Ledvična os hepcidin/feroportin nadzoruje reabsorpcijo železa in določa obseg ledvic in sistemske preobremenitve z železom

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Goran Mohammad1, Athena Matakidou2, Peter A. Robbins1 in Samira Lakhal-Littleton1

KLJUČNE BESEDE:feroportin; hemokromatoza; hepcidin; železo; preobremenitev z železom;ledvičnatubule

Feroportin (FPN) je edini znani izvozni protein železa pri sesalcih. Posreduje sproščanje železa v krvni obtok iz enterocitov dvanajstnika in vraničnih retikuloendotelijskih makrofagov, ustreznih mest absorpcije in recikliranja železa.1,2 Sproščanje železa, ki ga posreduje FPN, antagonizira hormon hepcidin, znan tudi kot protimikrobni peptid hepcidina (HAMP). Hepcidin, ki se proizvaja predvsem v jetrih, se veže na FPN in inducira njegovo internalizacijo, s čimer omejuje sproščanje železa v krvni obtok in njegovo razpoložljivost za periferna tkiva.3,4 Tako os HAMP/FPN deluje na mestih absorpcije in recikliranja za nadzor sistemskih homeostazo železa.

Ledvice so mesto reabsorpcije železa. Železo, ki ni vezano na transferin, in železo, vezano na transferin, lahko prehaja v glomerularni fifiltrat.5 Velika večina tega železa se vzame nazaj v tubularni epitelij. Pri tem ponovnem privzemu je bilo vpletenih več transporterjev, vključno z multiligandnim receptorskim kompleksom megalin-kubilin, receptorjem za transferin 1, transporterjem dvovalentnih kovin 1, transporterjem cinka ZIP8 in transporterjem cinka ZIP14.5–10.

Enkrat vledvičnaepitelij, se železo ponovno absorbira v krvni obtok. FPN je v izobiljuledvicain je bil vpleten v reabsorpcijo železa.11–14 Vendar pa ostaja neznano, ali je ledvični FPN podvržen regulaciji endogenega HAMP v normalnih fizioloških pogojih, in če je tako, ali je taka regulacija pomembna za sistemsko in/ali ledvično homeostazo železa.

Da bi odgovorili na ta vprašanja, smo ustvarili nov model miške z inducibilnimledvičnatubul–specifična vnosa fpnC326Y, ki kodira protein FPNC326Y, odporen na HAMP. Poleg tega smo za potrditev predhodno poročane vloge FPN pri reabsorpciji železa izdelali tudi mišji model z inducibilnimledvičnatubul–specifična delecija gena fpn. Naši rezultati kažejo, da endogeni HAMP neposredno uravnava absorpcijo železa, ki jo posreduje FPN, in da je ta regulacija pomembna za obaledvičnain sistemsko homeostazo železa, zlasti v primeru presežne razpoložljivosti železa.

Ta študija je prva, ki je uporabila miši, ki imajo ledvično specifično izgubo odzivnosti HAMP, da bi uradno določilipomembnostodledvičnaos HAMP/FPN. Zagotavlja nov vpogled v vlogo reabsorpcije železa pri določanju stopnje ledvične in zunajledvične preobremenitve z železom pri hemokromatozi.

METODE

Miši

Vsi postopki na živalih so bili v skladu z Zakonom o domačih živalih (znanstveni postopki) Združenega kraljestva iz leta 1986 in jih je odobril Odbor za etično presojo Oddelka za medicinske znanosti Univerze v Oxfordu.

Pogojna alela fpnflfl in fpnC326Yflfl sta bila ustvarjena, kot je opisano prej.15,16

Miši s transgenom Pax8.CreERT2þ so bile darilo dr. Athene Matakidou, Cancer Research UK Cambridge Institute, Univerza v Cambridgeu. Te miši so bile ustvarjene, kot je opisano prej.17 Vse miši so bile na ozadju C57BL/6.

Diete

Če ni navedeno drugače, so živali dobile standardno hrano za glodalce, ki je vsebovala 200 delcev na milijon (ppm) železa. V poskusih manipulacije z železom so miši od odstavitve 3 leta prejemale dieto, obremenjeno z železom (5000-ppm železa; Teklad TD.140464) ali ustrezno kontrolno dieto (200- ppm železa; Teklad TD.08713). mesecih.

Kvantifikacija železa in indeksi železa 

Ravni serumskega železa in feritina so bile določene s sistemom ABXPentra (Horiba Medical). Vrednosti hemoglobina so bile določene z HemoCue Hb 201 Hemoglobin Microcuvettes. Serumske ravni eritroferona so bile izmerjene z encimsko imunskim testom (Intrinsic Lifesciences). Določanje celotnega elementarnega železa v tkivih je bilo izvedeno z masno spektrometrijo z induktivno sklopljeno plazmo, kot je opisano prej.15,16,18 Umerjanje je bilo doseženo s postopkom standardnih dodatkov, kjer so bili konici 0 ng/g, 0,5 ng/ g, 1 ng/g, 10 ng/g, 20 ng/g in 100 ng/g železa smo dodali ponovitvam izbranega vzorca. Zunanji standard železa (raztopina standardov visoke čistosti ICP-MS-68-A) je bil razredčen in izmerjen, da se potrdi veljavnost umerjanja. V vsak slepi vzorec, standard in vzorec je bil dodan tudi rodij kot interni standard v koncentraciji 1 ng/g. Za kvantitativno določanje železa v urinu so miši v obdobju 24 ur zbirali urin in ga podvrgli masni spektrometriji z induktivno sklopljeno plazmo. Ravni kreatinina v istih vzorcih so bile izmerjene s kolorimetričnim kompletom za analizo kreatinina (Abcam; ab65340), vrednosti železa pa so bile normalizirane na koncentracijo kreatinina.

Imunohistokemija 

Fluorescenčno imunsko barvanje je bilo izvedeno v s formalinom fiksiranih in v parafin vgrajenih tkivnih odsekih z uporabo protiteles FPN (Novus Biologicals; NBP1-21502) pri 1:100 in protitelesa Pro-Hepcidin (AA 39-59) pri 1:50 (Protitelesa na spletu; ABIN350367). Specifičnosti protiteles FPN in hepcidina so bile potrjene z uporabo živali Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ in živali Hamp–/– kot negativnih kontrol (dodatna slika S1). Označevalci ledvičnega segmenta so bili identificirani s protitelesom akvaporin-1 pri 1:200 (Biotechne; NB600- 749), protitelesom akvaporin-2 pri 1:200 (Biotechne; NBP1-70378), ali protitelesa kalbindina pri 1:100 (Abcam; ab82812). Sekundarna protitelesa so bila proti kunčjim IgG Alexa Fluor-488 (Abcam; ab150073), proti oslovskim IgG Cy3 (Abcam; ab6949) in proti mišjim IgG Alexa568 (Abcam; ab175473). Diapozitivi so bili posneti z mikroskopom FV1000 Olympus.

