študije so pokazale, da ima avtofagija pomembno vlogo pri uravnavanju celičnega odlaganja LD 1. del

Prosim kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza več informacij

POVZETEK

Nastajajoči dokazi kažejo, da lahko nepričakovano odlaganje lipidnih kapljic (LD) in peroksidacija pospešita stres organelov in igrata ključno vlogo pri patogenezi nevrodegenerativnih bolezni (NDD). V naši prejšnji študiji smo potrdili, da je kaempferol (Ka), majhna naravna flavonoidna molekula, pokazala nevroprotektivne učinke na miših s Parkinsonovo boleznijo (PD), ki jo povzroča LPS. Poleg tega so prejšnje študije pokazale, da ima avtofagija pomembno vlogo pri regulaciji celičnega odlaganja LD. V trenutni študiji smo pokazali, da Ka ščiti pred TH plus izgubo nevronov in vedenjskimi pomanjkljivostmi pri MPTP/p-induciranih PD miših, ki ga spremlja zmanjšan lipidni oksidativni stres v substantia nigra pars compacta (SNpc). V gojenih nevronskih celicah je Ka kazal razmeroma varno območje koncentracije in znatno zaviral kopičenje LD in celično apoptozo, inducirano z MPP plus. Nadaljnja študija je pokazala, da je bil zaščitni učinek Ka odvisen od avtofagije, zlasti lipofagije. Kritično je, da je Ka spodbujal avtofagijo za posredovanje razgradnje LD v lizosomih, kar je nato ublažilo odlaganje lipidov in peroksidacijo ter posledično poškodbo mitohondrijev, posledično zmanjšanje nevronske smrti. Poleg tega je knockdown Atg5, posredovan z AAV-shAtg5-, odpravil nevroprotektivne učinke Ka proti oksidaciji lipidov pri miših PD.Cistanche za izboljšanje spominaTo delo dokazuje, da Ka preprečuje dopaminergično nevronsko degeneracijo pri PD z inhibicijo mitohondrijske poškodbe, ki jo povzroča lipidna peroksidacija, s spodbujanjem avtofagije ustnic in zagotavlja potencialno novo terapevtsko strategijo za PD in sorodne NDD.

Za več informacij kliknite tukaj

Uvod

Parkinsonova bolezen (PD) je pogosta nevrodegenerativna bolezen (NDD), za katero je patološko značilna progresivna izguba dopaminergičnih (DA) nevronov v substantia nigra pars compacta (SNpc) [1]. Čeprav natančna etiologija in naravni potek te bolezni še nista povsem razjasnjena, so številni procesi in disfunkcije na sistemski ravni, vključno z mitohondrijskimi funkcijami, homeostazo dopamina, nevrovnetjem in avtofagijo, vpleteni v patogenezo PD [1, 2]. Nedavna poročila so pokazala, da bi lipotoksičnost, povezana z lipidnimi kapljicami (LD), lahko sodelovala pri patologiji PD [3, 4]. LD so zelo dinamični organeli, ki izhajajo iz membrane endoplazmatskega retikuluma (ER) in običajno služijo kot znotrajcelična mesta za shranjevanje nevtralnih lipidov [5]. ]. Nedavno je bilo dokazano, da imajo LD veliko širšo vlogo kot shranjevanje maščobnih kislin (FA) in sodelujejo pri številnih boleznih. (cistanche para que serve) Na primer, mieloidne celice, vključno z makrofagi, levkociti in eozinofili, tvorijo LD kot odziv na vnetje in stres,cistanche v kitajščiniin LD so mesta proizvodnje in shranjevanja vnetnih citokinov ter so nadalje vključeni v predstavitev antigena in očistek patogena [6]. Pomembno je, da je bilo pri aterosklerozi dokazano, da so penaste celice, bogate z LD, škodljive v vseh fazah bolezni [7].

