Krüpplovemu faktorju 6 posredovana izguba katabolizma BCAA prispeva k poškodbi ledvic pri miših in ljudeh

edmund.chen@wecistanche.com

Spremenjen celični metabolizem vledvicacelice proksimalnih tubulov (PT) igrajo ključno vlogo pri akutnempoškodba ledvic (AKI). Transkripcijski faktor Krüppelu podoben faktor 6 (KLF6) se hitro in robustno inducira zgodaj v PT po AKI. Ugotovili smo, da PT-specifični knockdown Klf6 (Klf6PTKD) ščiti pred AKI inledvicafibroza pri miših. Kombinirana analiza sekvenciranja imunoprecipitacije RNA in kromatina je pokazala, da je bila ekspresija genov, ki kodirajo katabolne encime aminokislin z razvejeno verigo (BCAA), ohranjena pri miših Klf6PTKD, pri čemer KLF6 zaseda promotorsko regijo teh genov. Nasprotno pa je inducibilna čezmerna ekspresija KLF6 zavrla izražanje genov BCAA in poslabšalapoškodba ledvicin fibrozo pri miših. In vitro so poškodovane celice s prekomerno ekspresijo KLF6 imele podobno zmanjšanje ekspresije katabolnega gena BCAA in so bile manj sposobne uporabiti BCAA. Poleg tega je knockdown BCKDHB, ki kodira eno podenoto encima, ki omejuje hitrost v katabolizmu BCAA, povzročil zmanjšano proizvodnjo ATP, medtem ko je zdravljenje z ojačevalcem katabolizma BCAA BT2 povečalo presnovo. Analizadelovanje ledvic, KLF6 in izražanje genov BCAA pri kroničnem človekubolezni ledvicbolniki so pokazali pomembne inverzne korelacije med KLF6 in obemadelovanje ledvic in izražanje BCAA. Tako lahko ciljanje na KLF6-posredovano zaviranje katabolizma BCAA služi kot ključni terapevtski cilj pri AKI inledvicafibroza.

CISTANCHE BO IZBOLJŠAL LEDVIČNO/LEDVIČNO OKVARJO

kroničnobolezni ledvic(CKD) povzroča znatno obolevnost in umrljivost in ima prevalenco pri odrasli populaciji ZDA približno 15 odstotkov. CKD je lahko posledica ponavljajočih se napadov akutnegapoškodba ledvic(AKI), ki jih je mogoče pripisati okoljskim ali strupenim vplivom ali so posledica drugih bolezni ali njihovega zdravljenja. V večini primerov je proksimalni tubul (PT) primarno mesto poškodbe pri AKI, saj so zaradi visoke presnovne aktivnosti celic PT dovzetne za ishemične poškodbe, njihova vloga pri izločanju zdravil in toksinov pa zahteva pretok potencialno škodljivih povzročiteljev preko celic PT (1). En tak razred učinkovin so kemoterapevtiki, ki poškodujejo DNA, ki se kopičijo v celicah PT in povzročajo AKI in izgubo nefrona. Po poškodbi celice PT dediferencirajo in izločajo topne faktorje, kot so člani družine Wnt in Hedgehog ter citokini (1–4). Preživele dediferencirane PT celice lahko ponovno vstopijo v celični cikel in se razmnožijo, da popravijo poškodovano PT, čemur sledi rediferenciacija v popolnoma funkcionalne PT celice (2). Vendar pa se celice, ki so namesto tega podvržene zaustavitvi celičnega cikla na kontrolni točki G2/M, morda ne bodo opomogle, kar vodi do atrofije in povečane regulacije profibrotičnega signaliziranja (5), ki sproži fibrozo s spodbujanjem diferenciacije rezidenčnih fibroblastov v miofibroblaste, ki izločajo proteine ​​zunajceličnega matriksa, in novačenje imunskih celic, kot so makrofagi in celice T (1).

Ključne besede:ledvice; akutna poškodba ledvic; proksimalni tubul; transkripcijski faktor; aminokisline z razvejano verigo

Poleg induciranja patogenih signalnih poti poškodovane PT celice kažejo tudi drastično spremenjen celični metabolizem. Nepoškodovane celice PT so za proizvodnjo ATP močno odvisne od mitohondrijske oksidacije maščobnih kislin, cikla trikarboksilne kisline (TCA) in oksidativne fosforilacije. Vendar pa je v primeru poškodbe oksidacija maščobnih kislin potlačena z le skromno kompenzacijsko povečano regulacijo glikolize, tako da se skupne ravni ATP zmanjšajo pri poškodovanem PT (6). Poleg tega je zaviranje oksidacije maščobnih kislin in vitro povzročilo dediferenciacijo in apoptozo tubularnih epitelijskih celic, in vivo pa poslabšalopoškodba ledvicpo zdravljenju s folno kislino (6). Zanimivo je, da lahko povečana regulacija mitohondrijske oksidacije maščobnih kislin ali peroksisomske oksidacije maščobnih kislin (FAO) zaščiti predpoškodba ledvic(6, 7), kar kaže, da je lahko ohranitev celičnega metabolizma terapevtski cilj pri AKI. Transkriptomske študije v biopsijah ledvic s kronično ledvično boleznijo pri ljudeh in po ishemični reperfuzijski poškodbi (IRI) pri miših kažejo neregulirano presnovo maščobnih kislin in presnovo aminokislin (6, 8). Čeprav je bila vloga oksidacije maščobnih kislin PT že opisana v AKI, je treba vlogo presnove aminokislin PT pri AKI še raziskati. Poleg tega so bili mehanizmi poškodbe PT, opisani do danes, v veliki meri raziskani z uporabo mišjih modelov z izločitvijo in prekomerno ekspresijo posameznih signalnih molekul, vendar mehanizmi, po katerih so globalne poti, tako fibrotične/vnetne kot presnovne, in preklop med normalnim okrevanjem in atrofijo urejeni pri AKI niso dobro opredeljeni.

Transkripcijski faktorji delujejo kot glavni regulatorji temeljnih bioloških procesov zaradi svoje zmožnosti uravnavanja izražanja več spodnjih ciljev in oblikovanja povratnih zank. Pri AKI so dobro raziskani transkripcijski faktorji, kot so družinski člani FOS in JUN, zelo regulirani. Nedavne študije molekularnih odzivov na IRI v človeških vzorcih in translacijskega profiliranja PT po enostranski ureterični obstrukciji (UUO) pri miših so identificirale tudi transkripcijski faktor cinkovega prsta Krüppelu podoben faktor 6 (KLF6) kot podoben gen za zgodnji odziv na poškodbe (9, 10). ). KLF sestavljajo družino transkripcijskih faktorjev cinkovega prsta z visoko ohranjenimi C-terminalnimi vezavnimi domenami DNA in variabilnimi N konci, ki so široko izraženi, tudi vledvica(11). KLF6 ima vlogo pri številnih procesih, kot so celična proliferacija in diferenciacija, apoptoza, odzivi na poškodbe DNA in delovanje mitohondrijev (12) in je bilo ugotovljeno, da igra vlogo pri jetrih, srcu inledvicafibrozo, z učinki, odvisnimi od konteksta (13, 14). Znotrajledvica, KLF6 se izraža v glomerulnih podocitih in je bistveni regulator mitohondrijske funkcije v okolju žariščne segmentne glomeruloskleroze (FSGS) (15). Poleg izražanja v glomerularnih podocitih se KLF6 spremenljivo izraža tudi v PT, vendar njegova vloga v celicah PT, bodisi pri normalnem delovanju ali po poškodbi, ni razumljena. Prekomerna ekspresija KLF6 v celicah HK-2 je povzročila dediferenciran fenotip z zmanjšano ekspresijo E-kadherina in povečano ekspresijo vimentina ter povzročila tudi povečano ekspresijo makrofagnega vnetnega proteina-3 (16). Poleg tega se je izražanje KLF6 povečalo kot odziv na visoko glukozo in ta učinek je bil blokiran s knockdownom TGFB1 ali zdravljenjem z nevtralizirajočim protitelesom TGF- 1. Neposredno zdravljenje s TGF- 1 je prav tako povzročilo izražanje KLF6, kar kaže na možno pozitivno povratno zanko v celicah HK-2 (16). Pokazalo se je tudi, da je KLF6 induciran v rakavih celicah in vitro s subapoptotičnimi odmerki kemoterapevtskega zdravila cisplatina, ki poškoduje DNA (17). Za določitev vloge PT KLF6 pri odzivu na poškodbo DNK smo uporabili naravno prisoten toksin aristolohično kislino I (AAI). Nefropatija, povezana z AAI, je klinično pomembna (18), toksičnost AAI pa je zelo specifična za PT, kar omogoča preučevanje vloge PT KLF6 posebej pri odzivu na poškodbo PT. Poleg tega AAI zanesljivo povzroči AKI in prehod v fibrozo pri miših, v nasprotju z večino režimov zdravljenja s cisplatinom (19). AAI vstopi v celice PT preko bazolateralnih prenašalcev organskih anionov (OAT) 1 do 3 in ima tako genotoksične učinke, prek tvorbe aduktov aristolaktam (AL)-DNA, kot citotoksične učinke, ki povzročajo poškodbe mitohondrijev, ki ustvarjajo reaktivne kisikove spojine, in posebej zavirajo normalno Funkcije PT, kot je receptorsko posredovana endocitoza (18–20). Tukaj z modulacijo ekspresije KLF6 posebej v PT s študijami povečanja in izgube funkcije pri miših dokazujemo, da KLF6-posredovana supresija katabolizma aminokislin z razvejeno verigo (BCAA) prispeva k AKI in slediledvicafibroza.

Rezultati

Zdravljenje z AAI poveča ledvično PT izražanje Klf6. Ker se več članov družine KLF izraža v epitelijskih celicah vledvica(21) smo sprva izvedli qRT-PCR za te epitelne Klf vledvicakorteks, pobran 24 ur po enkratnem odmerku PT-specifičnega toksina, AAI, v primerjavi z vehiklom (dimetil sulfoksid [DMSO]) pri miših C57BL/6. Klf4, Klf5 in Klf6 so bili znatno regulirani navzgor, medtem ko je bil Klf15 znatno znižan (slika 1A), te spremembe v izražanju genov pa so se pojavile pred znatnim dvigom serumskega kreatinina (slika 1B). Da bi ugotovili, ali je povečana regulacija Klf6 prehodna ali podaljšana, smo dajali AAI v več injekcijah 3 dapart za dve injekciji ali 3 tedne (aktivna faza) ali 3 tedne, ki so ji sledili 3 tedne brez AAI (faza preoblikovanja) (slika 1C) . PT je ostal nedotaknjen 24 ur po eni injekciji, toda po dveh injekcijah so celice PT doživele celično smrt, miši, zdravljene z več odmerki AAI, pa so pokazale izgubo PT, vnetne infiltrate, beljakovine

odlitke in fibrozo na koncu faze remodeliranja (slika 1D). Ekspresija Klf6 je ostala znatno povišana v aktivni fazi in fazi preoblikovanja poškodbe (slika 1E), kar kaže na vlogo KLF6 v akutni in fibrotični fazi poškodbe. KLF6 se izraža v glomerularnih, tubularnih in vnetnih celicah in za določitev prispevka PT-specifične ekspresije Klf6 k opaženemu povečanju ekspresije Klf6 v ledvični skorji smo izvedli sekvenciranje RNA (RNA-seq) v mikrodiseciranih segmentih S2/S3 PT 24 h po eni injekciji AAI, pred izgubo celic PT. Klf6 je bil močno reguliran navzgor na ravni, primerljivi z dobro znanima transkripcijskima faktorjema zgodnjega odziva Fos in Jun, kar kaže, da zgodnja indukcija ekspresije Klf6 messenger RNA (mRNA) vledvicapoganja njegovo izražanje v celicah PT (slika 1F). Te ugotovitve so skladne z nedavno objavljenimi podatki o enocelični/jedrski RNA-seq, ki kažejo povečano regulacijo Klf6 v celicah PT pri poškodovani mišji in človekuledvice(22, 23). Končno je podatkovno rudarjenje ekspresijskih nizov iz predhodno poročanih študij časovnega poteka IRI (8) potrdilo zgodnjo indukcijo izražanja KLF6 v 2 urah po AKI, podobno kot Fos in Jun (slika 1G). Ti podatki kažejo, da je Klf6 zgodnji inducibilni gen odziva na poškodbe po zdravljenju s PT-specifičnim toksinom AAI in po IRI in ostaja povišan kljub prenehanju AAI.

PT-specifična izguba KLF6 zmanjša poškodbo ledvic v aktivni fazi in fazi preoblikovanja po zdravljenju z AAI.Da bi ugotovili prispevek PT-specifičnega KLF6 k poškodbi, ki jo povzroča AAI, smo ustvarili miši s PT-specifičnim knockdownom Klf6 (Klf6PTKD) s križanjem Klf6fl/fl miši (24) z mišmi Pepck-Cre (25). Klf6PTKD miši so bile sposobne preživetja in plodne, z znatnim padcem ekspresije proteina KLF6, specifičnega za PT, vendar brez sprememb v ekspresiji mRNA Klf6 v jetrih v primerjavi z mišmi Klf6fl/fl (Dodatek SI, slika S1 A–C). Nobenih očitnih razlik ni biloledvicahistologija ali funkcija med mišmi Klf6fl/fl in Klf6PTKD pri starosti 24 tednov (dodatek SI, slika S1 D in E) in ravni izražanja OAT 1 do 3 (Slc22a6, Slc22a7 in Slc22a8), pot vstopa AAI PT, se niso bistveno razlikovale (Dodatek SI, slika S1F).