cistanche lahko zaščitiledvicafunkcijo

Western blotting

Tkiva so bila na hitro zamrznjena v tekočem dušiku, zdrobljena in nato lizirana z uporabo RIPA Lysis Buffer System (Santa Cruz; sc-24948) v skladu z navodili proizvajalca. Tkivni lizati so bili očiščeni s centrifugiranjem pri 15 000g 10 minut pri 4 °C. Koncentracija beljakovin v lizatih je bila izmerjena z BCA Protein Assay (Pierce; 23225) in normalizirana na enako koncentracijo za vsako serijo. Lizate nato razredčimo v nereduciranem pufru vzorca natrijevega dodecil sulfata Laemmli in segrevamo pri 95 °C 5 minut. Beljakovine (30–50 mg) smo naložili na gele Mini-PROTEAN TGX (Biorad; 4561096). Po elektroforezi smo beljakovine prenesli na poliviniliden diflfluoridno membrano z uporabo sistema BioRad Translotter in membrane za eno uro blokirali v blokirnem pufru, ki je vseboval 5 odstotkov govejega serumskega albumina. Membrane smo nato čez noč obarvali pri 4 °C s kunčjim poliklonskim protitelesom proti mišjem FPN (NBP1-21502; Novus Biologicals) pri 1:1000 ali protitelesom proti b-aktinu, konjugiranim s hrenovo peroksidazo (Proteintech; HRP{{18} }) pri 1:5000. Bloti so bili razviti s kompletom za odkrivanje ECL Prime (RPN2232; VWR International). Intenzivnost signala je kvantificiral ImageJ, razmerje med FPN in signaloma b-aktina pa je bilo izračunano za proizvodnjo normaliziranih intenzitet.

Perlsovo barvanje z diaminobenzidinom (DAB).

Odrezke tkiva, fiksirane s formalinom in v parafin, smo deparafificirali s ksilenom in nato rehidrirali v etanolu. Predmetna stekelca smo nato 1 uro obarvali z 1 odstotkom kalijevega fericianida v pufru 0.1 mol/L HCl. Aktivnost endogene peroksidaze je bila ugasnjena, nato pa stekelca obarvali s kromogenskim substratom DAB in nasprotno obarvali s hematoksilinom. Vizualizirani so bili s standardnim svetlobnim mikroskopom.

Kvantitativna verižna reakcija s polimerazo

Ekspresija genov je bila izmerjena s sondami za analizo ekspresije Applied Biosystems TaqMangene za Hamp in gospodinjski gen baktin (Life Technologies). Vrednost cikla praga (CT) za gen, ki nas zanima, je bila najprej normalizirana z odbitkom vrednosti CT za b-aktin, da se dobi vrednost DCT. Vrednosti DCT testnih vzorcev smo nadalje normalizirali na povprečje vrednosti DCT za kontrolne vzorce, da smo dobili vrednosti DDCT. Relativne ravni izražanja genov so bile nato izračunane kot 2–DDCT.

Statistika

Vrednosti so prikazane kot povprečje SEM. Parne primerjave so bile izvedene s Studentovim t testom. Več primerjav je bilo narejenih z analizo variance. Post hoc testi so uporabili Bonferronijev popravek.

Slika 1|Os hepcidin/feroportin (FPN) v ledvičnih tubulih nadzoruje reabsorpcijo železa in je pomembna za homeostazo ledvičnega železapri mišjih samicah. (a)Reprezentativne slike imunofluorescentnega barvanja za FPN, akvaporin 1 (AQP1), akvaporin 2 (AQP2) in kalbindin (CalD) v ledvicah miši divjega tipa. Palice=200 mm, prvotna povečava 10. Končna plošča, palica=25 mm, prvotna povečava 60. (b) Western blot za FPN vledvicesamic in samcev miši FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreER T2 þ in kontrol FpnC326Y flfl/flfl 1 teden po zdravljenju s tamoksifenom. Kvantifikacija jakosti signala je prikazana na spodnji plošči. (c) Western blot za FPN v ledvicah samic in samcev Fpnflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ miši in Fpnflfl/flfl kontrol 1 teden po zdravljenju s tamoksifenom. Kvantifikacija jakosti signala je prikazana na spodnji plošči. (d) Ledvične ravni železa pri ženskah in moških FpnC326Y^flfl/^flfl,Pax8.CreERT2þ miši in kontrole FpnC326Yflfl/flfl po 1 tednu, 1 mesecu, 3 mesecih in 6 mesecih po zdravljenju s tamoksifenom. ( e ) Reprezentativne slike diaminobenzidina (DAB) okrepljenega Perlsovega železovega madeža v ledvični kortikalni regiji ustreznih živali 3 mesece po indukciji tamoksifena. Stolčki ¼ 200 mm, prvotna povečava 10. (f) Ledvične ravni železa pri mišjih samicah in samcih Fpnflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ in kontrolah Fpnflfl/flfl po 1 tednu, 1 mesecu, 3 mesecih in 6 mesecih po indukciji tamoksifena. ( g ) Reprezentativne slike z DAB izboljšanega Perlsovega železovega madeža v predelu ledvične skorje ustreznih živali 3 mesece po indukciji tamoksifena. (Nadaljevano)

Slika 1 |(Nadaljevanje) Palice ¼ 200 mm, originalna povečava 10. (h) Ravni železa v serumu pri samicah in samcih FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ miši in kontrolah FpnC326Yflfl/flfl po 1 tednu, 1 mesecu, 3 mesecih in 6 mesecih po zdravljenju s tamoksifenom. (i) Raven železa v serumu pri mišjih samicah in samcih Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ in kontrolah Fpnflfl/flfl po 1 tednu, 1 mesecu, 3 mesecih in 6 mesecih po indukciji tamoksifena. Vrednosti so prikazane kot povprečje SEM. *P <0,05, **p=""><0,01 in="" ****p=""><0,0001. b-akt,="" b-aktin;="" nadaljevanje,="" nadzor;="" dapi,="" 40="" ,6-diamidino-2-fenilindol;="" ppm,="" deli="" na="" milijon.="" za="" optimizacijo="" gledanja="" te="" slike="" si="" oglejte="" spletno="" različico="" tega="" članka="" na="">

REZULTATI

Os hepcidin/FPN v ledvičnih tubulih nadzoruje reabsorpcijo železa in je pomembna za homeostazo ledvičnega železa pri mišjih samicah

Najprej smo poskušali ugotoviti natančno mesto izražanja FPN vledvica. V ta namen smo obarvali mišje ledvice za FPN in segmentno specifične označevalce akvaporin 1 (označevalec proksimalnih zavitih tubulov in tankega padajočega Henleyjevega uda), akvaporin 2 (označevalec zbiralnih kanalčkov in povezovalnih tubulov) in kalbindin (označevalec distalnih zavitih tubulov in kortikalnih povezovalnih in zbiralnih vodov). Ugotovili smo, da je FPN močno izražen v korteksu in se kolokalizira z akvaporinom 1 v proksimalne zavite tubule. V notranji meduli je bilo nekaj FPN, ki se je kolokaliziral z akvaporinom 2 v medularne zbiralne kanale. Ni bilo kolokalizacije FPN s kalbindinom (slika 1a; večja plošča je prikazana na dodatni sliki S2). Ti rezultati potrjujejo, da je FPN največ v kortikalni regiji znotraj proksimalnih zavitih tubulov.