Cistanche lahko izboljša imuniteto

Vendar LD niso bili obsežno raziskani v centralnem živčnem sistemu (CNS), z nekaj članki, ki poročajo o histološki prisotnosti LD v človeškem možganskem tkivu [8, 9]. Kljub temu imajo lahko LD pomembne funkcije v možganih, saj so nedavne študije potrdile, da so agregirani LD v gliji pospešili nevrodegeneracijo v modelu Drosophila [10]. Pred kratkim so poročali, da so pri miših oljno rdeče celice, obremenjene z lipidi, vključno z nevroni, glialnim fibrilarnim kislim proteinom (GFAP) t astrociti in ionizirano adaptersko molekulo, ki veže kalcij-1 (IBA{{7} })t mikroglije, so prisotne v mnogih regijah možganov in dokazano sodelujejo v procesih, povezanih s starostjo [11]. Naše prejšnje delo je pokazalo tudi povečano kopičenje LD v možganih v modelu miši PD [12]. Te študije skupaj kažejo, da so lahko LD vključeni v patogenezo PD, pa tudi drugih NDD.

Običajno se znotrajcelični LD razgradijo v lizosomih in dostavijo FA mitohondrijem za njihovo porabo kot alternativni vir energije v obdobjih pomanjkanja hranil [13]. Vendar imajo nevroni nizko zmogljivost mitohondrijske porabe FA za proizvodnjo energije [14]. Zaradi te lastnosti so nevroni še posebej občutljivi na kopičenje in peroksidacijo LD. Poleg tega kopičenje LD poveča stopnjo oksidacije FA in vztrajno pritiska na mitohondrijsko transportno verigo elektronov, kar poveča proizvodnjo reaktivnih kisikovih vrst (ROS) s kompleksi I in III transportne verige elektronov [15] za povečanje oksidativnega stresa. Preobremenitev z lipidi vodi tudi do proizvodnje ROS iz ekstramitohondrijskih virov, kot so nikotinamid adenin dinukleotid fosfat (NADPH) oksidaze in drugi oksidativni encimi. V kombinaciji z zmanjšano ekspresijo antioksidativnih encimov in nizko zmogljivostjo za porabo FA v nevronih kopičenje LD posreduje pri oksidativnem stresu in lahko dodatno povzroči mitohondrijsko poškodbo, lizosomsko disfunkcijo, okvarjeno avtofagijo in aktivacijo vnetnih odzivov [16,17]. Če nabranih LD ni mogoče zavirati ali odstraniti, so zelo aktivni nevroni podvrženi patofiziologiji, kar povzroči nevrodegeneracijo [17]. (cistanche penis) Dokazi kažejo, da ima katabolični proces, ki ga posreduje lizosom, imenovan avtofagija, ključno vlogo pri vzdrževanju celične homeostaze LD v več tkivih [17,18]. Podrobno,rast penisa cistancheLD se lahko selektivno ločijo v avtofagosomih in dostavijo lizosomom za razgradnjo z lipazami lizosomske kisline, proces, ki je posebej znan kot lipofagija [19]. Zato bi ciljanje na LD in njihovo avtofagično odstranitev lahko predstavljalo nov pristop k obvladovanju nevrodegeneracije.

Preučevanje naravnih proizvodov in prehranskih učinkovin kot virov za možna zdravljenja in strategije NDD je v zadnjih letih pridobilo ogromno zanimanja [20]. Kaempferol (Ka) je naravna polifenolna majhna molekula, ki jo lahko najdemo v številnih kitajskih zdravilnih zeliščih in prehranskih virih [21]. Poročali so, da Ka deluje protibakterijsko, proti staranju in ima imunomodulatorne učinke ter deluje antioksidativno in nevroprotektivno [20, 22, 23]. Prej so poročali, da Ka in vitro zavira vnetje v mikroglijskih celicah BV2 [24] in poveča odpornost nevronov DA na nevrovnetje in vivo [25]. Vendar učinek Kaon LD na PD še ni bil raziskan.

Glede na pomen LD in tesno povezavo med LD, mitohondriji in avtofagijo [16], ki so vsi vključeni v PD, domnevamo, da Ka zavira peroksidacijo LD in preprečuje nevrodegeneracijo DA pri PD. V tej študiji smo dokazali, da Ka znatno ščiti pred nevrodegeneracijo v mišjem modelu PD z zaviranjem kopičenja LD. (cistanche prašek) Nadaljnja študija je pokazala, da je Ka sprožil avtofagijo in zmanjšal kopičenje oksidiranih LD, da bi ublažil mitohondrijsko disfunkcijo in proizvodnjo mitohondrijskih ROS (mtROS), s čimer je preprečil apoptotično smrt nevronov.cistanche propiedadesUgotovitve, pridobljene v tej študiji, lahko pomagajo pri usmerjanju kliničnih odločitev glede uporabe naravne molekule Ka pri NDD, kot je PD.

2. Materiali in metode

2.1. Poskusne živali

Miši C57BL/6J (samci, stari 4- mesec) so bile pridobljene iz Nanjing Medical University Animal Core (Nanjing).cistanche tubulosa beneficiosMiši so vzdrževali in vzrejali v Centru za živalske vire Medicinske fakultete Medicinske univerze v Nanjingu in v objektu za živali v bolnišnici Nanjing Drum Tower. Miši imajo prost dostop do hrane in vode v prostoru s temperaturo okolja 22 stopinj ±2 stopinje in ciklom svetloba/tema 12:12 h. Vsi postopki na živalih so bili izvedeni v strogem skladu s smernicami Nacionalnega inštituta za zdravje Vodnik za nego in uporabo laboratorijskih živali.

2.2.Reagenti

MPTP(M0896),3-MA(M9281),penicillin-streptomycin (V900929), sodium pentobarbital, and probenecid were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Kaempferol (HPLC>95%) for in vivo treatment was purchased from Nanjing Jingzhu Biotechnology Co., Ltd (Nanjing, China), kaempferol (HPLC>99.0 odstotkov, 96.353) za poskuse in vitro je bilo pridobljeno od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ZDA). BODIPY 493/503 (D3922), BODIPY 581/591 C11 (D3861) in DHE (D11347) so bili kupljeni pri Thermo Fisher Scientific. Za poskuse na živalih je bil Ka raztopljen v raztopini 10 odstotkov DMSO v 16 odstotkih SBE- -CD v sterilni fiziološki raztopini. Za celične poskuse smo Ka pripravili v DMSO (Sigma-Aldrich) in PBS (končna koncentracija DMSO je 0,01 odstotka), pH 7,4.

2.3. Indukcija in zdravljenje mišjega modela PD, induciranega z metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridinom (MPTP)

Za ovrednotenje učinkov Ka v modelu PD toksičnosti MPTP/p so miši (samci, stari 4-5 mesecev) naključno razdelili v skupino, zdravljeno s fiziološko raztopino, skupino, zdravljeno z MPTP, skupino, zdravljeno z MPTP in Ka , in Ka samo zdravljena skupina. V skupini, zdravljeni z MPTP, so miši prejemale kronično dajanje MPTP s protokolom, podobnim prej opisanemu [26]: MPTP je bil raztopljen v fiziološki raztopini in injiciran subkutano pri 25 mg/kg, čemur je sledilo 250 mg/kg probenecida (raztopljenega v dimetil sulfoksidu). intraperitonealno (ip) injekcijo v intervalih 1 ure vsake 3,5 dni v obdobju 5 tednov. (korenina cistanche) Kontrolne miši so prejele fiziološko raztopino in injekcijo probenecida. V skupini, zdravljeni z MPTP in Ka, so miši prejemale Ka (50 mg/kg, ena injekcija/dan med poskusi, Jingzhu Biotechnology, Nanjing, Kitajska) intraperitonealno (ip) dnevno 3 dni pred zdravljenjem z MPTP in po 5 MPTP tednov injiciranja. En teden po zadnji injekciji MPTP so miši podvrgli vedenjskemu testiranju, zaslepljene na skupine. Nato so vse miši anestezirali s 40 mg/kg natrijevega pentobarbitala in žrtvovali za odkrivanje možganskih beljakovin in imunohistokemijo ali analizo qPCR.

2.4. Stereotaksična kirurgija in vivo in eksperimentalno zdravljenje

Stereotaksična kirurgija pod anestezijo natrijevega pentobarbitala (40 mg/kg, ip) je bila izvedena, kot je opisano [25]. Mišji Atg5 in kontrolna shRNA sta bili transficirani z vektorji za pakiranje (AAV-U6-CMV-she-NA-EGFP), da se ustvari AAV. Za mikroinjiciranje se anestezirane miši postavijo v stereotaksični aparat. Vbrizgali so jim 1 μL AV s stekleno elektrodo, usmerjeno v DG (AP: -0,3 mm; ML: ±0,13 mm; DV: -0,45 mm） s hitrostjo 0,25 μL/min. Nato smo iglo zadržali še 2- min. 2 tedna po mikroinjiciranju virusa so miši podvrgli MPTP-induciranemu modelu prevajanja in (ali) zdravljenja s Ka.