Kontrolne miši (Klf6fl/fl) in Klf6PTKD so bile zdravljene z vehiklom (DMSO) ali 3 mg/kg AAI intraperitonealno vsake 3 d 3 tedne in evtanazirane 3 d po zadnji injekciji AAI za oceno aktivne faze poškodbe ali 3 tedne po zadnja injekcija AAI za oceno faze preoblikovanja poškodbe (slika 1C). Miši Klf6fl/fl in Klf6PTKD so imele podobne količine aduktov AL-DNA tako po eni injekciji kot na koncu aktivne faze in faze preoblikovanja (dodatek SI, slika S1 G in H), kar kaže na podoben PT privzem AAI in popravilo AL -DNA adukti pri miših Klf6fl/fl in Klf6PTKD. Med injiciranjem so miši, ki so prejemale AAI, izgubile težo v primerjavi s tistimi, ki so prejemale DMSO, s podobnim zmanjšanjem za ~18 odstotkov od izhodišča pri miših Klf6fl/fl in Klf6PTKD ob končnem injiciranju AAI, čemur je sledilo ponovno pridobivanje podobnih količin telesne teže ( Dodatek SI, slika S2A).Ledvicateže glede na začetno (dan 0) telesno težo so bile podobne med mišmi Klf6fl/fl in Klf6PTKD, zdravljenimi z DMSO in AAI, na koncu aktivne faze (Dodatek SI, slika S2B). V fazi prenove oz.ledviceiz miši Klf6fl/fl, zdravljenih z AAI, so tehtale znatno manj kot tiste iz miši, zdravljenih z DMSO, toda pri miših Klf6PTKD, zdravljenih z AAI,ledvicauteži so bile ohranjene (Dodatek SI, slika S2B).Delovanje ledvicje bila ocenjena z merjenjem koncentracije serumskega kreatinina (slika 2A) in dušika iz sečnine (slika 2B). Koncentracije serumskega kreatinina in sečninskega dušika so bile znatno povišane pri miših, ki so prejemale AAI, v primerjavi z DMSO; vendar so bila zvišanja znatno manjša pri miših Klf6PTKD v primerjavi z mišmi Klf6fl/fl (sl. 2 A in B). Histološka analiza z uporabo hematoksilina in eozina ter Schiffovega barvanja s periodično kislino je pokazala, da so miši Klf6fl/fl in Klf6PTKD, zdravljene z AAI, imele izločajoče tubule z ostanki bazalne membrane, vnetne infiltrate, ki so bili pretežno lokalizirani v

zunanjo skorjo in več beljakovinskih odlitkov v skorji in meduli (sl. 2 C in D). Vendar so bile te lastnosti manj hude pri miših Klf6PTKD v primerjavi z mišmi Klf6fl/fl, z ohranitvijo tubulov in manjšimi vnetnimi infiltrati. Analiza območja PT je bila opravljena z uporabo fluorescentnega obarvanja z lotusovim lektinom za identifikacijo nedotaknjenih robov čopičev PT v popolnoma diferenciranih celicah PT in imunofluorescence za citokeratin-20 (KRT-20) za identifikacijo poškodovanih PT (8). V primerjavi z mišmi, zdravljenimi z DMSO, so miši Klf6fl/fl in Klf6PTKD, zdravljene z AAI, imele znatno izgubo zrelega PT, kar je razvidno iz izgube obarvanja Lotusovega lektina in indukcije izražanja KRT-20, kar kaže na poškodbo PT v obeh aktivne faze in faze preoblikovanja (slika 2E in dodatek SI, slika S2C). Miši Klf6PTKD, zdravljene z AAI, so imele pomembno ohranjenost zrele PT v primerjavi z mišmi Klf6fl/fl, ki so jo spremljale podobne stopnje indukcije KRT- 20 v aktivni fazi in fazi preoblikovanja. Trikromno obarvanje faze remodeliranjaledviceje pokazala obsežno odlaganje fibrotičnega materiala pri miših Klf6fl/fl, z znatno manj fibroze pri miših Klf6PTKD (slika 2F, modro obarvanje; dodatek SI, tabela S1). Odlaganje fibrotične matrične komponente kolagena I, odkrito z imunofluorescenco (slika 2G in dodatek SI, slika S2D), je pokazalo, da je bil kolagen I znatno povečan pri miših Klf6fl/fl z AAI, ne pa tudi pri miših Klf6PTKD z AAI v primerjavi z DMSO v aktivno fazo. V fazi preoblikovanja se je kolagen I znatno povečal pri miših Klf6fl/fl in Klf6PTKD z AAI, z bistveno nižjo odstotno površino pri miših Klf6PTKD z AAI v primerjavi z mišmi Klf6fl/fl z AAI. Intersticijske vnetne celice, sestavljene iz CD68 in makrofagov ter GR-1 in mieloidnih monocitov, so bile prisotne v Klf6fl/fl

in miši Klf6PTKD, ki so bile zdravljene z AAI, vendar so bile bistveno manj pri miših Klf6PTKD tako v aktivni fazi kot fazi preoblikovanja (slika 2H). Tako izguba PT-specifičnega KLF6 ščiti pred poškodbo PT, ki jo povzroči AAI, fibrozo in vnetjem, kljub prisotnosti podobnih količin aduktov AL-DNA v primerjavi s kontrolnimi mišmi, zdravljenimi z AAI. PT-specifična izguba KLF6 zmanjša vnetno signalizacijo in ohranja celični metabolizem po zdravljenju z AAI. Skušali smo razumeti mehanizme, s katerimi izguba PT KLF6 ščiti pred poškodbami, zato smo se lotili RNA-seq ofledvicacortex in Klf6fl/fl and Klf6PTKD mice treated with DMSO or AAI in the active phase or remodeling phase. Significantly differentially expressed genes were defined as having a >1.5- ali<0.67-fold change="" and="" false="" discovery="" rate="" of=""><0.05 in="" any="" given="" pairwise="" genotype="" or="" treatment="" comparison.="" a="" combined="" total="" of="" 7,673="" genes="" were="" found="" to="" be="" differentially="" expressed="" as="" a="" result="" of="" all="" the="" pairwise="" comparisons,="" and="" hierarchical="" clustering="" showed="" these="" to="" group="" into="" two="" main="" clusters:="" genes="" that="" were="" induced="" in="" response="" to="" aai="" treatment="" and="" genes="" that="" were="" suppressed="" in="" response="" to="" aai="" treatment="" (si="" appendix,="" fig.="" s3a="" and="" dataset="" s1).="" unbiased="" analysis="" of="" transcriptional="" effects="" of="" aai="" treatment="" in="" klf6fl/fl="" mice="" by="" undertaking="" pathway="" enrichment="" analysis="" showed="" that="" the="" most="" significantly="" upregulated="" pathways="" were="" predominantly="" inflammatory="" and="" ecm/="" cell="" adhesion="" pathways="" (e.g.,="" cytokine/chemokine="" signaling)="" and="" integrin/focal="" adhesion="" pathways,="" respectively="" (si="" appendix,="" fig.="" s3="" b="" and="" c).="" markers="" of="" cellular="" senescence,="" including="" components="" of="" the="" senescence-associated="" secretory="" phenotype,="" were="" also="" upregulated="" after="" aai="" treatment="" (si="" appendix,="" fig.="" s3d),="" but="" the="" overall="" pathway="" was="" not="" differentially="" expressed="" between="" klf6fl/fl="" and="" klf6ptkd="" mice.="" in="" general,="" these="" pathways="" were="" less="" significantly="" up-regulated="" in="" the="" remodeling="" phase="" compared="" to="" the="" active="" phase.="" the="" most="" significantly="" down-regulated="" pathways="" after="" aai="" were="" metabolic="" pathways,="" including="" fatty="" acid–="" and="" amino="" acid–related="" pathways;="" these="" pathways="" were="" similarly="" or="" slightly="" less="" significantly="" decreased="" in="" the="" remodeling="" phase="" compared="" to="" the="" active="" phase="" (si="" appendix,="" fig.="" s3="" b,="" e,="" and="" f).="" similar="" to="" other="" studies,="" genes="" encoding="" enzymes="" involved="" in="" anerobic="" glycolysis="" were="" up-regulated="" after="" aai="" (26,="" 27)="" (si="" appendix,="" fig.="">

Da bi določili poti, ki jih potencialno neposredno in posredno uravnava KLF6, smo nadalje analizirali diferencialno izražene gene tako, da smo jih razvrstili na podlagi prisotnosti in lokacije vezavnih mest KLF6, z uporabo podatkov KLF6 imunoprecipitacijskega sekvenciranja kromatina (ChIP-Seq) iz projekta Enciklopedije elementov DNA . Geni razreda 2 so bili opredeljeni tako, da imajo vsaj 1 vezavno mesto KLF6 znotraj ±1 kb od mesta začetka transkripcije (TSS), geni razreda 1 pa imajo vsaj 1 vezavno mesto KLF6 med ±1 in 10 kb od Geni TSS in razreda 0 nimajo vezavnega mesta KLF6 znotraj ±10 kb od TSS. Bilo je 538 genov, ki so bili regulirani navzgor pri miših Klf6fl/fl in bistveno zmanjšano regulirani pri miših Klf6PTKD v primerjavi z mišmi Klf6fl/fl v aktivni fazi. Analiza obogatitve poti teh 538 genov je pokazala, da so bile poti, povezane s prirojenim imunskim (npr. TYROBP, fagosomom in makrofagom), in celično adhezijo (npr. integrin, žariščna adhezija) znatno obogatene (slika 3A). Razvrstitev genov glede na vezavna mesta KLF6 je pokazala, da večina DEG (428/538) ni imela vezavnih mest KLF6 (razred 0), analiza obogatitve genov razreda 2 (72) in genov razreda 0 ločeno je pokazalo, da je bil pomen teh poti močno odvisen od genov razreda 0, kar kaže, da je nižja ekspresija teh genov pri miših Klf6PTKD verjetno posredni učinek manjše poškodbe PT kot posledica PT specifičnega knockdown Klf6 (slika 3A).

CISTANCHE BO IZBOLJŠAL DELOVANJE LEDVIC/LEDVIC

Bilo je 388 genov, ki so bili znižano regulirani pri miših Klf6fl/fl in znatno ohranjeni (navzgor regulirani) pri Klf6PTKD v primerjavi z mišmi Klf6fl/fl. Analiza obogatitve poti je pokazala, da ti geni predstavljajo presnovne poti, pri čemer sta vidna presnova aminokislin in presnova maščobnih kislin (slika 3B in dodatek SI, slika S4). Obogatitvena analiza genov razreda 2 (1{{10}}3) in genov razreda 0 (246) je pokazala, da kljub temu, da ima samo ∼25 odstotkov genov vezavna mesta KLF6 znotraj ±1 kb od TSS ( razreda 2), je bila ta podskupina genov gonilo za zelo pomembne vrednosti P teh poti. Presenetljivo je, da so bile presnovne poti specifičnih aminokislin (Val, Leu in Ile [BCAA] ter Gly, Ser in Thr) enako pomembne, ko so bili analizirani samo geni razreda 2, kar kaže na potencialno neposredno regulacijo teh poti s KLF6 (slika 3B) . Nasprotno pa so velik pomen presnovnih poti maščobnih kislin in signalne poti PPAR v veliki meri poganjali geni razreda 0, kar kaže na posredno ohranitev teh poti kot rezultat PT-specifičnega knockdowna Klf6. Analiza obogatitve genskega niza za specifične presnovne poti Kjotske enciklopedije genov in genomov (KEGG) (razgradnja maščobnih kislin, metabolizem aminokislin, cikel TCA in glikoliza) z uporabo vseh različno reguliranih genov je potrdila, da so ti znatno regulirani (ohranjeni) v Klf6PTKD v primerjavi z mišmi Klf6fl/fl (slika 3C).

Indukcija KLF6 poslabšaPoškodba ledvicin zavira BCAA katabolne gene po zdravljenju z AAI. Da bi ugotovili, ali bi prekomerno izražanje KLF6 imelo nasprotne učinke, smo uporabili sistem "tet-on" za ustvarjanje mišjega modela z izražanjem človeškega KLF6 (hKLF6OE; dvojno transgeni CAG-rtTA, TRE-hKLF6), induciranega z doksiciklinom (DOX). miši) (Dodatek SI, slika S5A). Miši hKLF6OE so imele močno indukcijo izražanja hKLF6 po dodatku diete z DOX 7 dni brez bistvenih razlik v izražanju mišjega Klf6 (dodatek SI, slika S5B) inledviceniso pokazale očitne histološke poškodbe ali izgubedelovanje ledvicpo neprekinjenem zdravljenju z DOX 15 tednov (Dodatek SI, slika S5 C in D) v primerjavi s kontrolnimi mišmi (TRE-hKLF6 z zdravljenjem z DOX). Vendar, da bi ugotovili, ali je indukcija hKLF6 v PT poslabšala AKI inledvicafibrozo, hKLF6OE in kontrolne miši so bile zdravljene z nižjim odmerkom 1 mg/kg AAI ali DMSO vsake 3 dni 2 tedna, čemur je sledila evtanazija po 3 nadaljnjih dneh (aktivna faza) ali 2 nadaljnjih tednih (faza preoblikovanja) (SI dodatek, slika .S6A). Kontrolne miši in miši hKLF6OE, ki so prejemale AAI, so izgubile podobne količine telesne teže (dodatek SI, slika S6B) inledvicauteži so bile podobne med vsemi skupinami (Dodatek SI, slika S6C). Miši hKLF6OE so imele znatno povišan serumski kreatinin in sečninski dušik v primerjavi s kontrolnimi mišmi po zdravljenju z AAI v aktivni fazi (sliki 4 A in B). To je spremljala izguba zrelega PT z večjim deležem KRT-20–pozitivnega PT, ki se je poslabšala pri miših hKLF6OE na obeh časovnih točkah (sl. 4 C–E in dodatek SI, sl. S6D) in povečala fibroza v obeh fazah (slika 4F in dodatek SI, slika S6E). Analiza qRT-PCR genov, ki kodirajo encime v presnovni poti BCAA, je pokazala supresijo genov BCAA po zdravljenju z AAI pri kontrolnih miših in miših hKLF6OE, z nadaljnjo supresijo pri miših hKLF6OE v primerjavi s kontrolnimi mišmi (slika 4G). Poleg tega je bila ekspresija več genov BCAA bodisi znatno zmanjšana (Hibch) bodisi je pokazala trend k nižji ekspresiji pri hKLF6OE v primerjavi s kontrolnimi mišmi tudi brez zdravljenja z AAI (obdelane z DMSO) (slika 4G). Ti podatki kažejo, da indukcija hKLF6 pri odraslih miših povzročiledvicabolj dovzetni za AKI in morebitno fibrozo s pomembno disregulacijo genov, ki kodirajo katabolizem BCAA.

Indukcija KLF6 zavira katabolizem BCAA, ki je pomemben substrat za proizvodnjo ATP in vitro.Mitohondrijski BCAA katabolizem lahko prispeva k oksidativni fosforilaciji s proizvodnjo acetil-CoA in sukcinil-CoA (Dodatek SI, slika S4B). Da bi raziskali, ali KLF6 uravnava BCAA in celični metabolizem in vitro, smo najprej ocenili izražanje presnovnih genov BCAA v celicah HK-2 s prekomerno ekspresijo KLF6 (KLF6-OE), z ali brez zdravljenja z AAI. Tako kot pri miših hKLF6OE je čezmerna ekspresija KLF6 samo v celicah HK-2 povzročila trend k supresiji več genov, ki kodirajo encime BCAA, zlasti BCKDHB. Obdelava kontrolnih celic KLF6-Con s 25 µM AAI za 6 h je pomembno zavrla ekspresijo več encimov, ti pa so bili dodatno zatrti v celicah KLF6-OE, obdelanih z AAI (slika 5A). Za

Slika 3. Izguba KLF6 zavira profibrotične poti in ohranja presnovne poti po zdravljenju z AAI. (A) Klasifikacija in analiza obogatitve poti genov, reguliranih navzgor pri miših Klf6fl/fl po AAI, vendar znatno manj reguliranih na miših Klf6PTKD po AAI glede na razred veznih mest: razred 2 z večjim ali enakim 1 vezavnim mestom KLF6 znotraj ±1 kb TSS; razred 1 z večjim ali enakim 1 veznim mestom KLF6 pri ±1 do 10 kb od TSS; in razred 0 brez veznega mesta KLF6 znotraj ± 10 kb od TSS. (B) Klasifikacija in analiza obogatitve poti genov, ki so bili znižano regulirani pri miših Klf6fl/fl po AAI, vendar znatno manj znižani (tj. ohranjeni) pri miših Klf6PTKD po AAI glede na razred vezavnih mest: razred 2 z večjim ali enakim 1 vezavno mesto KLF6 znotraj ±1 kb TSS; razred 1 z večjim ali enakim 1 veznim mestom KLF6 pri ±1 do 10 kb od TSS; in razred 0 brez veznega mesta KLF6 znotraj ±10 kb od TSS. (C) Grafi analize obogatitve genskega niza z uporabo vseh različno izraženih genov za razgradnjo maščobnih kislin KEGG (FA DEGRAD), metabolizem aminokislin (AA METAB) in cikel TCA (KEGG_TCA).

ugotovili, ali je ta supresija izražanja genov BCAA v prisotnosti AAI povzročila spremembe v katabolizmu BCAA, smo izmerili znotrajcelične koncentracije BCAA. Po zdravljenju z AAI so celice KLF6- Con pokazale zmanjšanje BCAA, skladno s povečanim katabolizmom BCAA, potencialno kot nadomestilo za izgubo oksidacije FA (slika 5B). Vendar se je ta učinek izgubil v celicah KLF6-OE, ki niso imele zmanjšanja intracelularnih BCAA po zdravljenju z AAI, kar je skladno z zmanjšano sposobnostjo katabolizacije BCAA (slika 5B), in to je bilo v korelaciji z zmanjšano proizvodnjo ATP v mitohondriju. v primerjavi s celicami KLF6-Con, zdravljenimi z AAI (slika 5C).

Standardni medij, ki se uporablja za merjenje proizvodnje ATP, vsebuje visoke koncentracije glukoze (10 mM glukoze, 1 mM glutamina in 2 mM piruvata) in da bi ugotovili, ali bi samo prekomerno izražanje KLF6 lahko spremenilo uporabo različnih virov energije, smo namesto tega izvedli teste stopnja porabe kisika (OCR) v energijsko omejenih medijih (mediji brez seruma z 1 mM glukoze, brez glutamina in brez piruvata). Celice KLF6-OE so imele zmanjšan mitohondrijski OCR (opredeljen kot začetni OCR minus nemitohondrijski OCR, določen po dajanju rotenona/antimicina A), vendar so imele podobno kompenzacijo po blokiranju glikolize z 2-deoksiglukozo (2- DG) in podobno FAO (zmanjšanje OCR po blokiranju FAO z etomoksirjem) (sl. 5 D in E). Ker mitohondrijski odziv na izgubo glikolize in OCR, ki je posledica oksidacije FA, nista bila spremenjena v celicah KLF6-OE, je to nakazovalo, da celotno mitohondrijsko delovanje ni bilo prizadeto, temveč je morda nezmožnost uporabe BCAA kot vira upoštevajo osnovno zmanjšanje mitohondrijskega OCR v teh energetsko omejenih pogojih. Da bi ugotovili, ali bi izguba katabolizma BCAA povzročila zmanjšano proizvodnjo mitohondrijskega ATP, smo ustvarili celice HK-2 z uničenjem BCKDHB (dodatek SI, slika S7). BCKDHA in BCKDHB kodirata dve podenoti velikega proteinskega kompleksa razvejane ketoacidne dehidrogenaze (BCKDH), ki katalizira prvo ireverzibilno in hitrost omejujočo stopnjo v katabolizmu BCAA in jo zavira fosforilacija z BCKDH kinazo (BCKDK) (28). Za premik kontrolnih BCKDHB-SCR in knockdown BCKDHB-sh celic proti mitohondrijski proizvodnji ATP, so bile predhodno inkubirane v 2-DG za blokiranje glikolize 1 uro pred izvedbo testa stopnje proizvodnje ATP. Zrušitev BCKDHB je povzročila znatno zmanjšanje proizvodnje ATP, kar kaže, da se BCAA uporabljajo za ustvarjanje ATP pri ljudeh.ledvicacelice (slika 5F). Nasprotno, do

Slika 4. Miši hKLF6OE so se poslabšalepoškodba ledvicz zatiranjem genov BCAA. (A in B) Koncentracije serumskega kreatinina (A) in sečninskega dušika (B) pri kontrolnih in hKLF6OE miših, zdravljenih z DMSO ali AAI v aktivni fazi. n=4 do 9 na skupino; $P < 0.05,="" $$p="">< 0.01,="" $$$p="">< 0.0{="" {26}}1="" v="" primerjavi="" z="" istim="" genotipom="" z="" dmso;="" **p="">< 0.01="" v="" primerjavi="" s="" kontrolo="" z="" aai;="" enosmerna="" anova="" s="" popravkom="" sidak="" za="" večkratno="" testiranje.="" (c="" in="" d)="" reprezentativni="" histološki="" sliki,="" obarvani="" s="" hematoksilinom="" in="" eozinom="" (c)="" ter="" schiffovo="" periodično="" kislino="" (d).="" rumene="" puščice:="" odpadajoči="" tubuli;="" črne="" puščice:="" ostanki="" bazalnih="" membran;="" rumene="" puščice:="" beljakovinski="" odlitki;="" in="" črne="" puščice:="" vnetni="" infiltrati.="" (lestvica,="" 100="" μm.)="" (e)="" imunofluorescentno="" barvanje="" za="" citokeratin-20="" (krt-20)="" kot="" označevalec="" poškodovanega="" pt="" (rdeče)="" z="" obarvanjem="" z="" lotusovim="" lektinom="" (ll="" )="" kot="" označevalec="" nepoškodovanega="" pt="" (zeleno).="" (skalna="" lestvica,="" 250="" μm.)="" (f)="" imunofluorescentno="" barvanje="" za="" -sma="" (zeleno)="" z="" obarvanjem="" za="" edu="" (magenta).="" (lestvica,="" 100="" μm.)="" (g)="" ekspresija="" mrna="" genov="" bcaa="" pri="" kontrolnih="" in="" hklf6oe="" miših,="" zdravljenih="" z="" dmso="" ali="" aai="" v="" aktivni="" fazi.="" n="5" do="" 9="" na="" skupino;="" $p="">< 0,01,="" $$p="">< 0,001="" v="" primerjavi="" s="" kontrolo="" z="" dmso;="" vsi="" hklf6oe="" z="" aai="" so="" p="">< 0,001="" v="" primerjavi="" s="" hklf6oe="" z="" dmso;="" *p=""><0,05, **p=""><0,01, ***p=""><0,001 v="" primerjavi="" s="" kontrolo="" z="" enakim="" zdravljenjem;="" večkratni="" t="" testi="" s="" korekcijo="" stopnje="" napačnih="" odkritij="" z="" uporabo="" dvostopenjskega="" modela="" benjaminija,="" kreigerja="" in="" yekutielija.="" podatki="" so="" povprečje="" ±="" sem,="" pri="" čemer="" n="" označuje="" število="" bioloških="">

povečati katabolizem BCAA, smo celice HK-2 obdelali z BT2, ki zavira BCKDK in tako blokira zaviralno fosforilacijo BCKDH. V pogojih z omejeno energijo je zdravljenje z BT2 povečalo OCR v celicah, obdelanih z DMSO, ki se je ohranil po inhibiciji glikolize in ne zaradi spremembe FAO ali nemitohondrijskega OCR (sl. 5 G in H). Te ugotovitve kažejo, da KLF6-posredovana supresija katabolizma BCAA zmanjša mitohondrijsko proizvodnjo ATP, kar bi verjetno poslabšalo poškodbo PT v okolju celičnega stresa, v katerem obstajajo podobno energetsko omejeni pogoji zaradi ogroženosti FAO.

Izražanje genov BCAA je zmanjšano pri različnih miših in ljudehPoškodbe ledvic. Da bi ugotovili, ali pride do izgube genske ekspresije BCAA pred izgubo PT in zvišanimi nivoji kreatinina pri poškodbi, povzročeni z AAI, smo izvedli qRT-PCR pri miših C57BL/6, zdravljenih z enim odmerkom AAI in evtanaziranih po 24 urah. Bckdhb, Hibch in Mccc2 so bili v tem času že občutno znižani, drugi geni (npr. Acadm) pa kažejo močan trend proti znižani regulaciji (slika 6A). Za preučevanje izražanja genov BCAA pri drugih mišihpoškodba ledvicmodelov smo izvedli qRT-PCR pri miših, zdravljenih s cisplatinom (slika 6B) ali podvrženih UUO (slika 6C). V obeh modelih je bilo izražanje Klf6 močno povečano v primerjavi z vozilom/kontrolami. Pri miših, zdravljenih s cisplatinom, je bilo več testiranih genov BCAA občutno znižano reguliranih, s trendi proti znižani regulaciji drugih genov (slika 6B). Pri miših, ki so bile podvržene UUO, so bili vsi testirani geni občutno znižani tako 3 kot 7 dni po UUO (slika 6C), kar kaže na to, da do znižane regulacije genov BCAA pride zgodaj po poškodbi.

Slika 5. Prekomerna ekspresija KLF6 zavira izražanje genov BCAA, proizvodnjo ATP in uporabo BCAA in vitro. (A) Izražanje presnovnih genov KLF6 in BCAA v celicah HK-2, ki stabilno izražajo kontrolne (Con) ali plazmide prekomerne ekspresije KLF6 (OE), obdelane z DMSO ali AAI. n=4 na skupino; *P < 0.05,="" **p="">< {{10}}.01,="" ***p="">< 0.{="" {21}}01="" proti="" con="" aai;="" $p="">< 0.{{3{{40}}}}5,="" $$p="">< 0.01,="" $$$p="">< 0,001="" v="" primerjavi="" z="" isto="" celično="" linijo="" z="" dmso;="" dvosmerna="" anova="" s="" tukeyjevim="" popravkom="" za="" večkratno="" testiranje.="" (b)="" kvantifikacija="" skupnih="" bcaa="" v="" celicah="" con="" in="" oe,="" obdelanih="" z="" dmso="" ali="" aai.="" n="6" na="" skupino;="" $p="">< 0,05="" v="" primerjavi="" s="" con="" dmso;="" enosmerna="" anova="" s="" sidakovim="" popravkom="" za="" večkratno="" testiranje.="" (c)="" odstotna="" sprememba="" stopnje="" proizvodnje="" mitohondrijskega="" atp="" v="" celicah="" con="" in="" oe,="" zdravljenih="" z="" aai="" v="" primerjavi="" z="" dmso.="" n="27" do="" 30="" na="" skupino;="" *p="">< 0,05,="" ***p="">< 0,001="" v="" primerjavi="" z="" dmso,="" $p="">< 0,05="" v="" primerjavi="" s="" con="" aai;="" enosmerna="" anova="" s="" sidakovim="" popravkom="" za="" večkratno="" testiranje.="" (d)="" meritve="" ocr="" za="" con="" in="" oe="" celice="" v="" omejenem="" mediju.="" kjer="" je="" navedeno,="" so="" bili="" dodani="" 2-dg,="" etomoksir="" (eto)="" in="" kombinacija="" rotenona/antimicina="" a="" (rot).="" n="16" na="" skupino.="" (e)="" kvantifikacije="" bazalnega="" mitohondrijskega="" ocr="" (začetni="" ocr="" minus="" post-rot="" ocr),="" nemitohondrijski="" ocr="" (post-rot="" ocr)="" in="" spremembe="" v="" ocr="" po="" dodajanju="" 2-dg="" (mitohondrijska="" kompenzacija="" po="" 2-dg)="" in="" etomoksir="" (fao).="" n="16" na="" skupino;="" **p=""><0,01 proti="" con;="" dvosmerna="" anova="" s="" tukeyjevim="" popravkom="" za="" večkratno="" testiranje.="" (f)="" stopnja="" proizvodnje="" mitohondrijskega="" atp="" v="" celicah="" bckdhb-scr="" in="" bckdhb-sh.="" n="14" na="" skupino;="" **p=""><0,05, neparni="" t="" test.="" (g)="" meritve="" ocr="" v="" celicah="" hk-2="" v="" omejenem="" mediju="" v="" odsotnosti="" ali="" prisotnosti="" bt2.="" kjer="" je="" navedeno,="" so="" bili="" dodani="" 2-dg,="" eto="" in="" rot.="" (h)="" kvantifikacije="" bazalnega="" mitohondrijskega="" ocr,="" nemitohondrijskega="" ocr="" in="" sprememb="" v="" ocr="" po="" dodajanju="" 2-dg="" in="" etomoksirja="" v="" celice="" hk-2="" v="" odsotnosti="" ali="" prisotnosti="" bt2.="" n="8" na="" skupino;="" *p="">< 0,05="" v="" primerjavi="" z="" brez="" bt2;="" dvosmerna="" anova="" s="" tukeyjevim="" popravkom="" za="" večkratno="" testiranje.="" podatki="" so="" povprečje="" ±="" sem,="" pri="" čemer="" n="" označuje="" število="" bioloških="">

Podobno je rudarjenje podatkov o predhodno poročanem nizu izražanja iz tubulointersticijskega predela 36 človeških bolnikov s kronično ledvično boleznijo (hipertenzivnih in diabetičnihbolezni ledvic) v primerjavi s kontrolnimi bolniki (6) je pokazalo, da je več genov BCAA uravnanih navzdol na podoben način kot miši, zdravljene z AAI (slika 6D). Da bi dodatno pojasnili odnos meddelovanje ledvic, ekspresijo KLF6 in ekspresijo genov BCAA pri človeški kronični bolezni ledvic, smo uporabili objavljen niz ekspresij iz tubulointersticijskega predela serije 164 bolnikov z različnimibolezni ledvic (29). Ranking of patients by eGFR showed a significant inverse correlation between eGFR and KLF6 expression and a significant positive correlation between eGFR and each BCAA gene expression, with significant inverse correlations also between KLF6 and each BCAA gene expression (Fig. 6E). Indeed, even individuals with only moderate decreases in eGFR (∼45 to 60 mL/min/1.73m2) had significantly increased expression of KLF6 and decreased BCAA gene expression compared to individuals with normal eGFR (>90 mL/min/1,73 m2) (P < 0,001="" za="" vse="" gene),="" kar="" dokazuje,="" da="" se="" lahko="" te="" spremembe="" v="" izražanju="" genov="" pojavijo="" zgodaj="" v="" povezavi="" s="" funkcionalnimi="" spremembami.="" skupaj="" ti="" podatki="" kažejo,="" da="" bi="" lahko="" imela="" klf6-posredovana="" supresija="" genov,="" ki="" so="" ključni="" za="" katabolizem="" bcaa,="" ključno="" vlogo="" pri="">poškodba ledvicv mišjih modelihledvicafibrozo kot tudi pri kronični ledvični bolezni pri ljudeh.

Diskusija

V tej študiji prikazujemo in vivo vlogo PT-specifičnega KLF6 pri nastavitvipoškodba ledvic.KLF6 je močno in dosledno reguliran zgodaj v PT kot odziv napoškodba ledvic, vendar je to neprilagodljiv odziv, kar dokazuje zaščitni učinek izgube PT Klf6 po zdravljenju s klinično pomembnim in zelo specifičnim za PT toksinom AAI. Poleg tega prikazujemo potencialni pomen nereguliranega metabolizma BCAA pri poškodovanem PT kot možnega povzročitelja AKI in posledične fibroze. Izguba Klf6 je povzročila ohranitev ekspresije katabolnega encima BCAA, pri čemer ima več genov, ki kodirajo te encime, vezavna mesta KLF6 v neposredni bližini njihovih TSS, kar nakazuje, da je KLF6 morda transkripcijski supresor katabolizma BCAA. Čeprav je bilo prej dokazano, da drug član družine KLF, KLF15, uravnava izražanje aminotransferaze 2 (Bcat2) z razvejano verigo skeletnih mišic (30), o regulaciji drugih encimov BCAA niso poročali. Predpostavljamo, da KLF6 deluje tako, da zavira izražanje več genov, ki kodirajo encime BCAA.

Pri nepoškodovanem PT je izražanje Klf6 nizko in spremenljivo izraženo v nekaterih celicah PT, v drugih pa ne. Hitra in robustna regulacija navzgor, ki se pojavi po več vrstah poškodb, kaže na fiziološko pomembno vlogo KLF6. V fibroblastih se je nedavno pokazalo, da je KLF6 reguliran navzgor kot odziv na onkogeni in oksidativni stres, kar vodi v celično staranje, medtem ko je utišanje KLF6 povzročilo kopičenje označevalcev poškodbe DNK in genomske nestabilnosti (31). Tako je lahko fiziološka vloga KLF6 pri poškodbi indukcija celičnega staranja, kar omogoča popravilo poškodbe DNK, ki je lahko posledica toksičnih ali oksidativnih/ishemičnih insultov. Vendar pa se zdi, da je pri poškodovanih celicah PT druga posledica povečane regulacije Klf6 supresija katabolizma BCAA, ki je verjetno škodljiv predvsem v celicah PT. Zanimivo je, da je kljub delnemu padcu PT-specifičnega Klf6 na začetku pri miših Klf6PTKD to še vedno lahko zagotovilo jasen zaščitni učinek po poškodbi. To ima pomembne terapevtske posledice, saj nakazuje, da bi lahko samo majhna manipulacija ravni ali aktivnosti KLF6 (npr. z uporabo inhibitorja majhne molekule) pokazala terapevtsko učinkovitost. Dejansko so transkripcijski faktorji bolj verjetni kot druge genske družine

v človeškem genomu, da imajo občutljivost na odmerek (32). Podobno je ena od omejitev našega inducibilnega mišjega modela prekomerne ekspresije KLF6 ta, da ne gre za omejene PT celice, zato se bodo morale prihodnje študije osredotočiti na uporabo celično specifičnega inducibilnega modela za razjasnitev vloge KLF6, ki je odvisna od celičnega konteksta.

Prej smo dokazali, da je bila izguba Klf6 v glomerularnih podocitih škodljiva pri nastavitvi FSGS zaradi njegove vloge pri transkripcijski aktivaciji sinteze citokrom c oksidaze 2 (Sco2). Izguba Klf6 v FSGS je povzročila poslabšanje fibroze s povečano aktivacijo intrinzične apoptotične poti (15). Zaslišanje razpoložljivih enoceličnih podatkovnih nizov RNA-seq kaže, da pri zdravi mišiledvice,Klf6 se izraža v veliko večjem deležu podocitov kot celic PT in na veliko višji ravni (ref. 33; https://susztaklab.com/). KLF6 ima zato verjetno pomembnejšo fiziološko vlogo v normalnih podocitih kot celice PT, medtem ko so drugi znani mitohondrijski glavni regulatorji (npr. Ppara) izraženi veliko bolj v celicah PT kot podociti. Tako ima izguba Klf6 v podocitih verjetno bolj škodljiv učinek kot v celicah PT. Kontrastne vloge KLF6 v različnih vrstah celic znotrajledvicavzporedno s prejšnjimi ugotovitvami o celično specifičnih učinkih v srcu in jetrih. Tako je knockdown Klf6 v srčnih miocitih pri miših oslabil srčno fibrozo po prekomerni obremenitvi z angiotenzinom II, kar kaže na vlogo KLF6 pri širjenju fibroze, vendar knockdown Klf6 v srčnih miofibroblastih ni vplival na fibrozo (14). Nasprotno pa v jetrih knockdown Klf6 v mišjih hepatocitih ni vplival na jetrno fibrozo po kroničnem dajanju CCl4, vendar je čezmerna ekspresija KLF6 v jetrnih zvezdastih celicah povzročila zmanjšano fibrozo, kar kaže, da je KLF6 zaščiten (13).

