Karnovskyjev fiksativ preprečuje artefakte, ki se pojavijo kot vakuolizacija, ki izhaja iz predelave tkiva v ledvicah, zdravljenih s protismiselnim oligonukleotidom Ⅰ

Povzetek: Protismiselni oligonukleotid(ASO) so bile opredeljene kot nov način zdravljenja zaneozdravljive bolezni. notriledvic, zdravljenih z ASO, v proksimalnih tubulih pogosto opazimo vakuole, poleg bazofilnih granul. Nekatera poročila opisujejo, da so te vakuole verjetno sekundarni pojav, ki izhaja izekstrakcija ASOmed obdelavo tkiva. V tej študiji smo primerjali ledvično morfologijo po fiksaciji s fiksativom po Karnovskyju ali 4% paraformaldehid fosfatnim pufrom (PFA) z 10% nevtralno pufrirano raztopino formaldehida (NBF). Pregledali so podganje samice Sprague-Dawley, štirikrat intravensko zdravljene s 50 mg/kg protismiselnih oligonukleotidov, ki vsebujejo protismiselne oligonukleotide (LNA-ASO), 1 ali 2 tedna. Mikroskopsko so opazili vakuole in bazofilne granule v proksimalnih tubulih v ledvicah, fiksiranih z NBF. Bazofilna zrnca kažejo na kopičenje ASO. Poleg tega so nekatere vakuole vsebovale tudi šibka bazofilna zrnca, kar kaže, da so bile vakuole pomembne za kopičenje ASO. Čeprav so opazili zmerno vakuolacijo v proksimalnih tubulih, je bila večina vakuoliranih epitelijev negativna na molekulo poškodbe ledvic-1 pri imunohistokemičnem barvanju. V vzorcih, izpostavljenih fiksaciji po Karnovskem, niso opazili vakuol v proksimalnih tubulih, čeprav so opazili bazofilna zrnca. V vzorcih, izpostavljenih fiksaciji s PFA, so opazili vakuole in bazofilne granule v proksimalnih tubulih, podobne tistim v vzorcih, izpostavljenih fiksaciji z NBF. Na splošno so naše ugotovitve pokazale možnost precenjevanja vakuolizacije zaradi artefaktov med obdelavo tkiva pri uporabi običajne fiksacije NBF. Fiksativ Karnovskega velja za uporabno alternativo za razlikovanje umetnih vakuol od prave nefrotoksičnosti. (DOI: 10.1293/tox.2021-0007; J Toxicol Pathol 2021; 34: 367–371)

Ključne besede:protismiselni oligonukleotid, artefakt,Fiksativ Karnovskega, vakuolacija, bazofilna zrnca, ledvica

Cistanche Dodatek za podporo ledvične funkcije PhGs75% Ech 30% Act 12%

V zadnjem času so bile terapije s protismiselnimi oligonukleotidi (ASO) uveljavljene kot nove modalitete za zdravljenje nerešljivih bolezni1, 2. ASO so kratki, sintetični, enoverižni oligodeoksinukleotidi, ki se vežejo na ribonukleinsko kislino in zavirajo izražanje genov3.

Toksikološko so toksičnosti, ki jih povzroči ASO, razvrščene v toksičnosti, odvisne od hibridizacije, ki so povezane z zaporedjem ASO, in toksičnosti, neodvisne od hibridizacije, ki so povezane s kemično modifikacijo. Toksičnost, neodvisno od hibridizacije, povzročajo trije glavni mehanizmi: 1) kopičenje ASO, 2) provnetni učinki in 3) učinki vezave aptamerov4. Akumulacijo ASO opazimo predvsem v jetrih in ledvicah, prekomerno kopičenje pa vodi v disfunkcijo teh organov5. Provnetni učinek je induciran s stimulacijo prirojenega imunskega sistema prek vezave na Tollu podobne receptorje pri glodavcih in opicah ali aktivacije alternativne poti komplementa prek zaviranja faktorja H z ASO pri opicah6. Aptamerni vezavni učinek inducira aktivacijo trombocitov in agregacijo/trombocitopenijo, da se veže za trombocite specifičen receptor7. Poleg tega se aptamerna vezava na znotrajcelične beljakovine v hepatocitih šteje za enega od vzrokov za hepatotoksičnost8–10. Za odkrivanje teh toksičnosti so raziskovalci razvili več nekliničnih testov; med temi je histopatološki pregled eden najbolj občutljivih testov za odkrivanje kopičenja ASO.

Histopatološko kopičenje ASO običajno opazimo kot bazofilna zrnca v citoplazmi Kupfferjevih celic v jetrih ali proksimalnih tubulih ledvic. Izrazito kopičenje bazofilnih zrnc je povezano s povečano incidenco ali resnostjo degenerativnih sprememb, ki jih običajno opazimo kot vakuolacijo ali degeneracijo/nekrozo proksimalnega tubularnega epitelija v ledvicah4. Bazofilna zrnca sama po sebi niso toksikološko pomembna11; zato je razlikovanje kopičenja bazofilnih zrnc od degenerativnih sprememb pomembno za ocenjevanje toksičnosti, povezane z ASO.