Atg5 shRNA je bila pridobljena od Hanbio Biotechnology (Shanghai, China) Co., Ltd. Za tišino Atg5 so bili primerji prikazani v dodatni tabeli 1.

2.5. Vedenjska analiza

En teden po končnem injiciranju MPTP ali fiziološke raztopine sta bila izvedena rotacijski test in test s palico, kot je opisano prej [27]. Za preskus z rotacijsko palico so miši aklimatizirali na rotacijsko palico v dveh poskusih (6 min s pospešeno hitrostjo 12-20 vrt/min) na dan 2 zaporedna dneva pred začetkom poskusa. Nato smo miši testirali pri 20 obratih na minuto 300 s druge 3 zaporedne dni. Zakasnitev do padca je bila zabeležena s sistemom Rotarod Analysis System (Jiliang, Šanghaj, Kitajska). Za preskus s drogom smo miši postavili z glavo navzgor na vrh navpičnega lesenega droga (hrapave površine, višine 50 cm, premera 1 cm). Vse miši smo na aparat navadili 2 dni pred testiranjem in jih nato tretji dan testirali trikrat. Zabeležen je bil skupni čas (T-total, dokler miška s svojimi štirimi tačkami ne doseže tal) in čas obračanja (T-turn, da se miška popolnoma obrne z glavo navzdol). Poskus je bil slep za skupine miši za vsak vedenjski test in test je bil izveden trikrat.

2.6. Zbiranje vzorcev možganov

Po končnih vedenjskih testih smo miši anestezirali z natrijevim pentobarbitalom (40 mg/kg, ip). Za analizo qPCR, western blotting in tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC) so iz živali hitro ekstrahirali celotne možgane, nato pa so bila tkiva srednjih možganov in striatuma hitro razrezana, predhodno zamrznjena s tekočim dušikom. Vsi vzorci so bili do analize shranjeni pri -80 stopinjah.

Za imunohistokemično analizo smo miši perfundirali transkardialno s 4 odstotki paraformaldehida (PFA). Možgani so bili ekstrahirani, naknadno fiksirani, dehidrirani, vdelani v OCT (Tissue-Tek) in serijski deli možganov so bili kriosekcionirani （30 μm na rezino） skozi vsak celoten stratum in srednje možgane z uporabo zamrzovalnega mikrotoma (Leica CM1950, Nussloch, Nemčija). ). Vsi odseki so bili zbrani v šestih ločenih serijah, rezine možganov pa shranjene v 50-odstotnem glicerinu in do analize zamrznjene na -20 stopinjah.

Za TEM smo miši perfundirali z 2,5 odstotka glutaraldehida in 2 odstotka paraformaldehida, kot je opisano 【12】. Majhna porcija (<1 mm³）="" of="" the="" mesencephalon="" was="" carefully="" sectioned="" and="" incubated="" in="" the="" same="" fixative="" for="" 2="" h="" at="" 4="" ℃.="" specimens="" were="" postfixed="" in="" 1%="" osmium="" tetroxide,="" stained="" in="" aqueous="" uranyl="" acetate,="" and="" then="" dehydrated="" and="" embedded="" in="" epoxy="" resin.="" ultrathin="" sections="" were="" stained="" using="" lead="" citrate="" and="" examined="" with="" a="" transmission="" electron="" microscope(jem-1010,="" tokyo,="">

