Aktivacija makrofaga z nizko molekulsko maso Saccharides Iz Cistanche Deserticola

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

[Abst1000000000000

Za preiskavo imunskega aktivacijskega učinka in mehanizma saharidov z nizko molekulsko maso izCistanche deserticola(LMSC) na miškinih peritonealnih makrofagih, RAW264. 7 celic. The RAW264. 7 celic je bilo razdeljenih v normalno kontrolno skupino, skupino za pozitivno kontrolo LPS in skupine za zdravljenje LMSC. The RAW264. 7 celic so zdravili z različnimi koncentracijami LMSC od 3. 91 do 62. 5 g· L - 1. Nevtralni rdeči atentat je bil zaposlen za odkrivanjephagocytic aktivnost makrofagov. Sproščanje ni bilo ugotovljeno z uporabo NO kompleta, ravni izražanja beljakovin v makrofazi (TNF-α, IL-6, IKKβ, p-IKKβ, IκBα, p-IκBα, NF-κB in p-NF-κB) pa so zaznali zahodni blot. Rezultati so pokazali, da ima LMSC aktivacijski učinek na makrofage; lahko znatno poveča sproščanje NO v RAW264. 7 celic in spodbujajo izražanje citokinov TNF-α in IL-6. Poleg tega je LMSC znatno povečal fosforilacijo IKKβ, IκBα in NF-κB p65. Poleg tega je mannitol ena glavnih sestavin v LMSC znatno povečalaphagocytic aktivnost makrofagov. Ti rezultati so pokazali, da lahko LMSC aktivira makrofage z up-regulacijo signalne poti NF-κB, in manitol je lahko ena glavnih aktivnih komponent v LMSC.

Saharidi z nizko molekulsko maso; Cistanche deserticola; imunsko aktivacijo; makrofaga; vnetni faktor; NF-κB

Cistanche deserticola Y. C. Maje rastlina, ki pripada roduCistanche deserticolaY. C. Ma. Njegovo mesnato stebe se lahko uporablja kot zdravilo. Ima funkcije hranljivo ledvično jang, hranljivo bistvo in kri, in vlaži črevesje. Znan je kot "puščavski ginseng". Kemične sestavine cistanche vključujejo fenilethanoidne glikozide, iridoidne glikozide, sladkorje, lignane in številne druge vrste. Sodobne farmakološke študije so pokazale, da ima Cistanche številne biološke dejavnosti, kot so nevrozaščita, anti-tumor, imunska ureditev, protivnetni in antioksidant [1]. Študije so pokazale, da lahko decoction cistanche in polysaccharides bistveno izboljšajophagocytic sposobnost in izločanje funkcije makrofagov [2-3]. Vendar ni nobenega poročila o raziskavah dejavnosti njegovih ogljikovih hidratov z nizko molekulsko maso. Zato je ta študija uporabljala sistem kulture in vitro raw264. 7 miško peritonealnih makrofagov za raziskovanje imunomodulatorne aktivnosti in sorodnih mehanizmov Cistanche nizkomolekularnih ogljikovih hidratov. Te raziskave lahko zagotovijo bolj eksperimentalne dokaze za celovito razumevanjeCistanchejev imunomodulatorni učineknadaljnje usmerjanje njegove klinične uporabe.

Cistanche deserticola imajo veliko učinkov, kliknite tukaj, da veste več

1. Materiali

RAW264. 7 celic je bilo kupljenih v celični center Kitajske akademije medicinskih znanosti; fetalni goveji serum (FBS) je bil kupljen pri PAN Biotech, Nemčija; antibiotiki in DMEM medij so bili kupljeni od Zhongke Machen Technology Co, Ltd Lipopolysaccharide iz Escherichia coli O55:B5 (LPS) so bili kupljeni pri Sigma Company, ZDA. Komplet dušikovega oksida (NO) je bil kupljen pri Nanjing Jiancheng Institute of Bioengineering. ECL komplet za kemiluminescenco je bil kupljen pri thermo Fisher, ZDA; protitelo je bilo kupljeno od Cell Signaling Technology, ZDA; Cistanche cistanche skupaj glikozidi, cistanche nizke molekulske mase sladkorjev, in cistanche polysaccharides so bili samo-izdelani s strani naše raziskovalne skupine. Masni delež cistanche skupnih glikozidov je bil 78,76 %. Masni delež sladkorjev z nizko molekulsko masoCistanche deserticolaje 58. 00 % in masni deležCistanche deserticolapolysaccharides je 65. 24%. Tanon-5200Multi gel za slikanje split sistem je bil kupljen od Shanghai Tianneng Technology Co, Ltd; Sunrise-Basic microplate reader je bil kupljen pri podjetju TECAN.

2. Metoda

2. 1 Nevtralna rdeča metoda za merjenje phagocytic aktivnosti makrofagov

Vzemite peritonealne makrofage miške v fazi logaritamske rasti, Po trypsinizaciji, preštejte celice, prilagodite število celica na 5 × 104 celice/ml, i cijepite ju u 96-well cell culture plate, 100 μL/well, na 37 °C Kulturan pod 5% CO2 pogoji, po tem da se celice pridrže zidu, odvrne supernatant kulture, dodajte DMEM medij (10% FBS + 1% P /S), LPS (1 mg· L - 1) in Cistanche cistanche oziroma Skupaj glikozidi,Cistancheskupaj polisaharidi in cistanche cistanche nizkomolekularni sladkorji (3,91 ~ 62,5 g· L -1, filtriran s filtrno membrano pred dajanjem) so bili kultureni. Po selitvi 48 ur v vsak dobro dodajte 100 μL 0,075% nevtralne rdeče fiziološke fiziološke raztopine, Nastaviti se kultivirati 4 sata, aspirati supernatant, 3-krat amiti s PBS- om, dodati celični lysat (glacialna ocetna kislina-etanol 1:1) 100 μL, 100 μL, 2 h ga 3 °C, i izmeriti upijanje (A540 nm) po lysedu.

2. 2 Odkrivanje količine izpusta NO v celični supernatant

Inoculate RAW264. 7 celic v plošči z 48-dobro (1 × 105 celic/ml, 500 μL/no), po nočni inkubacijah aspirati celično kulturo, dodajte DMEM medij (10% FBS + 1% P /S), 500 μL vsak od LPS (1 mg· L -1) in Cistanche cistanche skupaj glikozidi, skupaj polysaccharides, in nizko-molekularna-teža sladkorjev (3,91 ~ 62,5 g· L -1). Po 24 urah indukcijske kulture so supernatanta zbrali. Določite koncentracijo NO v celični nadnatanti vsake skupine s kompletom NO, upoštevajte navodila in na koncu odkrijte absorbcijo (A570 nm) z mikroplate bralnikom

2. 3. Zahodni blot

Inoculate RAW264. 7 celic v 6-dobro ploščo, aspirati celično kulturo medij po čez noč inkubacije, dodajte DMEM medij (10% FBS + 1% P /S), LPS (1 mg· L - 1), inCistancheskupaj polisaharidi in sladkorji z nizko molekulsko maso (3,91 ~ 62,5 g· L -1) so bili vsak 2 ml, supernatant pa je bil zavržen po 24 urah indukcijske kulture. Celice so dvakrat izplili s PBS in zavrženi. Po trypsinization, celice so pipetted navzdol. Centrifuga, odstranite supernatant, dodajte 100 μL NP40 Lysis Buffer in 40 min leže na ledu. Po centrifugacijah so vzeli supernatant, koncentracijo beljakovin pa so določili z metodo BCA, koncentracija beljakovin vsakega histona pa je bila prilagojena v skladu s tem. Vzemite enako količino vzorcev beljakovin in jih ločite na 12% SDS-PAGE pod stalnim pritiskom. Nato uporabite rezervoar za prenos elektroforeze Bio-Rad za prenos membrane s stalnim tokom 350 mA 1 uro, beljakovino pa prenesete na membrano PVDF (predpostavka PVDF membrane: namočite v metanolu in enakovredno prenesete s premostitvenim blažilnikom). Po blokiranju s 5% posnetim mlekom (konfigurirano z TBST, ki vsebuje 0,1% Tween-20) za 1 h pri sobni temperaturi, je bila membrana 3-krat izperena z TBST, membrana pa je bila inkubirana v beljakovinski primarni razredčitvi protiteles pri 4 °C čez noč. Membrano so s TBST izlili 3-krat vsak drugi dan, ustrezno redčenje pa je bilo dodano inkubatorju 1 h. Membrano so 3-krat umili z TBST, trakovi pa so bili razviti z razvijalcem ECL kemiluminescence.

2. 4 analiza podatkov

Podatki so izraženi kot x ± s, pomen razlike pa se preskuša z uporabo statistične programske opreme GraphPad Prism 6 za enosmno analizo variance. Vzemite P<0.01 as="" a="" very="" significant="" difference,="" and=""><0.05 as="" a="" significant="">

3. Rezultati

3. 1. Učinki cistanche cistanche sladkorjev z nizko molekulsko maso, skupni glikozidi in skupni polisaharidi na farmagocitsko aktivnost RAW264. 7 celic

Raziskave o kemičnih sestavinah cistancheja kažejo, daCistanchevsebuje predvsemfeniletanoidni glikozidi, iridoidnih glikozidov in ogljikovih hidratov. V tem eksperimentu so izbrani skupni glikozidi cistancheja (vključno s fenetil alkoholnimi glikozidi in iridoidnimi glikozidi), nizkomolekularnimi sladkorji in sladkorji. Tri aktivna mesta skupnih polisaharidov so raziskali zaradi njihovih učinkov na aktivacijo raw264. 7 celic. Tako cistanche cistanche polysaccharide kot cistanche nizko-molekularne mase sladkorja lahko znatno povečajophagocytic aktivnost RAW264. 7 celic, vendar se farmocitska aktivnost celotne skupine za dajanje glikozidov ne spremeni bistveno. Poleg tega je pozitivno kontrolno zdravilo LPS tudi bistveno izboljšalophagocytic aktivnost RAW264. 7 celic, kot je prikazano na sliki 1. Zgornji rezultati kažejo, da lahko sladkorji z nizko molekulsko maso in polisaharidi cistanchea vplivajo na aktivacijo zdravila RAW264. 7 celic.

3. 2. Učinek cistanchejevih skupnih glikozidov, nizkih molekularnih sladkorjev in skupnih polisaharidov na vsebnost dušikovega oksida (NO) v celičnih supernatantih

Za nadaljnjo preiskavo aktivacijskega učinka treh aktivnih mest cistanche na RAW264. 7 celic, je bila določena vsebnost NO v celičnih supernatantih, stimuliranih z različnimi zdravili. Rezultati so pokazali, da je bila izpustitev NO v skupini LPS bistveno višja od izpusta v prazno kontrolno skupino (P<0.01); the="" release="" of="" no="" in="" the="" 5="" doses="" of="" low="" molecular="" sugar="" and="" polysaccharides="" in="" the="" cistanche="" cistanche="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" control="" group="" (p=""><0.01) ),="" and="" was="" dose-dependent;="" the="" total="" glycosides="" of="">Cistancheni imelo pomembnega učinka. Zgornji rezultati kažejo, da lahko polisaharidi in sladkorji z nizko molekulsko maso cistanche spodbujajo sproščanje NO iz RAW264. 7 celic. Med njimi je še posebej pomemben učinek nizkomolekularnih sladkorjev cistanche, kot je prikazano na sliki 2.

3. 3. Učinek cistanche cistanche sladkorja z nizko molekulsko maso na izraz TNF-α in IL-6 beljakovin v RAW264. 7 celic

TNF-α je pomemben vnetni mediator, ki se pojavi v procesu aktivacije RAW264. 7 celic, ki lahko spodbujajo sintezo in sproščanje drugih citokinov (kot je IL-6). Rezultati so pokazali, da se je izraz TNF-α in IL-6 znatno povečal po spodbujanju nizkomolekularnega sladkorja cistanche cistanche, kar kaže, da lahko nizkomolekularni sladkor cistanche spodbuja izražanje TNF-α in IL-6 v raw264. 7 celic, s čimer se aktivira celična imunost Phagocytosis, glejte sliko 3.

3. 4. Regulativni učinek cistanche cistanche sladkorja z nizko molekulsko maso na signalno pot IKKβ /IκBα/NF-κB

Da bi raziskali potencialni mehanizem cistanche cistanche sladkorjev z nizko molekulsko maso pri aktiviranju RAW264. 7 celic, so avtorji preiskali njegove regulativne učinke na klasično signalno pot IKKβ/IκBα/NF-κB. Cistanche cistanche nizko-molekularno-teža sladkor lahko znatno poveča fosforilacijo NF-κB in fosforilacijo njegovih navzgor ključnih signalnih beljakovin IKKβ in IκBα, i reducirajte izraz totalnih IκBα proteina, naznačite da ima aktivacijski efekt na signalni način IKKβ/IκBα/NF-κB. Pozitivno kontrolno zdravilo LPS ima tudi podoben regulativni učinek. Če povzamem, lahko nizkomolekularni sladkorji cistanche aktivirajo signalno pot IKKβ/IκBα/NF-κB in s tem povzročijo sintezo in sproščanje citokinov, kot sta TNF-α in IL-6, in končno povzročijo imunsko aktivacijo RAW264. 7 celic, glej sliko 4.

3. 5. Presejanje aktivnih sestavin z aktivacijsko učinkovino makrofaga v sladkorju z nizko molekulsko maso Cistanche

Naš laboratorij je analiziral nizkomolekularne sladkorje, ki jih vsebujeCistanchev zgodnji fazi in ugotovili, da vsebuje predvsem manitol (16,53 %),harozo (8,34 %), fruktozo (25,38 %), in glukozo (7. 75 %), in druge sestavine. Tako je avtor uporabil nevtralno rdečo metodo za prikaz aktivacije zgornjih komponent na makrofagih. Mannitol lahko pomembno povečaphagocytic aktivnost makrofagov na odmeren način, medtem ko učinki drugih sestavin niso pomembni. To kaže, da je lahko manitol ena od ključnih aktivnih sestavin v nizkomolekularnih sladkorjev cistanche cistanche za aktiviranje makrofag, kot je prikazano na sliki 5.

4. Razprava

Poročali so, da cistanche cistanche, parazitska rastlina iz družine Lydanaceae, ima imunomodulacijska učinka, zato mora vsebovati imunomodulacijska zdravila. V tem poskusu je avtor pregledalphagocytic aktivnost miške peritonealnih makrofagov na različnih prečiščenih delihCistancheugotovili, da imajo nizkomolekularni sladkorji in polysaccharidi cistanche učinek aktivacije makrofaga, vendar skupni glikozidi cistanche niso očitni. Hkrati je avtor ugotovil, da lahko sladkorji z nizko molekulsko maso aktivirajo makrofage pri nižjih koncentracijah, zato so avtorji izbraliCistanchesladkorja z nizko molekulsko maso, saj je poudarek na naslednjih raziskavah.

S preučevanjem učinka cistanche sladkorja z nizko molekulsko maso na izraz citokinov TNF-α in IL-6 so avtorji ugotovili, da je nizka molekulska teža cistanche sladkor bistveno povečala izraz TNF-α in IL-6, kar je dodatno dokazalo, da ima nizka molekulska teža cistanche sladkor znatno povečala izraz TNF-α in IL-6, kar je še dokazalo, da ima nizka molekulska teža cistanche sladkor. Peritonealni makrofazi imajo aktivacijski učinek. Zato je avtor nadalje raziskal svoj potencialni mehanizem delovanja. Imajo raziskave

Izkazalo se je, da lahko bakterijski lipopolisaharid (LPS) sproži aktiviranje makrofagov miške in miško glialnih celic prek signalnih poti, kot so JAK2/STAT3, NF-κB, p38/ERK in MAPK [4-8]. Pot NF-κB je prepoznana kot klasična pot, zato so signalne beljakovine na tej poti testirali v tem eksperimentu. Rezultati so pokazali, da lahko nizkomolekularni sladkorji cistanche znatno povečajo fosforilacijo NF-κB in fosforilacijo ključnih signalnih proteinov upstream IKKβ in IκBα, kar kaže na to, da so sladkorji z nizko molekulsko masoCistanchelahko aktivirajo miško peritonealne velikane skozi signalno pot IKKβ/IκBα/NF-κB. Phage celice sproščajo vnetne citokine in nato igrajo vlogo pri aktiviranju celične imunitete.

V zgodnji fazi laboratorija se kemijska sestava ekstrakta sladkorja z nizko molekulsko masoCistanche deserticolasistematično analizirali. Ugotovili smo, da sladkorji z nizko molekulsko maso vsebujejo predvsem monome, kot so manitol,haroza, fruktoza in glukoza. Nadaljnje raziskave so ugotovile, da lahko manitol bistveno izboljšaphagocytic aktivnost makrofagov. Zato se ugiba, da je lahko manitol ključna sestavina nizkomolekularnih sladkorjev, ki aktivirajo celično imunsko funkcijo.

Povzamem, ta študija je uporabila makrofažo v sistemu kulture Vitro in ugotovila, da so sladkorji z nizko molekulsko masoCistancheimajo pomemben aktivacijski učinek na makrofage in lahko aktivirajo miško peritonealne makrofage skozi signalno pot NF-κB in nato igrajo vlogo. Manitol pri sladkorih z nizko molekulsko maso lahko igra pomembno vlogo pri aktiviranjuphagocytic aktivnosti makrofagov.

Sklicevanja

[1] Tu Pengfei, Guo Yuhai. Tehnike gojenja puščave Cistanche in njegovega gostitelja Tamarixa [M]. Peking: Science Press, 2015:31.

[2] Gao Xiaoxia, Chen Jun, Peng Yanli. Pregled farmakoloških učinkov farmakološkegaCistanche deserticolapolisaharid [J]. Hrana in droge, 2015, 17(2):136.

[3] Wang Xiangyan, Qi Yun, Cai Ruslan, et al. Makrofaga aktivacija Cistanche Polysaccharide [J]. Kitajski farmakološki bilten, 2009, 25(6):787.

Liu Zhongyuan, Li Yanping. Biološka aktivnost in mehanizem bakterijskega lipopolisaharida [J]. medical Science Review, 2010, 16(2):166.

[5] Fu Zhihui, Xu Ling, Huang Jiao, et al. LPS skozi pot p38 /MAPK in NF-κB Activation inducira izraz HIF-1α v RAW264. 7 celic [J]. Chongqing Medical University Journal, 2016, 41(10): 1033.

[6] Signalna pot Hao Yutong, Chen Chunhai, Yang Xuesen itd. Journal of the Third Military Medical University, 2009, 31(12):1119.

[7] Pesem Xiaomin, Liao Lixi, Dong Xin, et al. Glikozidi Mulbascum zavirajo vnetje mikroglije, ki jo povzroči lipopolisaharid, in njegov mehanizem [J]. Kitajski list tradicionalne kitajske medicine, 2016, 41(13): 2506.