala: 10 mM Hepes, 1,3 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 5 mM glukoze in 5 mM glukoze. µM CM-H2DCFDA (5-(in-6)-klorometil-20,70 -diklorodihidrofluorescein diacetat, Invitrogen). Po 45 minutah je bilo izvedeno pranje s PBS in izmerjena osnovna intenzivnost fluorescence celic pri 535 nm (vzbujanje 485 nm) z uporabo instrumenta EnVision (PerkinElmer, Waltham, MA, ZDA). Nato smo sprožili oksidativni stres z dodatkom 450 µM H2O2 in po 30 minutah izmerili fluorescenco vzorcev.

2.7. Encimski imunosorbentni test (ELISA) za odkrivanje AGE v celicah človeških dermalnih fibroblastov (HDF), obremenjenih z glioksalom

Za ta korak smo 1,5 × 104 HDF zasejali v 96-plošče z vdolbinicami in gojili 2 dni. Po izpiranju s PBS smo celice fiksirali 1{{10}} minuto s 100 µL 4-odstotnega formaldehida v PBS. Nato so jih zdravili z JasHEx (0,0006 odstotka in 0,002 odstotka p/v) ali pozitivno kontrolo 1 µM aminogvanidina v prisotnosti 0,5 odstotka glioksala pri 50 ◦C 1 teden. Po inkubaciji so jih obdelali za encimski imunski test (ELISA) z uporabo specifičnega protitelesa proti AGE (Abcam ab23722).

2.8. Imunohistofluorescenčni test kožnih eksplantatov, obremenjenih z metil-glioksalom, za odkrivanje fibrilina-1

Kožni eksplantati so bili pridobljeni iz dveh bolnikov, starih 31 in 4 0 let. Iz vsake biopsije kože so bili ustvarjeni trije udarci za vsako zdravljenje, ki se je pojavilo na vmesniku zrak-tekočina. Prvi dan smo udarce obdelali z JasHEx (0.002 odstotka in 0,006 odstotka p/v) ali pozitivno kontrolo (1 mM aminogvanidin) in po 24 urah 500 µM metil- je bil dodan glioksal. Zdravljenja so osveževali vsaka dva dni skupno sedem dni. Ob koncu obdobja so bili luknjači obdelani za histološko analizo, fiksirani v 4 odstotkih PFA, inkubirani v 15 odstotkih saharoze, nato v 30 odstotkih saharoze in krio shranjeni v spojini OCT (optimalna temperatura rezanja) pri –80 ◦C . Kriorez 5 µm je bil pridobljen s kriostatom CM1520 Leica (Leica Biosystems, Buffalo, IL, ZDA). Predmetna stekelca s kriosekcijami smo hidrirali 30 minut v PBS in dali v "blokirno" raztopino (6 odstotkov BSA, 5 odstotkov seruma, 20 mM MgCl2, 0,2 odstotka Tween) za 1 uro. Nato so jih inkubirali s primarnim protitelesom proti fibrilinu 1 (MA5-12770, Thermo Scientific, Waltham, MA, ZDA). 16 h pri 4 ◦C. Predmetna stekelca smo 30 minut izpirali s PBS in nato 1 uro inkubirali s sekundarnim protitelesom Alexa-Fluor 546 proti kuncem (A11035, Thermo Scientific, Waltham, MA, ZDA). Jedra smo 10 minut obarvali z DAPI (40, 6-5 diamidino-2-fenilindol) 1 g/mL v PBS. Slike so bile pridobljene s fluorescenčnim mikroskopom in analizirane s programsko opremo ImageJ (različica 1.53a, National Institutes of Health, ZDA).

2.9. AlphaLISA test za merjenje vsebnosti prokolagena tipa I C-peptida (PIP)

V tem koraku je bilo 8 × 103 HDF posejanih v 96-ploščo z vdolbinicami in 24 ur obdelano z JasHEx (0.0006 odstotkov, 0,002 odstotkov, in 0,006 odstotka p/v) ali s TGF- (2,5 ng/mL). Po obdelavi smo celice obdelali v skladu z navodili ponudnika kolagenskega kompleta alfa LISA hPIP (AL353HV, (PerkinElmer, Waltham, MA, ZDA)).