2.6. Imunohistokemijska analiza

Rezine možganov smo splaknili v PBS, čemur je sledila 3-odstotna H2O2 10 min, nato pa 1 uro inkubirali s 0.3-odstotnim Tritonom X-100 v PBS, dopolnjenem s 5-odstotnim BSA. Nato stekelca čez noč inkubiramo s primarnimi protitelesi pri 4 stopinjah v PBS, ki vsebuje 5 odstotkov BSA pri 4 stopinjah, nato speremo in inkubiramo v sekundarnih protitelesih 1 uro pri sobni temperaturi, čemur sledi inkubacija z diaminobenzidinom (DAB) ali namestitev v DAPI (Life Technologies, Cat P36931) kot imunofluorescentno barvanje 5 minut. Za barvanje po Nisslu smo stekelca združili v raztopini krezil vijolične (CV) (0,1 g krezil vijolične, 99 ml H20 in 1 ml 1 % ocetne kisline) 30 minut pri sobni temperaturi, nato pa dehidrirali z alkoholom in ksilenom. Slike smo opazovali in fotografije posneli pod mikroskopom Olympus BX52 (Olympus America Inc., Melville, NY, Združene države). Skupno število TH-pozitivnih in Nisslovih-pozitivnih nevronov v SNpc je bilo pridobljeno serološko z uporabo metode optičnega frakcionarja s programsko opremo MicroBrightField Stereo-Investigator (MicroBrightField, Williston, VT, ZDA).

2.7 Analiza s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC).

Miši striatni vzorci so bili homogenizirani z {{0}}.1 M perklorovo kislino （1 mg tkiva v 100μL perklorove kisline） in 0,1 mM EDTA, obdelani z ultrazvokom in centrifugirali pri 20,000 rpm 30 minut, kot je navedeno [27]. Nato so bile za merjenje zbrane supernatantne tekočine. Mobilna faza je mešana raztopina, sestavljena iz 90 mM monobazičnega natrijevega fosfata, 1,7 mM 1-oktansulfonske kisline, 50 mM citrata, 50 uM EDTA, 10 odstotkov acetonitrila s pretokom 0,2 ml/min. Vzporedno smo za izračun kvantitativne standardne krivulje pripravili osnovno standardno raztopino za dopamin in dihidroksi-fenil ocetno kislino (DOPAC) (Sigma-Aldrich, ZDA) v 0,1 M HClO4. Vbrizgali smo količino 10 ul pripravljenega supernatanta ali standardne raztopine. v mobilno fazo in testiran z elektrokemičnim detektorjem ESA Coulochem III (Coulochem III, Thermo Fisher Scientific). Vzorci so bili izmerjeni in vrhovi so bili kvantificirani. Koncentracije monoaminov so bile kvantificirane s primerjavo s standardom z uporabo programske opreme ClarityChrom (Knauer, Nemčija) in nato vsebina v stratumu je bila pretvorjena v skladu z razmerjem redčenja Standardna krivulja DA in DOPAC je bila prikazana na dodatni sliki 1a in b.

2.8. Celične kulture in zdravljenje

Kulture mezencefalnih primarnih nevronov so bile izvedene, kot je opisano prej [12]. Na kratko, mezencefalna tkiva miši C57BL/6 na embrionalni dan 14/15 (E14/15) so bila previdno odstranjena, mehansko disociirana, da so odstranili membrane in velike krvne žile, in nato secirali. Nato smo jih prebavili s tripsinom-EDTA (Amresco, Solon, OH, ZDA) in nato filtrirali skozi 100-um filter, da smo dobili enocelično suspenzijo. Nato smo celice nanesli na s poli-L-lizinom predhodno prevlečene 12-/24-plošče z vdolbinicami pri 2,5 × 10 stopinj celic/ml, ki je vseboval Neurobasal medij (Cat 21103049, GibcoTM , Thermo Fisher Scientific, Rockford, ZDA), dopolnjen z B27 (2 odstotka v:v, Cat 1750404, GibcoTM) in penicilinom/streptomicinom (0,5 odstotka v:v). Kulture so bile vzdrževane v vlažni komori (37 stopinj, 5 odstotkov CO2 inkubator). Gojišče smo zamenjali vsake 3 dni in celice lahko uporabimo na 7-10 dni.

Celične linije: celične linije SH-SY5Y so gojili v 10 odstotkih FBS in 1 odstotku penicilina/streptomicina v vlažnem inkubatorju pri 37 stopinjah in 5 odstotkih CO2. V poskusih so bile celice SH-SY5Y obdelane z MPP plus （200 μM） ali različnimi odmerki Ka (0,3,30,60,100,300,600 uM) 24 ur. Ka(3,10, 30,60 μM, 3h）primed-SH- Celice SY5Y smo 24 h stimulirali z MPPt（400 μM） Ka（30 μM, 3h）z (ali brez)3-MA（3 mM, 1 h） ali -tokoferolom（50 μM, 1 h, Sigma-Aldrich, 47783 ）primirane celice SH-SH5Y so bile 24 ur stimulirane z MPPT（200 μM）.

2.9. Test preživetja celic CCK8

Spremenjeno sposobnost preživetja celic pri zdravljenju s Ka je zaznal komplet za štetje celic-8 (CCK-8 Kit, Selleck, Houston, TX, ZDA). Na kratko, celice SHSY5Y so bile zasejane v 96- ploščo z vdolbinicami in nato 24 ur obdelamo z različnimi koncentracijami Ka（3,30,60,100,300,600,600 uM）. Nato smo v vsako vdolbino za 4 ure dodali 10 ul reagenta CCK-8. Končno je bila absorbanca zaznana z Multiskan Spectrum (Thermo Fisher Scientific) pri 450 nm.

2.10. test ATP

Celične ravni ATP so bile odkrite z ATP Bioluminescence Assay Kit (Beyotime Biotechnology Co., Kitajska) v skladu z navodili proizvajalca. Po obdelavi smo celice lizirali in centrifugirali pri 12,000 obratih na minuto 5 minut pri 4 stopinjah in zbrali supernatante. Delovno raztopino （100 μL） smo dodali 20 μL vzorca v 96-plošči z vdolbinicami in luminiscenco takoj izmerili na avtomatiziranem bralniku mikroplošč. Meritve vseh vzorcev so bile normalizirane na koncentracijo beljakovin.

2.11. Test Na plus -K plus -ATPaze

Za merjenje Nat-K plus -ATPaze (A070-2-2, Jiancheng, Nanjing, Kitajska) smo celice obdelali z ultrazvokom in centrifugirali pri 600 obratih na minuto 10 minut, da smo pridobili supernatant. Dodali smo reakcijske raztopine detekcije Nat-Kt-ATPaze in jih inkubirali po navodilih proizvajalca. Nato smo zaznali absorbanco pri 660 nm. Meritve vseh vzorcev so bile normalizirane na koncentracijo beljakovin.

2.12. Western blotting analiza

Celice ali možganska tkiva so bila lizirana v pufru RIPA (50 mM Tris (pH 7,4),cistanche คือ150 mM NaCl, 1 odstotek NP-40 (FNN0021, Thermo), 0,5 odstotka natrijevega deoksiholata (D6750, Sigma), 0,1 odstotka SDS (74255, Sigma), dopolnjeno s proteazo in zaviralci fosfataze (Roche, Šanghaj, Kitajska). Koncentracije beljakovin so bile določene s kompletom Micro BCA Kit （Beyotime, Šanghaj, Kitajska）. 30-ug protein vsakega vzorca je bil ločen s SDS-PAGE z uporabo poliakrilamidnih TGX gelov (Bio-Rad, Hercules, Kalifornija, ZDA) in nato prenesen na membrane iz poliviniliden difluorida (PVDF) (Millipore, Bedford, MA). Po blokiranju so bile PVDF membrane inkubirane z različnimi specifičnimi primarnimi protitelesi v TBST pri 4 stopinjah čez noč, nato pa sprane in inkubirane v ustreznih sekundarnih protitelesih, konjugiranih s hrenovo peroksidazo (HRP), 1 uro pri sobni temperaturi. Imunoreaktivne pasove smo vizualizirali in zaznali z izboljšano kemiluminiscenco (ECL) in detekcijskim reagentom (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) in analizirali z uporabo slikovnega sistema ImageQuantTM LAS 4000 (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, ZDA).

2.13. Kvantitativna (Q) in reverzna transkripcija (RT) PCR v realnem času

Celotno RNA smo ekstrahirali iz možganskih tkiv in kultiviranih celic z uporabo reagenta Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA). Reverzna transkripcija je bila izvedena z uporabo reagentnega kompleta TAKARA PrimeScript RT (TaKaRa, Japonska). qPCR v realnem času je bil izveden z uporabo SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) v instrumentu StepOnePlus (Applied Bio-systems). Primerke je kupil in validiral General (Šanghaj, Kitajska). Primerji, uporabljeni za qPCR, so bili prikazani v dodatni tabeli 2.

Ta članek je izvleček iz Redox Biology 41 (2021) 101911