Da bi ugotovili, ali ledvično FPN uravnava HAMP, smo uporabili miši, ki vsebujejo vpadni transgen Pax8.CreERT2þ, ki poganja s tamoksifenom inducirano ekspresijo rekombinaze Cre pod nadzorom seznanjenega promotorja box gena 8 pax8 v proksimalnih in distalnih tubulih ter v zbiralne kanale.17 Miši Pax8.CreERT2þ smo križali s tistimi, ki vsebujejo pogojno vgrajeni flfloksirani alel FpnC326Y, ki kodira FPN, odporen na hepcidin. Poleg tega in za potrditev predhodno poročane vloge ledvičnega FPN pri reabsorpciji železa smo križali miši Pax8.CreERT2þ z mišmi, ki vsebujejo alel Fpnflfl/flfl. En teden po zdravljenju s tamoksifenom za induciranje transgena Pax8.CreERT2 so bile ledvične ravni FPN povečane pri mišjih samicah in samcih FpnC326Yflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ v primerjavi s kontrolami FpnC326Yflfl/flfl (slika 1b), kar dokazuje, da je ledvični FPN predmet regulacije endogeni HAMP v normalnih fizioloških pogojih in poleg tega potrjuje učinkovitost transgena Pax8.CreERT2þ. Nasprotno pa so bile ledvične ravni FPN zmanjšane pri mišjih samicah in samcih Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ glede na kontrole Fpnflfl/flfl, kar dodatno potrjuje učinkovitost transgena Pax8.CreERT2þ (slika 1c). Specifičnost tega transgena Pax8.CreERT2þ je bila potrjena tudi s prisotnostjo delecijskega alela (DFpn) vledvicavendar ne v jetrih ali vranici Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ miši (dodatna slika S2A).

Nato smo se odločili ugotoviti, ali ledvična os HAMP/FPN nadzoruje reabsorpcijo železa. V ta namen smo izmerili ledvično in serumsko raven železa 1 teden, 1 mesec, 3 mesece in 6 mesecev po zdravljenju s tamoksifenom. Ugotovili smo, da ledvično železo

vsebnost je bila nižja pri FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ samicah kot pri FpnC326Yflfl/flfl kontrolnih samicah v vseh časovnih točkah (slika 1d). Vsebnost železa v ledvicah pri samcih ni bila različna glede na genotip (slika 1d). Barvanje z železom Perl, izboljšano z DAB, je tudi potrdilo zmanjšanje ravni železa v proksimalnih tubulih FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ samic (slika 1e; večja plošča je prikazana na dodatni sliki S2). Nasprotno pa smo ugotovili, da je bila vsebnost ledvičnega železa višja pri Fpnflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ samicah kot pri Fpnflfl/flfl kontrolnih samicah od 1 meseca dalje (slika 1f). Vsebnost železa v ledvicah pri samcih ni bila različna glede na genotip (slika 1f). Barvanje z železom Perls, izboljšano z DAB, je tudi potrdilo kopičenje železa v proksimalnih tubulih Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ samic (slika 1g; večja plošča je prikazana na dodatni sliki S2).

Raven železa v serumu je bila prehodno povečana tako pri samcih kot pri samicah miši FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ glede na kontrole FpnC326Yflfl/flfl v časovni točki 1-meseca (slika 1h). Nasprotno pa so se koncentracije železa v serumu znižale pri samicah Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ glede na kontrolne samice Fpnflfl/flfl v časovni točki 1-meseca, medtem ko so ostale primerljive pri samcih različnih genotipov v vseh časovnih točkah (slika 1i ). Ponovne vzpostavitve ravni železa v serumu na tiste, opažene pri kontrolnih živalih pri starosti 3 mesecev, ni bilo mogoče pripisati obnovitvi normalne ledvične ravni FPN. Dejansko so se s Pax8.CreERT2þ povzročene spremembe v ledvičnih FPN še vedno ohranjale 3 mesece po zdravljenju s tamoksifenom (dodatna slika S2B in C). Zmanjšana vsebnost železa v ledvicah in zvišane ravni železa v serumu pri ženskah FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ kažejo, da je od FPN-odvisne reabsorpcije železa v proksimalnih tubulih v normalnih fizioloških pogojih regulirana HAMP. Povečana vsebnost železa v ledvicah in znižana raven železa v serumu pri ženskah Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ potrjujejo prejšnje ugotovitve, da ledvična FPN prispeva k reabsorpciji železa. Poleg tega se zdi, da je v normalnih fizioloških pogojih kontrola reabsorpcije železa s pomočjo ledvične osi HAMP/FPN bolj pomembna pri ženskah kot pri moških, vsaj pri sevu C57BL/6.

Cistanche lahko izboljša delovanje ledvic

Ledvična os HAMP/FPN prispeva k normalni sistemski homeostazi železa, vendar ni bistvena zanjo v pogojih normalne razpoložljivosti železa.

Nato smo se odločili določiti prispevek ledvične osi HAMP/FPN k sistemski homeostazi železa. Ugotovili smo, da so imele samice FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ prehodno povečanje serumskega feritina (slika 2a), vsebnosti železa v jetrih (slika 2b) in vsebnosti železa v vranici (slika 2c) v 1-mesečnem časovnem obdobju, ko v primerjavi s kontrolnimi samicami FpnC326Yflfl/flfl. Njihove ravni hemoglobina so ostale primerljive s tistimi pri kontrolah v vseh časovnih točkah (slika 2d). Noben od teh parametrov se ni razlikoval med samci FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ in njihovimi kontrolami FpnC326Yflfl/flfl (slika 2a–d). Ravni eritroferona se niso razlikovale glede na genotip (dodatna slika 3A). Nasprotno pa smo ugotovili, da imajo samice Fpnflfl/ flfl ,Pax8.CreERT2þ nižje ravni serumskega feritina v 1- in 3-mesečnih časovnih točkah (slika 2e), nižjo vsebnost železa v jetrih v 3- in 6-mesečne časovne točke (slika 2f) ter nižjo vsebnost železa v vranici na 1- in 3-mesečnih časovnih točkah (slika 2g) v primerjavi s kontrolnimi ženskami Fpnflfl/flfl. Imeli so tudi prehodno in blago znižanje ravni hemoglobina v 3-mesečni časovni točki (slika 2h). Noben od teh parametrov se ni razlikoval med samci Fpnflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ in njihovimi kontrolami Fpnflfl/flfl (slika 2e–h). Ravni eritroferona tudi niso bile spremenjene glede na genotip (dodatna slika 3B). Ti podatki skupaj kažejo, da v normalnih fizioloških pogojih ledvična os HAMP/FPN prispeva k sistemskim nivojem železa, vendar sama po sebi ni bistvena za vzdrževanje normalne sistemske homeostaze železa.

Slika 2|Os protimikrobnega peptida ledvičnega hepcidina/feroportina (FPN) prispeva k normalnemu sistemskemuhomeostazo železa v pogojih normalne razpoložljivosti železa. (a–d)Sistemski indeksi železa pri mišjih samicah in samcih FpnC326Yflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ in kontrolah FpnC326Yflfl/flfl 1 teden, 1 mesec, 3 mesece in 6 mesecev po zdravljenju s tamoksifenom, vključno z (a) serumskim feritinom, (b) vsebnostjo železa v jetrih , (c) vsebnost železa v vranici in (d) hemoglobin. (e–h) Sistemski indeksi železa pri samicah in samcih miši Fpnflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ in kontrolah Fpnflfl/flfl po 1 tednu, 1 mesecu, 3 mesecih in 6 mesecih po indukciji s tamoksifenom, vključno z (e) serumskim feritinom ( f) vsebnost železa v jetrih, (g) vsebnost železa v vranici in (h) hemoglobin. Vrednosti so prikazane kot povprečje SEM. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01="" in="" ***p="">< 0.001.="" ppm,="" deli="" na="">

Slika 3|Os protimikrobnega peptida ledvičnega hepcidina (HAMP)/feroportina (FPN) določa obseg ledvične in sistemske preobremenitve z železom v pogojih presežne razpoložljivosti železa. (a–f)Ekstrarenalni indeksi železa pri mišjih samicah in samcih FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ in kontrolnih skupinah FpnC326Yflfl/flfl so zagotovili bodisi kontrolno dieto s hrano (200 delcev na milijon [ppm]) ali dieto z železom (5000 ppm) za 3 mesece. (Nadaljevano)

Slika 3 |(Nadaljevanje) Indeksi vključujejo (a) serumsko železo, (b) serumski feritin, (c) vsebnost železa v vranici, (d) vsebnost železa v srcu, (e) vsebnost železa v pljučih in (f) vsebnost železa v jetrih. (g) Vsebnost železa v ledvicah pri mišjih samicah in samcih FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ in kontrolah FpnC326Yflfl/flfl pod pogojem bodisi kontrolne diete s hrano (200 ppm) alinabit z železomdieta (5000 ppm) 3 mesece. (h, i) Reprezentativne slike Perlsovega železovega madeža z diaminobenzidinom (DAB) v jetrih in kritični regiji ledvic ustreznih živali. Palice ¼ 200 mm, originalna povečava 10. (j) Relativna ekspresija gena hamp v jetrih ustreznih živali. Vrednosti so prikazane kot povprečje SEM. *P <0,05, **p=""><0,01, ***p=""><0,001, ****p=""><0,0001, *****p=""><0,00001 in="" ******p=""><0,000001. za="" optimizacijo="" gledanja="" te="" slike="" si="" oglejte="" spletno="" različico="" tega="" članka="" na="">

Ledvična os HAMP/FPN določa obseg ledvične in sistemske preobremenitve z železom v pogojih presežne razpoložljivosti železa 

Nato smo se odločili določiti vlogo ledvične osi HAMP/FPN pri nastavitvi preobremenitve z železom. V ta namen so bile FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ živali in FpnC326Yflfl/flfl kontrole inducirane s tamoksifenom in nato 3 mesece zagotovljena bodisi kontrolna dieta s hrano, ki je vsebovala 200 ppm železa, bodisi dieta, obremenjena z železom, ki je vsebovala 5000 ppm železa. . Ugotovili smo, da je zagotavljanje prehrane, obremenjene z železom, povečalo serumsko železo, serumski feritin in vsebnost železa v tkivih pri moških in ženskah obeh genotipov. Vendar so imele živali FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ večje povečanje serumskega železa (slika 3a), serumskega feritina (slika 3b) in vsebnosti železa v vranici (slika 3c), srcu (slika 3d), pljučih (slika 3e) , in jetra (slika 3f) kot kontrole FpnC326Yflfl/flfl. Nasprotno pa so imeli manjše povečanje vsebnosti železa v ledvicah (slika 3g). Razlike med genotipi v stopnji obremenitve z železom v proksimalnih tubulih in v jetrih so bile očitne tudi pri barvi z železom Perls, izboljšani z DAB (sliki 3h in i; večje plošče so prikazane na dodatni sliki S4). V skladu z večjo sistemsko preobremenitvijo z železom, FpnC326Yflfl/flfl, so imele živali Pax8.CreERT2þ tudi večje povečanje ekspresije gena hemp v jetrih v primerjavi s kontrolami FpnC326Yflfl/flfl (slika 3j). Niti dieta niti genotip nista vplivala na ravni hemoglobina in v skladu s tem so tudi ravni serumskega eritroferona ostale nespremenjene (dopolnilni sliki 4A in B). Te ugotovitve kažejo, da v pogojih presežne razpoložljivosti železa nadzor reabsorpcije železa preko ledvične osi HAMP/FPN zmanjša sistemsko preobremenitev z železom, hkrati pa poveča preobremenitev z železom v ledvicah.

Ledvična os HAMP/FPN določa vzorec preobremenitve tkiva z železom pri hemokromatozi 

Nato smo se odločili raziskati vlogo ledvične osi HAMP/FPN v kontekstu dedne hemokromatoze, genetskega stanja preobremenitve z železom, ki ga povzročajo napake v proizvodnji hepcidina ali odzivnosti na hepcidin.19 V ta namen smo uporabili miši, ustvarjene v hiša, v kateri je heterozigotno vseprisotno vnose alela fpnC326Y (Fpnwt/C326Y). Prej smo dokazali, da te miši razvijejo fenotip preobremenitve z železom, značilen za dedno hemokromatozo. 15, 18 Primerjali smo vzorec tkivapreobremenitev z železompri teh miših s tistim, opaženim pri miših divjega tipa, ki so jih od odstavitve 3 mesece hranili z železom obremenjeno hrano. Tako miši Fpnwt/C326Y kot miši divjega tipa, ki so bile hranjene z dieto, bogato z železom, so imele