Vakuole, ki jih pogosto opazimo v proksimalnih tubulih ledvic opic cynomolgus, zdravljenih z ASO, vsebujejo bazofilni material in imajo enako splošno porazdelitev v celicah kot bazofilna zrnca11, 12. Nekaj ​​poročil kaže, da lahko proces fiksacije vpliva na pojav kopičenja ASO v fagolizosomskem kompartmentu5, 11. Poleg tega sta Henry et al. in Engelhardt sta opisala, da so vakuole v proksimalnih tubulih verjetno sekundarni pojav, ki je posledica ekstrakcije ASO med predelavo, ker vakuole niso prisotne v perfuzijsko fiksiranih ledvicah s paraformaldehidom/glutaraldehidom5, 11. Vakuole v proksimalnih tubulih opic cynomolgus, zdravljenih z z mipomersenom so domnevali, da se pojavijo med postopkom fiksacije13.

Čeprav je lahko vakuolizacija zaradi zdravljenja z ASO v nekaterih primerih artefakt, ta hipoteza ni bila jasno dokazana in nobeno poročilo ni opredelilo ustrezne metode fiksacije za toksikološko oceno. V skladu s tem smo v tej študiji primerjali morfologijo ledvic po fiksaciji s fiksativom po Karnovskyju ali 4% paraformaldehid fosfatnim pufrom (PFA) z 10% nevtralno pufrirano raztopino formaldehida (NBF). Poleg tega smo dokazali uporabnost fiksativa Karnovskega kot alternativnega fiksativa za preprečevanje vakuolacije, ki izhaja iz artefaktov.

Štiri tedne stare samice podgan Sprague-Dawley so bile kupljene pri Charles River Laboratories Japan Inc. (Kanagawa, Japonska) in aklimatizirane na laboratorijske pogoje. Živali so vzdrževali v nadzorovanih pogojih (12--urni cikel svetloba/tema, temperatura 23 ± 2 stopinji, relativna vlažnost 50 ± 25 %) in jim je bil omogočen prost dostop do standardne komercialne prehrane (avtoklaviranega CR-LPF; Oriental Yeast Co., Ltd., Tokio, Japonska) in vodo iz pipe. Dvajset živali je bilo razporejenih v naslednje štiri skupine (vsaka s petimi živalmi): 1-skupina, ki je bila teden dni zdravljena s fiziološko raztopino (kontrola- 1W), 2-skupina, ki je bila teden dni zdravljena s fiziološko raztopino (kontrola{ {14}}W), 1-tedensko zaklenjeno nukleinsko kislino, ki vsebuje protismiselni oligonukleotid (LNA-ASO), obdelano skupino (ASO-1W), in 2-tedensko obdelano skupino LNA ASO (ASO-2W). Živali so bile ob začetku dajanja 50 mg/kg LNA-ASO stare 5 tednov. LNA-ASO je bil apliciran intravensko štirikrat skupaj po naslednjem režimu: 1., 4., 8. in 11. dan v skupini ASO-2W; in 1., 2., 3. in 4. dan v skupini ASO-1W. Živali v skupinah Control-1W in ASO-1W so bile žrtvovane 7. dan. Živali v skupinah Control-2W in ASO-2W so bile žrtvovane na dan 14. Pri vsaki terminalni nekropsiji so bili odvzeti vzorci krvi za klinično patologijo iz abdominalne votle vene pod globoko anestezijo z izofluranom. Po odvzemu krvi so vse podgane evtanazirali z izkrvavitvijo s takojšnjim prerezom trebušne aorte. Zunanjo površino telesa, prsno in trebušno votlino ter notranje organe smo makroskopsko pregledali, leve ledvice pa smo odstranili in jih obdelali za mikroskopski pregled. Vsi postopki so bili izvedeni v skladu s Pravilnikom o krmljenju in shranjevanju poskusnih živali in poskusov na živalih Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation.

Vzorce seruma smo pridobili s centrifugiranjem vzorcev krvi pri 4 stopinjah. Biokemijsko analizo seruma smo izvedli z instrumentom TBA-2000FR (Canon Medical Systems Corporation, Tochigi, Japonska) za oceno ravni dušika sečnine v krvi (BUN) in kreatinina (CRE).

Ledvice so bile fiksirane z uporabo treh fiksativnih raztopin, kot sledi: po razdelitvi ledvice prečno na tri segmente, srednji del, vključno z ledvičnim pelvisom, je bil fiksiran v 10% NBF za 5 dni; kranialni del je bil fiksiran v fiksativu Karnovsky (Muto Pure Chemicals Co., Ltd., Tokio, Japonska); in repni del je bil fiksiran v 4% PFA za 17 ur pri 4 stopinjah in nato postavljen v 10% NBF za 24 ur. Vsak fiksni vzorec je bil dehidriran in vstavljen v parafin. Odrezke tkiv smo pripravili za barvanje s hematoksilinom in eozinom (H&E). Imunohistokemično obarvanje je bilo izvedeno z uporabo protiteles, ki ciljajo na molekulo poškodbe ledvic-1 (KIM-1; R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, ZDA; razredčitev 1:300) in z lizosomom povezanim membranskim proteinom 2 (LAMP{{ 13}}; Waltham, MA, ZDA; razredčitev 1:1000) po pridobitvi antigena (citratni pufer, pH 6,0, segrevan 10 minut ali 20 minut). Histofine Simple Stain Rat MAX PO (Nichirei Biosciences Inc., Tokio, Japonska) je bilo uporabljeno kot sekundarno protitelo.

Podporna služba Wecistanche:

E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/telefon:+86 15292862950

Nakupujte za več podrobnosti o specifikacijah:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop