Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Kliknite tukaj za informacije o I. delu (Uvod, materiali in metode) tega članka.

Skoraj enocelično proteomsko profiliranje proksimalnega tubula in glomerula normalne človeške ledvice--II. del

Tara K. Sigdel¹, Paul D. Piehowski², Sudeshna Roy¹, Juliane Liberto¹, Joshua R. Hansen², Adam C. Swensen², Rui Zhao³, Ying Zhu³, Priyanka Rashmi¹, Andrew Schroeder¹, Izabella Damm¹, Svastika Sur¹, Jinghui Luo⁴, Yingbao Yang⁴, Wei-Jun Qian²* in Minnie M. Sarwal¹* za konzorcij Kidney Precision Medicine Project (KPMP).

Rezultati

Odvzem zamrznjenih ledvic OCT je prednostna metoda za proteomiko ledvičnega tkiva

Za enako količino vnesenega tkiva, OCT zamrznjenledvicaje dal več beljakovin kot odseki FFPE iz iste ledvice (OCT zamrznjena: 1871 ± 92 proti FFPE: 296 ± 10 ng beljakovin; p < 0,0017), kar kaže na možno razgradnjo beljakovin v FFPE, kljub temu, da je bilo tkivo vdelano v parafin bloki za<2 months.="" bulk="" proteomics="" data="" from="" the="" two="" human="">ledvice(#1, #2) je pokazalo znatno prekrivanje identificiranih beljakovin s 84-odstotnim prekrivanjem med 2 ledvicama OCT (meja obnovljivosti=13.52, 97,96-odstotne vrednosti znotraj meje obnovljivosti) in 83-odstotnim prekrivanjem iste ledvice beljakovine med dvema ledvicama FFPE (meja ponovljivosti=24.43, 98,5-odstotne vrednosti znotraj meje ponovljivosti) (dodatna tabela 1 in slika 2B). Znotraj vsake ledvice, ne glede na metodo shranjevanja tkiva, je bilo ohranjenih približno 70 odstotkov ledvičnih strukturnih (večinoma zunajceličnega matriksa) proteinov, kar kaže na to, da so bili nekateri proteini bolj prednostno odkriti z vsako metodo. Da bi ocenili, kakšna obogatitev beljakovin je opažena med različnimi metodami zbiranja, smo ugotovili, da je OCT tkivna proteomika dala več beljakovin z visokim spektralnim številom, večjim ali enakim 5 (razmerje obetov=1.460601; 95-odstotni interval zaupanja {{21} }.238969, 1.722593; p=4.472e-06), kar lahko odraža boljšo ohranjenost ledvičnega tkiva v OCT (slika 2C). Proteomska analiza tkiva OCT je vzorčila tudi več edinstvenih beljakovin v primerjavi s tkivom FFPE (razmerje obetov=3.207089; 95-odstotni interval zaupanja=2.371221, 4.370600; p=4.985e{{ 38}}) (slika 2D). Poleg tega je bilo ugotovljeno, da je veliko teh edinstvenih proteinov v nizki količini in je večja verjetnost, da jih bodo zamudili, tudi z zelo kratkimi časi ohranjanja ledvičnega tkiva v FFPE. Ne glede na metodo ohranjanja tkiva smo opazili, da je prišlo do močnega prekrivanja skupnih bioloških poti. Poti so vključevale presnovne procese majhnih molekul (p=2.59E-121 za OCT in p=2.15E-109 za FFPE), presnovni proces karboksilne kisline (p {{47 }}.62E-80 za OCT in p=1.93 E-76 za FFPE), presnovni procesi organskih kislin (p=1.26E-76 za OCT in p=3.62E-80 za FFPE) in procesi presnove zdravil (p=7.90E-83 za OCT in p=4.01E{{64} } za FFPE). Ti podatki poudarjajo, kako je proteomika ledvičnega tkiva zelo ponovljiva, ne glede na metodo ohranjanja tkiva za obe testirani metodi.

Proteomika ledvičnega tkiva je zelo ponovljiva na transportiranem OCT zamrznjenem ledvičnem tkivu

Analizirali smo podatke, ustvarjene na dveh mestih (UCSF in Ohio State University), ki sta sledila istemu protokolu za izvajanje množične proteomike, kot je opisano v razdelku o metodah. Zanimivo je, da je bilo približno 70 odstotkov beljakovin običajno identificiranih v istemledvicaobdelani na dveh različnih mestih s spektralnim številom, večjim ali enakim 5 (r=0.95, P < 0.0001)="" (neobdelani="" podatki="" v="" dodatni="" tabeli="" 2).="" še="" pomembneje,="">ledviceposlani z osrednjega mesta so ustvarili visoko korelirane podatke (r=0.89, P=0.0001) (dodatna tabela 2), kar potrjuje, da so bili uporabljeni analitični protokoli za obdelavo tkiv precej robustni.