povečano vsebnost železa v jetrih, srcu in pljučih v primerjavi z njihovimi kontrolnimi skupinami (sliki 4a in b). Vsebnost ledvičnega železa pri miših Fpnwt/C326Y je bila normalna pri starosti 3 mesecev (slika 4a) in se je povečala samo za 32 odstotkov v primerjavi s kontrolami pri starosti 6 mesecev (dodatna slika 5A). V nasprotju s tem so živali divjega tipa, ki so prejemale dieto, bogato z železom, imele 260-odstotno povečanje vsebnosti železa v ledvicah v primerjavi s tistimi na običajni prehrani (slika 4b). Relativne razlike v preobremenitvi ledvic in jeter z železom med obema modeloma so bile očitne tudi pri DABenhanced Perls barvi z železom (sliki 4c in d; večje plošče so prikazane na dodatni sliki S5). Obseg zunajledvične preobremenitve z železom je bil primerljiv med obema modeloma, medtem ko je bila velikost preobremenitve ledvic precej višja pri živalih divjega tipa, ki so prejemale prehrano z železom, kot pri miših Fpnwt/C326Y (slika 4e). FPN je bil povečan v skorji tako pri miših Fpnwt/C326Y kot miših divjega tipa, ki so zagotavljale dieto, obremenjeno z železom (slika 4f in g; večje plošče so prikazane na dodatni sliki S5). Natančnejši pregled mesta ekspresije FPN v proksimalnih tubulih je pokazal, da se zdi, da se lokalizira intracelularno kot tudi na bazolateralni membrani pri miših Fpnwt/C326Y. V nasprotju s tem se je zdelo, da se FPN lokalizira predvsem na citoplazmo, apikalno membrano in presenetljivo je jedro pri miših zagotovilo dieto, obremenjeno z železom (slika 4f in g, spodnje plošče). Vzorec lokalizacije FPN, ki izhaja iz zagotavljanja prehrane, obremenjene z železom, je bil dodatno potrjen z uporabo živali Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ kot negativne kontrole (dodatna slika S5B). Ta opažanja, skupaj s prejšnjo ugotovitvijo, da imajo živali FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ manjšo obremenitev ledvic z železom kot kontrolne skupine po zagotavljanjunabit z železomdieto, dokazujejo, da izguba delovanja HAMP na ledvično FPN ščitiledvicazaradi obremenitve z železom v okviru dedne hemokromatoze.

DISKUSIJA

Najpomembnejša ugotovitev te študije je, da endogeni HAMP nadzoruje reabsorpcijo železa, ki jo posreduje FPN. Prejšnje študije so poročale o regulaciji FPN z eksogenim HAMP v gojenih ledvičnih celicah in o obratnem razmerju med nivoji HAMP in FPN vledvicapo enostranski okluziji sečevoda.12,13 Vendar je to prvi dokaz, da taka regulacija deluje in vivo v normalnih fizioloških pogojih in na način, ki vpliva na ledvično in sistemsko homeostazo železa. Posebna moč te študije je uporaba novih miši, ustvarjenih v podjetju, za skrivanje ledvično specifične izgube odzivnosti HAMP. Ta pristop omogoča preučevanje ledvične osi HAMP/FPN brez motečih učinkov spremenjene sistemske homeostaze železa, ki jo sicer opazimo pri vseprisotnih živalskih modelih.

Slika 4|Ledvični hepcidin protimikrobni peptid/feroportin (FPN) določa vzorec preobremenitve tkiva z železom pri hemokromatozi. (a)Raven železa v ledvicah, jetrih, srcu in pljučih živali Fpnwt/C326Y in Fpnwt/wt kontrol pri starosti 3 mesecev. (b) Raven železa vledvica, jetra, srce in pljuča pri živalih divjega tipa, ki so prejemali bodisi kontrolno prehrano z žvečilnimi obroki (200 delov na milijon [ppm]) bodisi dieto, bogato z železom (5{{4{{ 42}}}}00 ppm) od odstavitve za 3 mesece. ( c ) Reprezentativne slike z diaminobenzidinom (DAB) izboljšanega železovega madeža Perls v ledvični skorji in jetrih živali Fpnwt/C326Y in kontrol Fpnwt/wt pri starosti 3 mesecev. Prečnik ¼ 200 mm, originalna povečava 10. ( d ) Reprezentativne slike z DAB okrepljenega železovega madeža Perls v ledvični skorji in jetrih živali divjega tipa so zagotovile bodisi kontrolno dieto s hrano (200 ppm) bodisi dieto, obremenjeno z železom (5000 ppm) od odstavitve za 3 mesece. Bar ¼ 200 mm, prvotna povečava 10. (e) Primerjava stopnje obremenitve tkiva z železom med živalmi Fpnwt/C326Y in divjimi živalmi, hranjenimi z železom obremenjeno hrano. Vrednosti, prikazane za vsako žival, so normalizirane na povprečje zadevne kontrolne skupine. ( f ) Reprezentativne slike imunoflfluorescentnega obarvanja FPN v ledvični skorji živali Fpnwt/C326Y in kontrol Fpnwt/wt pri starosti 3 mesecev. Zgornja plošča, palice ¼ 200 mm, prvotna povečava 10. Spodnja plošča, palica ¼ 25 mm, prvotna povečava 60. (g) Reprezentativne slike FPN imunoflfluorescentnega obarvanja v ledvični skorji živali divjega tipa, ki so prejemale bodisi kontrolno prehrano z hrano (200 ppm) ali dieta z železom (5000 ppm) od odstavitve za 3 mesece. Zgornja plošča, palice ¼ 200 mm, prvotna povečava 10. Spodnja plošča, palica ¼ 25 mm, prvotna povečava 60. Vrednosti so prikazane kot povprečje SEM. *P <0,05, **p=""><0,01, ***p=""><0,001 in="" ****p=""><0,0001. če="" želite="" optimizirati="" ogled="" te="" slike,="" si="" oglejte="" spletno="" različico="" tega="" članka="" na="">

Druga pomembna ugotovitev te študije je, da ledvični HAMP/FPN določa obseg tako ledvične kot sistemske preobremenitve z železom (slika 5). Dejansko je izguba odzivnosti HAMP v ledvičnih tubulih povečala obseg preobremenitve jeter, vranice, srca in pljuč z železom, hkrati pa zmanjšala obseg ledvične preobremenitve z železom po zagotavljanju prehrane, obremenjene z železom. V skladu s tem so opazili večjo ledvično preobremenitev z železom po zagotavljanju diete, obremenjene z železom, pri divjih živalih (pri katerih je ledvična os HAMP/FPN nepoškodovana) kot pri miših s hemokromatozo (pri katerih je tudi ledvična os HAMP/FPN disrupted) (grafični izvleček). Ta ugotovitev lahko pojasni klinično opažanje, da jeledvicani pogosto prizadet pri bolnikih z dedno hemokromatozo.19

Slika 5|Vloga osi protimikrobnega peptida ledvičnega hepcidina (HAMP)/feroportina (FPN) pri določanju preobremenitve z železom.Zagotavljanje prehrane, obremenjene z železom, poveča razpoložljivost železa v serumu in raven železa v glomerularnem fifiltratu ter poveča proizvodnjo hepcidina (HAMP) in sproščanje v jetrih. Povečan serumski HAMP zavira reabsorpcijo železa z blokiranjem FPN v ledvičnih tubulih. Zaviranje reabsorpcije železa povzroči zadrževanje železa v ledvicah, hkrati pa zmanjša sistemsko razpoložljivost železa in posledično zmanjša preobremenitev jeter z železom. Pri miših FpnC3326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ izguba odzivnosti HAMP v ledvičnih tubulih povzroči neregulirano reabsorpcijo železa. To pa prepreči zadrževanje železa v ledvicah, hkrati pa poveča sistemsko razpoložljivost železa in posledično poveča preobremenitev jeter z železom.

Čeprav sta hemokromatoza in preobremenitev z železom v prehrani povečala FPN v ledvičnih tubulih, se zdi, da povzročita različne vzorce lokalizacije v apikalnem, intracelularnem ali bazolateralnem predelu. Podobna opažanja so bila opravljena pri dvanajstniku podgan, kjer je bilo ugotovljeno, da dajanje železa spremeni relativno porazdelitev FPN med temi predelki v enterocitih dvanajstnika. Ena od razlag teh rezultatov je, da je pri preobremenitvi z železom v prehrani povečano prevajanje FPN (posredovano z regulatorni proteini za železo) bi deloval tako, da bi ohranil visoko celotno proizvodnjo FPN v celici ledvičnih tubulov, medtem ko bi povečan serumski HAMP zmanjšal delež FPN, ki se lahko lokalizira na bazolateralni membrani. Iz te razlage sledi, da bi razhajanje med prejšnjimi poročili glede lokalizacije FPN v proksimalnih tubulih lahko odražalo razlike v vsebnosti železa v ledvičnih tubulih in ravni hepcidina v serumu med živalskimi modeli, uporabljenimi v različnih študijah. 5,11–14,21 Druga možnost je, da ta razlika bi lahko odražala stopnjo nespecifične reaktivnosti, o kateri so prej poročali v zvezi s komercialnimi protitelesi FPN, vključno s tistim, uporabljenim v tej študiji.14 Funkcionalni pomen apikalne lokalizacije FPN v ledvičnih tubulih ostaja nejasen in nismo mogli zaznati nobenih sprememb pri izločanju železa z urinom pri miših, obremenjenih z železom (dodatna slika 5C). Druga zanimiva ugotovitev je, da se je nekaj FPN pojavilo lokalizirano na jedru v ledvičnih tubulih miši, obremenjenih z železom. Podobna opažanja so izvedli tudi drugi pri makrofagih, obremenjenih z železom, in v jetrih podgan. Slednja študija je pokazala, da je jedrski FPN vključen v jedrsko zadrževanje železa kot del odziva akutne faze.22,23 Potrebne so podrobne študije subcelične lokalizacije FPN v različnih stanjih železa in pri različnih patologijah, da bi še izboljšali naše razumevanje vloge FPN v ledvicah.

Regulacija in delovanje ledvičnega HAMP prav tako nista povsem razumljena. Ugotovili smo, da je bila ekspresija gena hamp v ledvicah povečana pri živalih divjega tipa po zagotavljanju prehrane, obremenjene z železom (dodatna slika 5E), vendar je ostala nespremenjena pri miših s hemokromatozo (dodatna slika 5D) in pri tistih, ki vsebujejo ledvične tubule– specifična izguba FPN ali ledvičnih tubulov – specifična izguba odzivnosti HAMP (dodatna slika S5F in G). Ti rezultati ne podpirajo ideje, da je ekspresija gena renal hamp lokalno regulirana z ravnmi ledvičnega železa. Kar zadeva delovanje ledvičnega HAMP, je prejšnja študija na modelu enostranske okluzije sečevoda pokazala, da je vključen v nadzor ledvičnega FPN. Ugotovili smo, da je ledvični HAMP (zaznan s protitelesom proti peptidu pro-HAMP) kolokaliziran s kalbindinom (označevalec distalnih zavitih tubulov in kortikalnih zbiralnih kanalov in povezovalnih kanalov) (dodatna slika S5H). Po drugi strani se ekspresija FPN ne kolokalizira s kalbindinom, niti pri miših, ki imajo ledvično specifično izgubo odzivnosti HAMP (slika 1a in dodatna slika S5I). Ti rezultati niso skladni z avtokrino vlogo ledvičnega HAMP pri regulaciji ledvičnega FPN. Kljub temu je lahko ledvični HAMP vključen v parakrino regulacijo ledvičnega FPN. V prihodnosti bi bilo zanimivo preučiti parakrine funkcije ledvičnega HAMP in kvantificirati relativne prispevke ledvičnih in jetrnih HAMP k nadzoru reabsorpcije železa.

Druga zanimiva ugotovitev iz te študije je, da v pogojih normalne razpoložljivosti železa ledvična os HAMP/FPN ni bistvena za vzdrževanje normalne sistemske homeostaze železa in je namesto tega bolj pomembna za uravnavanje ravni železa v ledvicah, vsaj pri mišjih samicah. sev C57BL/6. Čeprav so bile opazovane spremembe ledvičnih ravni železa zaradi izgube FPN ali odzivnosti HAMP v ledvičnih tubulih vztrajne, so bile spremembe sistemskih indeksov železa prehodne narave. Prehodna narava sistemskih učinkov kaže na vpletenost kompenzacijskih mehanizmov. Eden od možnih kompenzacijskih mehanizmov je modulacija absorpcije železa s hrano z jetrnim HAMP. Dejansko smo ugotovili, da se je pri miših, ki so imele ledvično specifično izgubo odzivnosti HAMP, ekspresija gena hamp v jetrih povečala po zvišanju ravni železa v serumu v časovni točki 1-meseca in je ostala povečana v poznejših časovnih točkah. Nasprotno pa je bila ekspresija gena hepatic hamp zatrta pri miših, ki so imele ledvično specifično izgubo FPN po znižanju ravni železa v serumu v časovni točki 1-meseca in je ostala zatrta v poznejših časovnih točkah (dopolnilni sliki S6A in B). Poleg tega je povečano ekspresijo gena hepatic hamp v prvi nastavitvi spremljala zmanjšana raven FPN v črevesju, medtem ko je zmanjšano ekspresijo gena hepatic hamp v drugi nastavitvi spremljal višji FPN v črevesju (dodatna slika S6C in D). Ti rezultati kažejo, da je delovanje jetrnega HAMP na absorpcijo železa s hrano aktivni kompenzacijski mehanizem, ki sodeluje pri vzdrževanju normalne sistemske homeostaze železa ob moteni reabsorpciji železa v ledvicah.

Cistanche lahko popravi delovanje ledvic

Opozoriti je treba, da se zdi, da je v pogojih normalne razpoložljivosti železa ledvična os HAMP/FPN bolj pomembna pri mišjih samicah kot pri mišjih samcih, vsaj pri sevu C57BL/6. Tega opažanja ni mogoče pripisati razlikam med samci in samicami v aktivnosti transgena Pax8.CreERT2þ. O spolnem dimorfizmu v ravneh in vzorcih transporterjev vzdolž nefrona so že poročali pri tem mišjem sevu.24 V skladu s tem smo ugotovili večjo bazalno ekspresijo FPN vledvicesamic kot v ledvicah samcev iz legla (dodatna slika S2D). Prejšnja študija z uporabo drugačnega transgena rekombinaze Cre, ki ga poganja konstitutivno aktivni promotor Nestin za izbris fpn v celotnem nefronu, je prav tako poročala o povečanju ravni železa v ledvicah in zmanjšanju zalog železa v serumu in jetrih. Vendar je bila ta študija izvedena na drugem sevu miši (129/SvEvTac) in ni analizirala fenotipa glede na spol ali časovni potek.14

hemokromatoza in druge motnje železa.

RAZKRITJE

Vsi avtorji so izjavili, da nimajo konkurenčnih interesov.

ZAHVALA

SL-L je bil prejemnik podoktorske štipendije British Heart Foundation Intermediate Basic Science Postdoctoral Fellowship (FS/12/63/29895). GM je financiral aProjekt Kidney Research UKdonacija (RP_020_20160303), dodeljena SL-L.

AVTORSKI PRISPEVKI

SL-L zasnoval študijo. SL-L in GM sta izvedla poskuse. SL-L analizira in interpretira rezultate. SL-L napisal rokopis. Materiali, ki jih je prispeval AM. PAR je komentiral rokopis.

DODATNO GRADIVO

Dodatna datoteka (PDF)

Slika S1. Potrditev specifičnosti protiteles FPN in HAMP. (A) Reprezentativne slike FPN imunoflfluorescentnega obarvanja v ledvični skorji Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ živali in Fpnflfl/flfl kontrol pri starosti 3 mesecev. Zgornje plošče, palica ¼ 200 mm, prvotna povečava 10. Spodnje plošče, palica ¼ 25 mm, prvotna povečava 60. (B) Reprezentativne slike imunoflfluorescentnega barvanja HAMP v ledvični skorji živali Hamp–/– in kontrol divjega tipa pri 3. meseca starosti. Zgornje plošče, palica ¼ 200 mm, originalna povečava 10. Spodnje plošče, palica ¼ 25 mm, originalna povečava 60.

Slika S2. Potrditev aktivnosti in specifičnosti Pax8.CreERT2þ. (A) Genotipizacija miši Fpnflfl/flfl in Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ z uporabo genomske DNA, ekstrahirane iz jeter, vranice inledvica1 teden po indukciji s tamoksifenom. (B) Western blot za FPN vledvicesamic in samcev miši FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ in kontrol FpnC326Y 3 mesece po zdravljenju s tamoksifenom. Kvantifikacija jakosti signala je prikazana na spodnji plošči. (C) Western blot za FPN v ledvicah samic in samcev miši Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ in kontrol Fpnflfl/flfl 3 mesece po zdravljenju s tamoksifenom. Kvantifikacija jakosti signala je prikazana na spodnji plošči. (D) Western blot za FPN v ledvicah samic divjega tipa in samcev iz legla pri starosti 3 mesecev. Kvantifikacija jakosti signala je prikazana na spodnji plošči. (E–G) Večje različice plošč na sliki 1a, g in e. Vrednosti so prikazane kot povprečje SEM. *P < 0.05,="" ***p=""><>

Slika S3. Serumske ravni eritroferona niso spremenjene pri miših FpnC326Yflfl/flfl Pax8.CreERT2þ in Fpnflfl/flfl,Pax8.CreERT2. (A) Ravni eritroferona v serumu pri samicah in samcih FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ miši in kontrolah FpnC326Yflfl/flfl po 1 tednu, 1 mesecu, 3 mesecih in 6 mesecih po zdravljenju s tamoksifenom. (B) Serumske ravni eritroferona pri samicah in samcih miši Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ in kontrolah Fpnflfl/flfl po 1 tednu, 1 mesecu, 3 mesecih in 6 mesecih po indukciji tamoksifena. Vrednosti so prikazane kot povprečje SEM.

Slika S4. Ravni hemoglobina in serumskega eritroferona niso spremenjene pri FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ, hranjenem z dieto, bogato z železom. (A) Ravni hemoglobina pri samicah in samcih miši FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ in kontrolah FpnC326Yflfl/flfl, ki so bile 3 mesece od odstavitve hranjene s kontrolno dieto (ki vsebuje 200 ppm železa) ali dieto, obremenjeno z železom (ki vsebuje 5000 ppm železa). . (B) Ravni eritroferona v serumu pri samicah in samcih miši FpnC326Yflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ in kontrolah FpnC326Yflfl/flfl, hranjenih s kontrolno dieto (ki vsebuje 200 ppm železa) aliprehrana, bogata z železom(ki vsebuje 5000 ppm železa) od odstavitve za 3 mesece. Vrednosti so prikazane kot povprečje SEM. (C, D) Večje različice plošč na sliki 3h oziroma i.

Slika S5. Ravnanje z ledvičnim železom in izražanje ledvične izbokline pri različnih modelih miši. (A) Ledvične ravni železa pri živalih Fpnwt/C326Y in kontrolah Fpnwt/wt pri starosti 6 mesecev. (B) Reprezentativne slike FPN in AQP1 imunoflfluorescentnega obarvanja v ledvični skorji Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ živali in Fpnflfl/flfl kontrol, ki so bile 3 mesece hranjene z železom obremenjeno hrano, ki je vsebovala 5000 ppm od odstavitve. Bar ¼ 25 mm, prvotna povečava 60. (C) Raven železa v urinu (normalizirana na kreatinin v urinu) pri divjih živalih, ki so bile 3 mesece hranjene z železom obremenjeno dieto, ki je vsebovala 5000 ppm železa, ali kontrolno dieto, ki je vsebovala 200 ppm železa od odstavitve. (D) Ekspresija gena za ledvično hamp pri živalih Fpnwt/C326Y in kontrolah Fpnwt/wt pri starosti 3 mesecev. (E) Ekspresija gena za ledvično hamp pri živalih divjega tipa, ki so bile 3 mesece od odstavitve hranjene z dieto, obremenjeno z železom, ki je vsebovala 5000 ppm železa, ali kontrolno dieto, ki je vsebovala 200 ppm železa. (F) Ekspresija gena za ledvično hamp pri miših samicah in samcih FpnC326Yflflflfl, Pax8.CreERT2þ in kontrolah FpnC326Yflflflfl po 1 tednu, 1 mesecu, 3 mesecih in 6 mesecih po zdravljenju s tamoksifenom. (G) Ekspresija gena za ledvično hamp pri miših samicah in samcih Fpnflflflfl, Pax8.CreERT2þ in kontrolah Fpnflfl/flfl po 1 tednu, 1 mesecu, 3 mesecih in 6 mesecih po indukciji tamoksifena. (H) Reprezentativne slike HAMP in CalD imunofluorescentnega obarvanja v ledvični skorji živali divjega tipa pri starosti 3 mesecev. Bar ¼ 25 mm, prvotna povečava 60. (I) Reprezentativne slike FPN in CalD imunoflfluorescentnega obarvanja v ledvični skorji živali FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ, starih 1 mesec. Palica ¼ 25 mm, originalna povečava 60. (J–M) Večje različice plošč na sliki 4c, d, f oziroma g. Vrednosti so prikazane kot povprečje SEM. *P <>