CISTANCHE BO IZBOLJŠAL LEDVIČNE/LEDVIČNE BOLEČINE

Izguba FAO medpoškodba ledvicje zdaj znano, da je pomemben dogodek v patologijipoškodba ledvicin dejansko lahko neposredno prispeva k fibrozi. V odsotnosti FAO, ki je glavni vir energije za nepoškodovani PT, lahko drugi potencialni viri energije prevzamejo večji pomen. BCAA prispevajo k ciklu TCA s proizvodnjo acetil-CoA in sukcinil-CoA. Nedavna študija je pokazala, da BCAA, označene s 13C, ne prispevajo le k vmesnim produktom cikla TCA vledvicatodaledvicaje imela četrto najvišjo vključitev 13C v intermediate cikla TCA med testiranimi organi, takoj za trebušno slinavko, mišicami in belim maščobnim tkivom (34), kar nakazuje, da BCAA potencialno pomembno prispevajo k ciklu TCA. Vendar pa je pomen katabolizma BCAA pri prispevanju k ciklu TCA, bodisi pri normalnem ali poškodovanemledvice, še ni bilo raziskano. Na primer, ni znano, ali bi samo izguba katabolizma BCAA povzročila spremembe v homeostazi in/ali popravilu PT, in te študije bodo zahtevale ustvarjanje novih modelov miši, kot so Bckdhb miši, specifične za PT. V okoljuledvicapoškodbe, ko je FAO močno zatrt, dodatno zatiranje

geni, ki kodirajo presnovne encime BCAA, lahko tubularne celice prikrajšajo za pomemben alternativni potencialni vir energije. Pomembno je omeniti, da je bila ekspresija genov BCAA zmanjšana že 24 ur po enkratni injekciji, pred kakršnimi koli spremembami v serumskem kreatininu ali izgubi PT, kar kaže, da so bile te znižane regulacije specifična posledica poškodbe PT in niso bile povezane z zmanjšanim povpraševanjem po energiji PT. zmanjšane GFR in posledično zmanjšane potrebe po privzemu raztopine. Te poti so bile ohranjene pri miših Klf6PTKD, ki so bile zaščitene pred poškodbami in dodatno zatrte pri miših hKLF6OE, ki so imele hujšo poškodbo. Poleg tega so imele celice KLF6-OE zmanjšano proizvodnjo mitohondrijskega ATP po zdravljenju z AAI v primerjavi s celicami KLF6-Con, medtem ko so bile znotrajcelične BCAA zmanjšane v celicah KLF6-Con, skladno z njihovim katabolizmom , to zmanjšanje ni bilo zaznano v celicah KLF6-OE. Poleg tega je knockdown BCKDHB v celicah HK-2 povzročil zmanjšano proizvodnjo ATP v mitohondriju. Tako lahko ohranjena ekspresija genov BCAA pri miših Klf6PTKD zagotovi zaščito pred poškodbami z zagotavljanjem vitalnih intermediatov cikla TCA v okolju močno zmanjšane oksidacije FA. Prihodnje študije z uporabo miši z genetskimi manipulacijami katabolizma BCAA in/ali zdravljenja z BT2 bi nam omogočile raziskovanje dinamike med katabolizmom BCAA in FAO vpoškodba ledvic.

Pokazali smo, da izguba izražanja genov BCAA povzroči zmanjšano mitohondrijsko dihanje in proizvodnjo ATP, kar predstavlja en mehanizem, s katerim lahko izguba katabolizma BCAA prispeva kpoškodba ledvic. Alternativni mehanizem bi lahko bil preko kopičenja BCAA, ki ima lahko toksičen učinek. Dejansko se je to izkazalo pri postavitvi srčnega IRI. Pokazalo se je, da kopičenje BCAA zaradi izgube katabolizma zavira mitohondrijsko uporabo piruvata s posttranslacijsko inaktivacijo piruvat dehidrogenaze, s čimer se odstrani nadaljnji celični vir energije in poslabša poškodbe (35). To je bilo obrnjeno s povečanjem katabolizma BCAA z zdravljenjem miši z BT2 ali s povečanjem presnove glukoze s prekomerno ekspresijo GLUT1. Nedavna študija je pokazala tudi poslabšanje srčnega IRI zaradi izgube katabolizma BCAA pri diabetičnih miših. To je spremljal povečan oksidativni stres in ponovno obrnil s ponovno aktivacijo katabolizma BCAA (36). Znano je, da BCAA in zlasti levcin aktivirata signalizacijo tarče rapamicinskega (mTOR) kompleksa 1 (mTORC1) pri sesalcih. V mišjem modelu policističnihbolezni ledvic,v katerih imajo celice, ki obkrožajo ciste, aktivacijo mTOR

signaliziranja, dopolnjevanje z BCAA dodatno aktivira signalizacijo mTORC1, kar vodi do povečane proliferacije (37). Transkripcijsko profiliranje hepatocelularnih karcinomov je razkrilo zmanjšano ekspresijo genov BCAA, kar vodi do kopičenja BCAA v tumorskem tkivu. To je bilo povezano s povečanim signaliziranjem in širjenjem mTORC1, ki se je zmanjšalo z omejevanjem BCAA ali zdravljenjem z BT2, poslabšalo pa se je pri miših, ki so bile hranjene z visoko vsebnostjo BCAA (38). Signalizacija mTORC1 je potrebna za delovanje PT in študije z uporabo zaviralcev mTOR vpoškodba ledvicso pokazali nasprotujoče si rezultate, verjetno zaradi različnih režimov odmerjanja, časovnega razporeda zdravljenja in modelov poškodb (39–42). Signalizacija mTORC1 vodi do množice celičnih odzivov, vključno z rastjo in proliferacijo celic, sintezo lipidov, mitohondrijsko sintezo in zatiranjem avtofagije (43). Verjetno je lahko premajhna ali prekomerna aktivacija signalizacije mTORC1 škodljiva in da je za pravilno celično delovanje potrebno ravnovesje. Na primer, prekomerna aktivacija signalizacije mTORC1 pri poškodbi PT lahko povzroči škodljivo zatiranje avtofagije, ki je potrebna za odstranitev poškodovanih mitohondrijev in se je izkazala za pomembno za okrevanje po PTpoškodba (39, 42, 44, 45). Tako ima lahko kopičenje levcina škodljivo vlogo pripoškodba ledvics prekomerno aktivacijo signalizacije mTORC1 in zatiranjem avtofagije. Za zaključek smo pokazali, da močna regulacija Klf6, ki se pojavi vpoškodba ledvicje škodljiv, pri čemer je izguba PT-specifičnega Klf6 ohranila izražanje gena BCAA in oslabila AKI in morebitno fibrozo. Nasprotno pa je indukcija KLF6 pri miših zavrla izražanje gena BCAA in povzročilaledvicadovzetni zapoškodba ledvic.Poleg tega imajo geni, ki kodirajo več encimov BCAA, vezavna mesta za KLF6, kar nakazuje, da je KLF6 lahko transkripcijski regulator katabolizma BCAA. Znižana regulacija katabolizma BCAA in vitro s prekomerno ekspresijo KLF6 in zdravljenjem z AAI ali z uničenjem BCKDHB,do zmanjšane mitohondrijske proizvodnje ATP. Skupaj tepodatki kažejo, da je terapevtsko usmerjeno v ohranjanjeKatabolizem BCAA lahko zagotovi alternativo mitohondrijuvir energije v okoljupoškodba ledvicv katerem FAOse zmanjša.