Cistanche je dober zaledvica

Optimizacija zajemanja ledvičnih celic z lasersko zajemalno mikrodisekcijo (LCM)

Različne debeline odsekov OCT, nameščenih na stekelca PET iz istegaledvica(n=2) so bili testirani pri debelini 5, 10 in 20 μm, v treh izvodih, za ponovljivost LCM. Odsek 10 μm je bil najoptimalnejši pri serijskem testiranju LCM z uporabo sistema Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection (Cut Energy, 64; Cut Focus, 75). Odrezane celice so bile ujete na lepilne pokrovčke. Poleg ponovljivosti postopka LCM smo ugotovili tudi največjo učinkovitost zajemanja katapultiranih celic pri debelini OCT preseka 10 μm.

Proteomika podkompartmentnih celic v normalni človeški ledvici identificira obogatene in edinstvene glomerularne in proksimalne tubularne proteine

Čez 9 normalnih ljudiledviceprocessed by nscProteomics, with input of an average of 10–40 cells input each/Glom and PT fraction, we identified an average of ~2,560 proteins/sample. Interestingly, ~20% of the total proteins assessed by nscProteomics, from either sub-compartment overlapped across compartments/cells and bulk tissue, representing likely housekeeping or more structural kidney proteins that are not compartment specific. In a direct comparison of the two sub-compartments, 208 proteins were enriched (>2 fold) in Glom, and 67 were completely unique to Glom (absent in PT); and conversely, 247 proteins were enriched (>2-krat) v PT, 25 pa je bilo edinstvenih za PT (odsoten v Glomu) (dodatna tabela 3). Kljub razmeroma majhnemu naboru vzorcev smo izvedli tudi navzkrižno šaržno validacijo, pri čemer smo vsako serijo serij obravnavali kot neodvisen niz. Tudi z majhnim unikatnim kompletomledvice(2 v seriji 1, 4 v seriji 2) je bilo 210 proteinov, obogatenih z Glom, visoko koreliranih med obema neodvisnima nizoma, kljub temu, da ti podatki prihajajo iz različnih kohort normalnihledvice(r=0.83; slika 3A) in analizirani ob različnih časih. 246 proteinov, obogatenih s PT, je prav tako mogoče povezati med dvema različnima kohortama normalnih ledvic (r=0.77; slika 3B). Rezultati poudarjajo, da je nscProteomics sposoben ponovljivo identificirati proteine, specifične za podkompartmente, ki so ohranjeni v različnih funkcionalnih enotah ledvic.

Slika 3. (A) Korelacija niza 210 proteinov, znatno obogatenih zglomerulmed dvema različnima serijama neodvisnih vzorcev ledvic. Serija 1 (1. serija) je bila iz 2 ledvic, serija 2 (2. serija) pa iz 4 ledvic. Barvna lestvica je bila izbrana za vizualno upodobitev obilja. Močna pozitivna korelacija 0.83 med povprečnimi abundancami istega niza proteinov iz dveh različnih serij. Rdeče črtkane črte podajajo mero širjenja s prikazom 95-odstotnega intervala napovedi za srednje vrednosti abundance teh proteinov v prihodnji ponovni poskusi. (B) Korelacija 246 proteinov, znatno obogatenih zproksimalne tubulevs.glomerulmed obema serijama. Pozitivna korelacija 0.77 med povprečnimi količinami teh istih beljakovin med obema serijama.

Da bi ugotovili specifičnost pristopa nscProtoemics zaledvicaanalizo podkompartmenta smo primerjali podatke Glom in PT ledvičnega podkompartmenta nscProteomics z množično proteomiko istega niza ledvičnega tkiva. Ugotovili smo, da približno 25 odstotkov (n=656) proteinov, identificiranih v obeh podkompartmentih, proteomika razsutega tkiva sploh ni zaznala, saj jih je verjetno zelo malo v množičnem vzorcu; 118 Glom in 74 PT obogatenih proteinov ni bilo mogoče odkriti v razsutem stanju ledvic, kar poudarja omejitev izvajanja samo proteomike v razsutem tkivu. Le 9 odstotkov proteinov, specifičnih za Glom, vendar večje število 48 odstotkov proteinov, specifičnih za PT, je bilo identificiranih s proteomiko ledvične mase, kar odraža veliko večjo številčnost celic PT kot celic Glom v normalnemledvica. Dejansko bi lahko nekateri znani markerji za glomerularne celice, kot so podocin (NPHS2), eva-1 homolog B (EVA1B), MARCKS like 1 (MARCKSL1), fibroblastni rastni faktor 1 (FGF1) in klaudin 5 (CLDN5). ne identificirajo s proteomiko ledvične mase pri standardnih globinah ~2,000.