Slika S6. Ekspresija genov za jetra je spremenjena in ravni FPN v črevesju so spremenjene pri miših z izpadom fpn, specifičnim za ledvične tubule, in pri miših z izločanjem fpnC326Y, specifičnim za ledvične tubule. (A) Relativna ekspresija mRNA hamp v jetrih samic miši FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ in kontrol FpnC326Yflfl/flfl po 1 tednu, 1 mesecu, 3 mesecih in 6 mesecih po zdravljenju s tamoksifenom. (B) Relativna ekspresija mRNA hamp v jetrih samic miši Fpnflflflfl, Pax8.CreERT2þ in kontrol Fpnflfl/flfl po 1 tednu, 1 mesecu, 3 mesecih in 6 mesecih po zdravljenju s tamoksifenom. (C) Reprezentativne slike imunskega barvanja FPN v črevesju samic FpnC326Y fflflfl, Pax8.CreERT2þ miši in FpnC326Yflfl/flfl kontrol 1 mesec po zdravljenju s tamoksifenom. Prečnik ¼ 200 mm, originalna povečava 10. (D) Reprezentativne slike imunskega obarvanja FPN v črevesju samic Fpnflflflfl, Pax8.CreERT2þ miši in Fpnflfl/flfl kontrol 1 mesec po zdravljenju s tamoksifenom. Palica ¼ 200 mm, originalna povečava 10. Vrednosti so prikazane kot povprečje SEM. *P <0,05, **p=""><0,01 in=""><>

Cistanche lahko lajša okužbo ledvic

REFERENCE

1. Donovan A, Lima CA, Pinkus JL, et al. Izvoznik železa feroportin/ slc40a1 je bistvenega pomena za homeostazo železa. Cell Metab. 2005; 1: 191–200.

2. Ganz T. Celično železo: feroportin je edini izhod. Cell Metab. 2005; 1: 155–157.

3. Nemeth E, Tuttle MS, Powelson J, et al. Hepcidin uravnava izločanje železa iz celic tako, da se veže na feroportin in inducira njegovo internalizacijo. Znanost. 2004; 306: 2090–2093.

4. Qiao B, Sugianto P, Fung E, et al. S hepcidinom povzročena endocitoza feroportina je odvisna od ubikvitinacije feroportina. Cell Metab. 2012; 15: 918–924.

5. Wareing M, Ferguson CJ, Green R, et al. In vivo karakterizacija ledvičnega transporta železa pri anestezirani podgani. J Physiol. 2000; 524: 581–586.

6. Christensen I, Birn H, Storm T, et al. Endocitni receptorji v proksimalnem tubulu ledvic. Fiziologija. 2012; 27: 223–236.

7. Zhang D, Meyron-Holtz E, Rouault T. Ledvična presnova železa: dostava železa v transferinu in vloga regulatornih proteinov železa. J Am Soc Nephrol. 2007; 18: 401–406.

8. Canonne-Hergaux F, Gruenheid S, Ponka P, Gros P. Celična in subcelična lokalizacija transporterja železa Nramp2 v meji črevesne krtače in regulacija s prehranskim železom. kri. 1999; 93: 4406–4417.

9. Wang C, Jenkitkasemwong S, Duarte S, et al. ZIP8 je prenašalec železa in cinka, katerega ekspresija na celični površini se nadzira z nalaganjem železa v celico. J Biol Chem. 2012; 287: 34032–34043.

10. Martines A, Masereeuw R, Tjalsma H, et al. Presnova železa v patogenezi z železom povzročene ledvične poškodbe. Nat Rev Nephrol. 2013; 9: 385–398.

11. Wolff N, Liu W, Fenton R, et al. Feroportin 1 se izraža bazolateralno v celicah proksimalnih tubulov ledvic podgan, presežek železa pa poveča promet z njegovo membrano. J Cell Mol Med. 2011; 15: 209–219.

12. Pan S, Qian ZM, Cui S, et al. Lokalni hepcidin je povečal znotrajcelično preobremenitev z železom prek razgradnje feroportina v ledvicah. Biochem Biophys Res Commun. 2020; 522: 322–327.

13. Moulouel B, Houamel D, Delaby C, et al. Hepcidin uravnava intrarenalno ravnanje z železom v distalnem nefronu. Kidney Int. 2013; 84: 756–766.

14. Wang X, Zheng X, Zhang J, et al. Fiziološke funkcije feroportina pri uravnavanju ledvičnega recikliranja železa in ishemične akutne poškodbe ledvic. Am J Physiol Renal Physiol. 2018; 315: F1042–F1057.

15. Lakhal-Littleton S, Wolna M, Chung YJ, et al. Bistvena celično avtonomna vloga hepcidina pri homeostazi srčnega železa. Elife. 2016; 5: e19804.

16. Lakhal-Littleton S, Wolna M, Carr CA, et al. Srčni feroportin uravnava celično homeostazo železa in je pomemben za delovanje srca. Proc Natl Acad Sci US A. 2015;112:3164–3169.

17. Espana-Agusti J, Zou X, Wong K, et al. Generiranje in karakterizacija transgene linije Pax8-CreERT2 in vpadne linije Slc22a6-CreERT2 za inducibilno in specifično genetsko manipulacijo epitelijskih celic ledvičnih tubulov. PLoS One. 2016; 11: e0148055.

18. Lakhal-Littleton S, Crosby A, Frize M, et al. Znotrajcelično pomanjkanje železa v gladkih mišičnih celicah pljučne arterije povzroči pljučno arterijsko hipertenzijo pri miših. Proc Natl Acad Sci US A. 2019;116:13122–13130.

19. Camaschella C. Razumevanje homeostaze železa z genetsko analizo hemokromatoze in sorodnih motenj. kri. 2005; 106: 3710–3717.

20. Núñez MT, Tapia V, Rojas A, et al. Oskrba z železom določa apikalno/bazolateralno membransko porazdelitev črevesnih prenašalcev železa DMT1 in feroportina 1. Am J Physiol Cell Physiol. 2010; 298: C477–C485.

21. Veuthey T, D'Anna MC, Roque ME. Vloga ledvic pri homeostazi železa: ledvična ekspresija prohepcdina, feroportina in DMT1 pri anemičnih miših. Am J Physiol Renal Physiol. 2008; 295: F1213–F1221.

22. Naz N, Malik I, Sheikh N, et al. Feroportin-1 je "jedrska" negativna beljakovina akutne faze v jetrih podgan: primerjava z drugimi beljakovinami, ki prenašajo železo. Lab Invest. 2012; 92: 842–856.

23. Aydemir F, Jenkitkasemwong S, Gulec S, Knutson MD. Obremenitev z železom poveča ravni heterogene jedrske RNA in mRNA feroportina v mišjih makrofagih J774. J Nutr. 2009; 139: 434–438.

24. Veiras LC, Girardi ACC, Curry J, et al. Spolni dimorfni vzorec ledvičnih prenašalcev in homeostaze elektrolitov. J Am Soc Nephrol. 2017; 28: 3504–3517.