2.10. Test aktivacije transkripcije na osnovi Nrf2 luciferaze

Tu smo zasejali 6 × 103 celic HaCaT v 96-ploščo z vdolbinicami in gojili 16 ur. Po tem so bili podvrženi testu aktivacije transkripcije na osnovi Nrf2 luciferaze z uporabo reporterskega kompleta ARE BPS Bioscience (San Diego, CA, ZDA, #60514). Na transfekcijo pripravljen reporterski vektor ARE luciferaze (ki vsebuje gen za luciferazo kresničke pod nadzorom odzivnih elementov ARE, ki se nahajajo pred minimalnim promotorjem) skupaj z notranjo kontrolo (konstitutivno eksprimirajoči vektor luciferaze Renilla) smo začasno sotransfektirali v celice HaCaT z uporabo X-TREME gen HP DNA transfekcijski reagent (Roche, Basilea, Švica, #6366244001). Po 24-urni transdukciji smo celice 2 uri obdelovali z ekstraktom (0,0006 odstotka, 0,002 odstotka in 0,006 odstotka p/v) ali resveratrolom pozitivne kontrole (50 µM). Po tem so bili podvrženi testu luciferaze s sistemom Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega, Rim, Italija #E2920). Na kratko, celice smo 10 minut inkubirali s substratom luciferaze kresničke, preden smo izmerili luminiscenco v 96-bralniku plošč z jamicami (Victor Nivo, Waltham, MA, ZDA). Razmerje luminiscence kresničke in Renille je bilo izračunano za normalizacijo in primerjavo transkripcijske aktivnosti Nrf2.

2.11. Analiza izražanja genov SOD-1(NM_000454.5) in OH-1(NM_002133.3) v celicah HaCaT

Za ta postopek smo 1,5 × 105 celic HaCaT na vdolbinico gojili v 6-ploščah z vdolbinicami 16 ur in jih inkubirali 6 ur z ekstraktom (0,002 odstotka in 0,006 odstotka p/v) ali 50 µM resveratrola kot pozitivne kontrole. Ob koncu inkubacije smo celotno RNK ekstrahirali s kompletom "GenElute™ Total RNA Purification" (od Sigma-Aldrich (Saint Louis, MI, ZDA) in obdelali z DNazo I (Thermo Scientific, Waltham, MA, ZDA) pri 37. ◦C 30 minut, da odstranimo kontaminant genomske DNA. 500 ng celotne RNA smo retro-transkribirali z uporabo encima reverzne transkriptaze (Thermo Scientific, Waltham, MA, ZDA). Polkvantitativne RT-PCR smo izvedli z uporabo para univerzalnih primerji 18S primer/konkurent (Invitrogen-Thermo Scientific, Waltham, MA, ZDA) kot interni standardi Produkti PCR so bili ločeni na 1,5-odstotnem agaroznem gelu in opazovani z uporabo instrumenta iBright (Invitrogen Thermo Scientific, Waltham, MA, ZDA). Zaporedja primerjev, uporabljenih za pomnoževanje, so bila naslednja: HsSOD1Fw: GAAAGTAATGGACCAGTGAAGG; HsSOD1Rv: ATTGGGCGATCCCAATTACACC; OH-1Fw GAACTTTCAGAAGGGTCAGG; OH-1Rv GCTCAATGTTGAGCAGGAA.

2.12. Test dušikovega oksida v RAW, stimuliranem z LPS 264.7

Koncentracija NO je bila določena v mišjih makrofagih RAW 264.7, zasejanih pri koncentraciji 1,5 × 105 celic/vdolbino v 96-ploščah z vdolbinicami za 24 ur in predhodno obdelanih z ekstraktom ({{1 0}}.0006 odstotkov, 0,002 odstotkov in 0,006 odstotkov p/v) ali z 10 µM TPCK (pozitivna kontrola) 2 uri, pred inkubacijo z 2 µg/mL LPS 18 ur. Količino NO, pretvorjenega v nitrit, smo izračunali z dodatkom Griessovega reagenta (raztopina N-(1-naftil)etilendiamina in sulfanilne kisline, Invitrogen-Thermo Scientific, Waltham, MA, ZDA) in po 30 min. absorbanca je bila izmerjena pri 540 nm z bralnikom plošč z več vdolbinicami (EnVision, PerkinElmer, Waltham, MA, ZDA)

3. Rezultati

3.1. Kvalitativna in kvantitativna analiza hidro-etanolnega ekstrakta celične kulture Jasminum sambac (JasHEx)

Izvedena je bila UPLC-MS/MS analiza JasHEx in spektrometrični podatki visoke ločljivosti so bili analizirani z uporabo Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS), spletnega sistema masne spektrometrije, ki pomaga pri označevanju naravnih izdelkov (NP) [18] . Zlasti je bila izvedena spektralna knjižnica GNPS, da bi dosegli spletno dereplikacijo. Kemijske vrste, ki jih GNPS ni identificiral, so bile dodeljene v skladu z literaturo. Kot je prikazano na slikah 1 in 2 ter v tabeli 1, je bilo identificiranih več kot 50 spojin, ki pripadajo več razredom sekundarnih metabolitov, predvsem polifenolov in terpenov. Dejansko izvleček JasHEx vsebuje derivate fenolne kisline, lignane (secoisolariciresinol, nortrachelogenin in matairesinol) in triterpenoide (arjunolno kislino, asparaginsko kislino, maslinsko kislino, oleanolno kislino in ursolno kislino).

【Za več informacij:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】