cistanche za izboljšanjeledvicafunkcijo

Validacija označevalcev Glom in PT po oceni nscProteomics

Poročali so, da so večino proteinov podkompartmenta odkrili vledvicaIHC v predhodno objavljenih podatkih (Human Protein Atlas) (25). Proteini, ki jih IHC ni zaznal (označeni z *) ali podatki niso na voljo (označeni z **), so prikazani na slikah 4A, B. Vzeli smo najboljših 26 proteinov, obogatenih z glomom, in 26 proteinov, specifičnih za PT, ter zaslišali enocelične transkriptomski podatki (podatki scRNA Seq) za "cross-omics" integracijo in validacijo (slika 4B). Rezultat integrativne analize vrhunskih markerjev Glom in PT s proteomiko in transkriptomiko je pokazal močno korelacijo nekaterih znanih proteinov markerjev Glom in PT. Markerji podocitov, kot sta PODXL in CLIC5, ter markerji PT, kot sta PDZK1 in ANPEP, so bili v obeh nizih podatkov zelo obogateni. Poleg potrjevanja znanih označevalcev je nscProteomics identificiral tudi beljakovine, ki so identificirane v nizki količini bodisi v nizih transkriptomskih podatkov bodisi v nizih podatkov IHC. Na primer, PITPNB je visoko obogaten glomerularni marker po podatkih nscProteomics; vendar je bilo odkrivanje tega gena v transkriptomskih podatkih malo in ga IHC ni zaznati (25). Podoben primer so opazili pri SLC5A1, katerega signal je bil izboljšan v podatkih nscProteomics, ne pa v naborih podatkov o transkriptomih ali IHC (slika 4C).

Slika 4. (A) Toplotni zemljevid, ki prikazuje diferencialno porazdelitev številčnosti beljakovin v 5 normalnihledvice(serija 2), od 26 proteinov (od 372), najbolj izrazito obogatenih z G (v primerjavi s T) in 26 proteinov (od 411), najbolj izrazito obogatenih s T (v primerjavi z G), z ustreznimi vrednostmi v 2 množičnih vzorcih, prikazanih za primerjavo . Številčnost beljakovin se meri kot log 2 transformirane relativne intenzivnosti. Nenadzorovano združevanje pomembnih proteinov poudarja nize proteinov, povezane z evklidsko mero podobnosti razdalje znotraj večjih diferenciranih obogatenih nizov. Opozoriti je treba, da se skupni vzorci združujejo z vzorci PT; to se pričakuje odproksimalne tubuleso izdatno razpršeni znotrajledvica. (B) Korelacija grafa genske ekspresije podatkov scRNA-seq pri človekuledvica. Izbrani so bili geni, ki kodirajo Glom-specifične in PT-specifične proteine, predstavljene na toplotni karti. Povečanje velikosti pike ustreza večjemu odstotku celic v celični populaciji, ki izraža gen, medtem ko temnejša barva ustreza večji izraženosti gena. PT,proksimalni tubularni; Podo, podociti; Mes, mezangialne celice; LOH, Henlejeva zanka, imunske celice; Endo, endotelne celice; DT, distalni tubuli; CD, zbirni kanal. *Znak poleg simbola gena pomeni, da protein ni bil odkrit na glomerulih, kot poroča Atlas človeških beljakovin (https://www.proteinatlas.org), **Podatki niso na voljo v Atlasu človeških beljakovin (https://www. proteinatlas.org). (C) Reprezentativni proteini, ki dokazujejo, kako nscProteomics ne identificira samo pozitivnih markerjev, kot sta PODXL in PDZK1, ampak identificira tudi beljakovinske markerje, ki jih sicer zamudi transkriptomika ali imunohistokemija.

Biološki pomen Glom in PT obogatenih proteinov

Podatke, ustvarjene z razvitim protokolom za nscProteomics, smo uporabili za pregled beljakovin, ki so bile znatno obogatene v glomerularnih celicah aliproksimalni tubularnicelice. Proteini, obogateni z 208 Glom, so bili obogateni s transportom, posredovanim z vezikli (FDR 3,6E-15) in regulacijo organizacije celičnih komponent (FDR 9,75E-14) kot njihovimi vrhunskimi biološkimi procesi in vezavo na citoskeletne beljakovine (FDR 2,63 E-19) in vezava aktina (FDR 2.40E-17) med najvišje uvrščenimi molekularnimi funkcijami. Poleg tega sta bili najvišji obogateni celični komponenti aktinski citoskelet (FDR 3,73 E-25) in žariščna adhezija (FDR 4,07E-20). Proteini, obogateni s 247 PT, so bili obogateni s presnovnimi procesi majhnih molekul (FDR 7,55E-50) in presnovnimi procesi zdravil (FDR 5.00E-41) kot vrhunskimi biološkimi procesi. Proteini so bili obogateni za aktivnost oksidoreduktaze (FDR 9,07E-34) in katalitično aktivnost (FDR 1,05E-27) med najvišje uvrščenimi molekularnimi funkcijami.

nscProteomics identificira edinstven nabor proteinov Glom in PT

Poleg obogatenih proteinov v odsekih Glom ali PT je bilo 92 proteinov edinstvenih za Glom (n=67) ali edinstvenih za PT (n=25), saj so bili identificirani samo v obeh glomerularnih celicah. aliproksimalni tubularnicelic (tabela 1). Proteini, identificirani samo v glomerulnih celicah, so bili obogateni z molekularnimi funkcijami, kot so vezava aktina (FDR 4,92E-06), vezava na citoskeletne beljakovine (FDR 3,47E-05), vezava integrina (3,9E{ {11}}) itd. Ta seznam smo uporabili za preverjanje javno dostopnih podatkov, ki so predhodno poročali o njihovi prisotnosti vglomerul. Med 67 proteini, identificiranimi samo v odsekih Glom, so poročali, da je 41 prisotnih vledvica(25). Od teh 41 proteinov se podskupina 18 (43,9 odstotka) ujema z nscProteomics, 23 (56,1 odstotka) pa naj ne bi bila povečana v Glomu v primerjavi s tubuli. Med 25 proteini, identificiranimi samo v odsekih PT, so poročali, da jih je 20 prisotnih vledvica(25). Ti proteini so obogateni z molekularnimi funkcijami, kot je aktivnost transmembranskega prenašalca organskih anionov (FDR 6,34E-05), aktivnost transmembranskega prenašalca karboksilne kisline (FDR 1,4E-04), aktivnost topljenca: simporterja natrija (FDR 1,8 E -04) itd. Od 25 proteinov, specifičnih za PT, se podmnožica 19 proteinov (95.0 odstotkov) ujema z nscProteomics in samo 1 (5.0 odstotkov) poročajo, da se v tubulih v primerjavi z Glomom ne poveča.

Tabela 1. Beljakovine, obogatene z glomerularnimi inproksimalni tubularnicelice, ki jih identificira nscProteomics.

Diskusija

S hitrim napredkom enocelične genomike in transkriptomskih testov še vedno obstaja neizpolnjena potreba po izvajanju vzporednih enoceličnih študij na dragocenih človeških vzorcih na področju proteomike (27). Profiliranje beljakovin iz enocelične celice se sooča z oviro zaradi dejstva, da nimamo zmožnosti pomnoževanja beljakovin na način, na katerega lahko pomnožimo nukleotide. V tej prvi uporabi skoraj enocelične proteomike na človekuledvica, dokazujemo, da je robustna proteomska kvantifikacija brez oznak izvedljiva za samo 40ledvicacelice, specifične za različne podkompartmente LCM. Razviti protokoli za proteomiko skoraj enocelične ledvice bodo koristili drugim raziskovalcem, ki delajo na področju bolezni ledvic.

Nedavna študija Hoehne et al. je prikazal uporabo tehnologije priprave vzorca s trdno fazo (SP3) za proteomsko analizo ledvičnih segmentov (4). Z uporabo posameznih mikrodiseciranih glomerulov s približno 200 celicami so avtorji ponazorili heterogenost proteomov iz posameznih glomerulov iz mišjih modelov in človeških bolnikov. Druga nedavna študija Song et al. (28) so uporabili tkivo FFPE prejemnikov ledvičnega presadka, da bi ustvarili molekularno diagnostično platformo z uporabo množične proteomike. V tem rokopisu smo zelo podrobno optimizirali in analizirali postopek zbiranja tkiva za MS, da bi vzpostavili standardni protokol za proteomsko analizo majhnih vzorcev tkiva. Najprej smo primerjali FFPE in OCT metodo shranjevanja tkiv, da bi pokazali, da čeprav obstaja visoka korelacija med obema nizoma podatkov, OCT tkivo daje višjo vsebnost beljakovin in, kar je še pomembneje, sposobnost prepoznavanja beljakovin z nizko vsebnostjo. Drugič, protokoli MS za množično proteomiko so bili optimizirani tako, da je mogoče dobiti zelo ponovljive (r=0.95) rezultate na različnih mestih na serijsko izrezanih sosednjihledvicaodseki tkiva. Tretjič, kjer opisujemo pristop za združevanje mikrodisekcije z laserskim zajemanjem, da zmanjšamo količino vhodnega vzorca na 10–40 celic s tehnologijo nano POTS, ki jo sestavlja robotska platforma za natančno obdelavo pikolitrskih volumnov. Naš pristop nam omogoča, da nadzorujemo vhodno število celic in s tem izboljšamo ponovljivost različnih vzorcev glomov in tubulov. Zaradi preprostosti LCM in natančnosti tehnologije nano POTS verjamemo, da bo naša študija omogočila sprejetje proteomike na dragocenih kliničnih vzorcih na ponovljiv način.

cistanche za zdravljenjeledvicafunkcijo

Omejitve te študije vključujejo majhno velikost vzorca in omejitev tkiva, ki nam ni omogočila prostorske validacije tkiva z imunohistokemijo. Da delno ublažimo to omejitev, nudimo integrirano analizo podatkov s podatki scRNA Seq iz istih tkiv, da potrdimo, da proteini, identificirani vledvicapodkompartmente identificiramo tudi v isti izvorni tkivni celici s transkripcijo. Dodatna omejitev je, da nscProteomics identificira omejeno število proteinov, verjetno zaradi majhnega vhodnega materiala, zaradi česar obstaja tveganje, da nekaterih proteinov MS ne bo identificiral, kot bi lahko želel pod mejo zaznavanja z instrumenti. Izboljšanje občutljivosti inštrumenta in ekstrakcije beljakovin iz majhnega vnosa vzorca lahko pomaga izboljšati to trenutno omejitev.

Zavedamo se, da obstaja veliko spremenljivk, ki lahko prispevajo h kakovosti podatkov. Čas shranjevanja, fiksativi FFPE (tj. PFA v primerjavi z glutaraldehidom), čas v fiksativu, čas v zamrzovalniku/na suhem ledu/v tekočem dušiku, pristopi za solubilizacijo beljakovin so nekateri dejavniki, ki bi lahko prispevali k rezultatom proteomike. Pomembno se je zavedati, da tudi biologija dvehledviceni vedno enak in to velja tudi v istih ledvicah kot glomeruli istihledvicabiopsije so lahko v funkcionalnem drugačnem stanju. Histološko,ledvicaoddelki so izjemno heterogeni celo znotraj istega bolezenskega stanja. Z zajemom istih predelov ledvic iz različnih vhodnih vzorcev nscProteomics omogoča zasliševanje heterogenosti znotraj specifičnih subceličnih predelkov, kar je prednost te tehnologije.

Opazili smo, da so nekateri podkompartmentni proteini, ki jih identificira nscProtoemics, potencialno novi glomerularni inproksimalni tubularnibeljakovine. Inovacije v integrativni analizi podatkov z enocelično RNA Seq istegaledvicavzorci, čeprav predhodni, bi zagotovili potrditev, da so ti proteini dejansko lokalizirani na njihove vzorčene/predvidene podregije.

Ta študija ponuja vpogled v neodkrito kompleksnost molekularnih vzorcev vledvicapodpredelke v zdravju in podpira uporabo te tehnologije na vzorcih bolezni ledvic za razumevanje motenj beljakovin v različnih podpredelkih ledvic, ki so lahko prednostno prizadete pri različnih boleznih ledvic. Diferencialna regulacija teh proteinov pri različnih ledvičnih boleznih bi lahko odkrila klinično in prognostično heterogenost v kompleksnih fenotipih glomerularne in tubularne bolezni ter odkrila nove sprožilce poškodbe in okrevanja ledvic. Poleg tega lahko glede na pomanjkanje kakršnih koli zdravil za zaščito ledvic odkrivanje teh novih poti v določenih predelih ledvic zagotovi pomembne nove cilje za racionalno načrtovanje zdravil za obravnavo specifičnih poškodb različnih pododdelkov pri različnih ledvičnih motnjah.

Tako za zaključek predstavljamo potek dela nscproteomics za ravnanje s 10–40ledvicacelice; izboljšanje te tehnologije obljublja zmanjšanje vhodnega materiala v prihodnosti na raven ene celice. Prihodnji razvoj, kot so optimizirane količine obdelave in nadaljnje izboljšave platforme LC-MS, poteka.

Izjava o razpoložljivosti podatkov

Nabore podatkov, ustvarjene za to študijo, lahko najdete v PRIDE PXD015058 in 10.6019/PXD015058.

Avtorski prispevki

TS in MS sta konceptualizirala študijo. TS, JLi, JH, ACS, RZ, YZ, PR, ID, SS, JLu in YY so pomagali pri obdelavi vzorcev in ustvarjanju eksperimentalnih podatkov, TS, PP, SR, AS, W-JQ in MS pa so prispevali pri analizi podatkov in priprava rokopisa. Vsi avtorji so prispevali k članku in potrdili predloženo različico.

financiranje

Sredstva za to delo so bila izLedvicaPrecision Medicine Project, NIDDK NIHUG3 -DK114937 (MS) in R01 DK109720-02 (MS), DP3 DK110844 (W-JQ), R01 DK122160 (W-JQ) in podpora Division of Multi -Presaditev organov (MS).

Nasprotje interesov

Avtorji izjavljajo, da je bila raziskava izvedena v odsotnosti kakršnih koli komercialnih ali finančnih odnosov, ki bi jih lahko razlagali kot potencialno navzkrižje interesov.

Zahvala

Zahvaljujemo se Zoltanu Lasziku in Gyuli Szabo iz UCSF za pomoč pri obdelavi tkiv. Samir Parekh in Brad Rovin z univerze Ohio State (OSU) za sodelovanje pri množičnih specifikacijah na področju proteomike v razsutem stanju in QC za proteomsko tkivo v razsutem stanju, ki si ga delita UCSF in OSU, ter Jeff Hodgin in Matthias Kretzler z univerze v Michiganu za prijazno zagotavljanje dostopa do referencaledvicavzorcev. Nekaj ​​tukaj opisanega eksperimentalnega dela je bilo opravljeno v Laboratoriju za okoljske molekularne znanosti, Pacific Northwest National Laboratory, nacionalni znanstveni uporabniški ustanovi, ki jo sponzorira Ministrstvo za energijo po pogodbi DEAC05-76RL0 1830.

Dodatno gradivo

Dodatno gradivo za ta članek je na voljo na spletnem naslovu: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmed.2020.00499/full#supplementary-material

Okrajšave

nscProteomika, skoraj enocelična proteomika; KPMP,LedvicaProjekt natančne medicine; PT,proksimalni tubularni; Glom, glomerularni; LCM, mikrodisekcija z laserskim zajemom; μPOTS, obdelava mikrolitrov v enem loncu za vzorce sledi; OCT, Optimalna temperatura rezanja; FFPE, s formalinom fiksiran parafin; UM, Univerza v Michiganu; OSU, Ohio State University; DDM, n-dodecil-D-maltozid; scRNA Seq, enocelično zaporedje RNA; IHC, imunohistokemija.

Iz: 'Profiliranje skoraj enocelične proteomike proksimalnega tubula in glomerula normalne človeške ledvice'Tara K. Sigdel¹, Paul D. Piehowski², Sudeshna Roy¹, Juliane Liberto¹, Joshua R. Hansen², Adam C. Swensen², Rui Zhao³, Ying Zhu³, Priyanka Rashmi¹, Andrew Schroeder¹, Izabella Damm¹, Svastika Sur¹, Jinghui Luo⁴, Yingbao Yang⁴, Wei-Jun Qian²* in Minnie M. Sarwal¹* za konzorcij Kidney Precision Medicine Project (KPMP).

---IZVORNI RAZISKOVALNI članek Spredaj. Med., 17. september 2020|https://doi.org/10.3389/fmed.2020.00499

Reference

1. Lee JW, Chou CL, Knepper MA. Globoko sekvenciranje v mikrodiseciranih ledvičnih tubulih identificira transkriptome, specifične za segment nefrona. J Am Soc Nephrol. (2015) 26: 2669–77. doi: 10.1681/ASN.2014111067 PubMed Povzetek|CrossRef Celotno besedilo|Google Učenjak

2. Cisek K, Krochmal M, Klein J, Mischak H. Uporaba multiomike in sistemske biologije za identifikacijo terapevtskih ciljev pri kroničnihledvicabolezen. Presaditev Nephrol Dial. (2016) 31: 2003–11. doi: 10.1093/ndt/gfv364 PubMed Povzetek|CrossRef Celotno besedilo|Google Učenjak

3. Wu H, Humphreys BD. Obljuba enoceličnega sekvenciranja RNA zaledvicapreiskava bolezni. Kidney Int. (2017) 92: 1334–42. doi: 10.1016/j.kint.2017.06.033 PubMed Povzetek|CrossRef Celotno besedilo|Google Učenjak

4. Hohne M, Frese CK, Grahammer F, Dafinger C, Ciarimboli G, Butt L, et al. Proteomi z enim nefronom povezujejo morfologijo in delovanje v proteinurijiledvicabolezen. Kidney Int. (2018) 93: 1308–19. doi: 10.1016/j.kint.2017.12.012 PubMed Povzetek|CrossRef Celotno besedilo|Google Učenjak

5. Wu H, Malone AF, Donnelly EL, Kirita Y, Uchimura K, Ramakrishnan SM, et al. Enocelična transkriptomija človekaledvicavzorec biopsije alogenskega presadka opredeljuje raznolik vnetni odziv. J Am Soc Nephrol. (2018) 29: 2069–80. doi: 10.1681/ASN.2018020125 PubMed Povzetek|CrossRef Celotno besedilo|Google Učenjak

6. Wilson PC, Humphreys BD. Ledvica in organoidna enocelična transkriptomika: konec začetka. Pediater Nephrol. (2019) 35: 191–7. doi: 10.1007/s00467-018-4177-y PubMed Abstract|CrossRef Celotno besedilo|Google Učenjak

7. Wu H, Kirita Y, Donnelly EL, Humphreys BD. Prednosti enojedrnega pred enoceličnim sekvenciranjem RNA odraslihledvica: redke celične vrste in nova celična stanja, razkrita pri fibrozi. J Am Soc Nephrol. (2019) 30: 23–32. doi: 10.1681/ASN.2018090912 PubMed Povzetek|CrossRef Celotno besedilo|Google Učenjak

8. Shen Y, Tolic N, Massillon C, Pasa-Tolic L, Camp DG, Hixson KK, et al. Ultraobčutljiva proteomika z uporabo visoko učinkovite on-line mikro-SPE-nanoLC-nanoESI MS in MS/MS. Anal Chem. (2004) 76: 144–54. doi: 10.1021/ac030096q PubMed Povzetek|CrossRef Celotno besedilo|Google Učenjak

9. Sun L, Zhu G, Zhao Y, Yan X, Mou S, Dovichi NJ. Ultra občutljiva in hitra analiza od spodaj navzgor femtogramskih količin kompleksnih proteomskih prebav. Angew Chem Int Ed Engl. (2013) 52: 13661–4. doi: 10.1002/anie.201308139 PubMed Povzetek|CrossRef Celotno besedilo|Google Učenjak

10. Zhu Y, Piechowski PD, Zhao R, Chen J, Shen Y, Moore RJ, et al. Platforma za obdelavo nanokapljic za globoko in kvantitativno profiliranje proteoma 10-100 celic sesalcev. Nat Commun. (2018) 9:882. doi: 10.1038/s41467-018-03367-w

PubMed Povzetek|CrossRef Celotno besedilo|Google Učenjak

11. Xu K, Liang Y, Piechowski PD, Dou M, Schwarz KC, Zhao R, et al. Potek obdelave vzorcev, ki je združljiv s stacionarnimi računalniki, za profiliranje proteoma<100 mammalian="" cells.="" anal="" bioanal="" chem.="" (2018)="" 411:4587–96.="" doi:="">

PubMed Povzetek|CrossRef Celotno besedilo|Google Učenjak

12. Waanders LF, Chwalek K, Monetti M, Kumar C, Lammert E, Mann M. Kvantitativna proteomska analiza posameznih otočkov trebušne slinavke. Proc Natl Acad Sci USA. (2009) 106: 18902–7. doi: 10.1073/pans.0908351106 PubMed Povzetek|CrossRef Celotno besedilo|Google Učenjak

13. Wisniewski JR, Ostasiewicz P, Mann M. FASP z visoko stopnjo okrevanja, uporabljen pri proteomski analizi rakavih tkiv, vgrajenih v mikrodisecirani formalin fiksiranih v parafin, pridobi znane označevalce raka debelega črevesa. J Proteome Res. (2011) 10:3040–9. doi: 10.1021/pr200019m PubMed Povzetek|CrossRef Celotno besedilo|Google Učenjak

14. Chen Q, Yan G, Gao M, Zhang X. Ultrasenzitivno profiliranje proteoma za 100 živih celic z neposrednim vbrizgavanjem celic, spletno prebavo in nano-LC-MS/MS analizo. Anal Chem. (2015) 87: 6674–80. doi: 10.1021/acs.analchem.5b00808 PubMed Povzetek|CrossRef Celotno besedilo|Google Učenjak

15. Li S, Plouffe BD, Belov AM, Ray S, Wang X, Murthy SK, et al. Integrirana platforma za izolacijo, obdelavo in proteomsko profiliranje redkih celic v polni krvi na osnovi masne spektrometrije. Proteomika celic Mol. (2015) 14: 1672–83. doi: 10.1074/MCP.M114.045724 PubMed Povzetek|CrossRef Celotno besedilo|Google Učenjak

16. Chen W, Wang S, Adhikari S, Deng Z, Wang L, Chen L, et al. Enostavna in integrirana tehnologija na osnovi vrtljive konice, ki se uporablja za globoko profiliranje proteoma. Anal Chem. (2016) 88: 4864–71. doi: 10.1021/acs.analchem.6b00631 PubMed Povzetek|CrossRef Celotno besedilo|Google Učenjak

17. Huang EL, Piechowski PD, Orton DJ, Moore RJ, Qian WJ, Casey CP, et al. SNaPP: poenostavljena nanoproteomska platforma za ponovljivo globalno proteomsko analizo nanogramskih količin beljakovin. Endokrinologija. (2016) 157: 1307–14. doi: 10.1210/en.2015-1821 PubMed Abstract|CrossRef Celotno besedilo|Google Učenjak

18. Steffes MW, Schmidt D, McCrery R, ​​Basgen JM, Mednarodna študija diabetične nefropatije G. Število glomerularnih celic pri normalnih osebah in pri bolnikih s sladkorno boleznijo tipa 1.LedvicaInt. (2001) 59: 2104–13. doi: 10.1046/j.1523-1755.2001.00725.x

PubMed Povzetek|CrossRef Celotno besedilo|Google Učenjak

19. Tyanova S, Temu T, Cox J. Računalniška platforma MaxQuant za proteomiko puške na osnovi masne spektrometrije. Nat Protoc. (2016) 11: 2301–19. doi: 10.1038/nprot.2016.136 PubMed Povzetek|CrossRef Celotno besedilo|Google Učenjak

20. Perez-Riverol Y, Csordas A, Bai J, Bernal-Llinares M, Hewapathirana S, Kundu DJ, et al. Podatkovna baza PRIDE in sorodna orodja ter viri v letu 2019: izboljšanje podpore za kvantificiranje podatkov. Nucleic Acids Res. (2019) 47: D442–50. doi: 10.1093/var/gky1106 PubMed Povzetek|CrossRef Celotno besedilo|Google Učenjak

21. Standard I. Osnovna metoda za določanje ponovljivosti in obnovljivosti standardne merilne metode, Točnost (resničnost in natančnost) merilnih metod in rezultatov. Int Organ Standard Part. (1994) 2:5725.

22. Bland JM, Altman DG. Statistične metode za oceno ujemanja med dvema metodama kliničnega merjenja. Lanceta. (1986) ​​1:307–10. doi: 10.1016/S0140-6736(86)90837-8 PubMed Povzetek|CrossRef Celotno besedilo|Google Učenjak

23. Lundgren DH, Hwang SI, Wu L, Han DK. Vloga spektralnega štetja v kvantitativni proteomiki. Expert Rev Proteomics. (2010) 7: 39–53. doi: 10.1586/epr.09.69 PubMed Povzetek|CrossRef Celotno besedilo|Google Učenjak

24. Webb-Robertson BJ, Mccue LA, Waters KM, Matzke MM, Jacobs JM, Metz TO, et al. Kombinirane statistične analize intenzivnosti peptidov in pojavljanja peptidov izboljšajo identifikacijo pomembnih peptidov iz podatkov proteomike na osnovi MS. J Proteome Res. (2010) 9: 5748–56. doi: 10.1021/pr1005247 PubMed Povzetek|CrossRef Celotno besedilo|Google Učenjak

25. Uhlen M, Fagerberg L, Hallstrom BM, Lindskog C, Oksvold P, Mardinoglu A, et al. Proteomika. Tkivni zemljevid človeškega proteoma. Znanost. (2015) 347:1260419. doi: 10.1126/science.1260419 PubMed Povzetek|CrossRef Celotno besedilo|Google Scholar 26. Schroeder AW, Sur S, Rashmi P, Damm I, Zarinsefat A, Kretzler M, et al. Roman ČlovekLedvicaPodmnožice celic, identificirane z Mux-Seq. bioRxiv [Prednatis]. (2020) doi: 10.1101/2020.03.02.973925 CrossRef Celotno besedilo|Google Učenjak

27. Marx V. Sanje o enocelični proteomiki. Nat metode. (2019) 16: 809–12. doi: 10.1038/s41592-019-0540-6 PubMed Abstract|CrossRef Celotno besedilo|Google Učenjak

28. Song L, Fang Fang, Liu P, Zeng G, Liu H, Zhao Y, et al. Kvantitativna proteomika za spremljanje poškodbe ledvičnega presadka. Proteomics Clin Appl. (2020) 14:e1900036. doi: 10.1002/prca.201900036

PubMed Povzetek|CrossRef Celotno besedilo|Google Učenjak