Izčrpavanje makrofagov zmanjša patologijo bolezni pri glomerulonefritisu, ki je odvisen od imunskega kompleksa Ⅱ

3. Rezultati

CSS smo inducirali pri miših s ponavljajočo se imunizacijo z apoferitinom konjske vranice. Živali proizvajajo aktivni antiapoferitinski IgG humoralni imunski sistemodziv in odlaganje IgG v glomerulih. Naše prejšnje študije so pokazale, da je povečan Mϕinfiltracija v ledvicahv tej nastavitvi.

3.1. Izražanje genov makrofagov je povečano v ledvicah ICGN, odvisnih od FH. Za ovrednotenje prisotnosti Mϕs v ledvicah ICGN, odvisnih od FH, je bila izvedena qRT-PCR z markerji makrofagov M2, CD204 (Mϕ čistilni receptor 1) in CD206 (Mϕ manozni receptor 1) [21–24]. Izražanje obeh genov v ledvicah je bilo po zdravljenju z apoferitinom pri miših FHKO znatno povečano (slika 1), kar kaže napovečana prisotnost makrofagov v ledvicah.

KLIKNITE TUKAJ ZA NARAVNI ORGANSKI IZVLEČEK CISTANCHE S 25 % EHINAKOZIDA IN 9 % AKTEOZIDA ZA DELOVANJE LEDVIC

Podporna storitev Wecistanche-največjega izvoznika cistanche na Kitajskem:

E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/telefon:+86 15292862950

Trgovina za več podrobnosti o specifikacijah:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

3.2. Spremembe časovnega poteka z zdravljenjem s klodronatom pri infiltraciji ledvičnih makrofagov pri miših FHKO, zdravljenih z apoferitinom. Da bi določili učinkovito metodo zmanjšanja Mϕs pri FH-odvisnem ICGN, smo izčrpali Mϕs pri fh-/- miših

Slika 3: Dodatni podatki. Podani so profili pretočne citometrije monocitov F4/80+ iz kontrolnih miši in miši, zdravljenih s klodronatom. Celice F4/ 80+ se znatno zmanjšajo in dosegajo manj kot 10 % pri zdravljenju s klodronatom. Vsaka časovna točka n=6.

3.4. Izčrpavanje makrofagov zmanjša glomerularno

Patologija pri ICGN, ki jo posreduje FH. Na koncu poskusa so ovrednotili usedline imunskega kompleksa v ledvicah in histopatološke značilnosti ICGN. Imunofluorescenčno barvanje za C3 in IgG je pokazalo, da izčrpavanje Mϕ ni moduliralo imunskih kompleksov v tej nastavitvi. Reprezentativno imunofluorescenčno obarvanje in histopatologija sta prikazana na sliki 5. Primarna histopatološka značilnost je bila difuzna hipercelularnost glomerularnih šopov pri fh-/- miših s CSS, ki se je znatno zmanjšala ob izčrpanju Mϕs.

3.5. Makrofagi modulirajo citokine v ICGN, odvisnem od FH.

Enkrat Mϕsinfiltrirajo ledvicoin so izpostavljeni vnetnim dražljajem, sproščajo citokine. Z ELISA smo ovrednotili plazemske ravni TNF in IL-6 ter mCSF v ledvicah pri FHKO miših, zdravljenih s fiziološko raztopino, apoferitinom ali apoferitinom in klodronatom. Ravni IL-6 v obtoku so bile zelo nizke pri miših divjega tipa in zvišane pri miših FHKO ter znižane pri miših FHKO, zdravljenih s klodronatom (slika 6). Trije citokini, TNF, IL-6 in mCSF, so bili znatno povečani pri miših, zdravljenih z apoferitinom, v primerjavi s kontrolami, zdravljenimi s fiziološko raztopino. Zmanjšanje Mϕ s klodronatom je znatno omejilo dvig citokinov v tem okolju

3.6. Makrofagi modulirajo profibrozo

Molekule in laminin v ICGN, odvisnem od FH. Ko jeledvice razvijejo bolezen, postanejo fibrotični. Mϕ sodelujejo pri fibrotičnem procesu s prekomerno proizvodnjo profibrotičnih molekul. PCR v realnem času je razkril 75-odstotno povečanje izražanja mRNA transformirajočega rastnega faktorja beta1 (TGFbeta1), 100-odstotno povečanje izražanja metaloproteinaze-9 (MMP9) in 230-odstotno povečanje mRNA laminina. V skladu z ekspresijo mRNA se ekspresija proteina laminina znatno poveča pri fh-/- miših s CSS, ki je bila zmanjšana v odsotnosti Mϕs (slika 7).

4. Razprava

Naše nedavne študije so pokazale, da se v odsotnosti FH miši razvijejo difuznoproliferativni glomerulonefritis(GN) s F4/80+ Mϕs okoli mest IC [10]. Poleg tega naše študije kažejo, da imajo miši Cd11b-/- fh-/- poslabšane značilnosti glomerulonefritisa [26]. Glede na to, da bi lahko prisotnost povečanih vnetnih makrofagov M1 in njihova trajna aktivacija povzročila tkivno patologijo, njihova repolarizacija v protivnetni fenotip pa bi pomagala pri razrešitvi patologije bolezni, je bila trenutna študija opravljena za nadaljnje razumevanje vloge Mϕs pri fh -/- miši z ICGN. Povečana prisotnost Mϕs v ledvicah in razrešitev patologije bolezni z izčrpavanjem makrofagov med ICGN, ki ga posreduje FH, dokazujeta kritično vlogo Mϕs v tem okolju, zato bi lahko služili kot pomembne terapevtske tarče v tem okolju.

Slika 5: Zmanjšanje Mϕs zmanjša glomerulno patologijo pri ICGN, odvisnem od FH. Podane so reprezentativne slike glomerulov iz miši, zdravljenih s fiziološko raztopino (a), zdravljenih z apoferitinom (b) in miši s pomanjkanjem FH, zdravljenih z apoferitinom + klodronatom. V (A) so rezi obarvani s C3 (zeleno) in IgG (rdeče), medtem ko (B) prikazuje reze, obarvane s PAS. Depoziti IgG, ki so bili povečani z zdravljenjem z apoferitinom, so ostali nespremenjeni, medtem ko so bili glomeruli videti bližje normalnim ob izčrpanosti makrofagov.

Odsotnost FH vodi do povečane proizvodnje C5a. C5a se veže na C5aR1 in tako signalizira Mos v ledvico, kjer prispeva k vnetnemu okolju. Poleg tega so naše študije tudi pokazale, da se zdi, da v tej nastavitvi prekomernega nastajanja C5a inaktivacija C5a omejuje bolezen [10]. Aktivacija Mos povzroči, da postanejo polarizirani, vendar ostanejo v stanju kontinuuma [27]. Naši rezultati v tej študiji kažejo, da je bila glomerularna bolezen pri CSS zmanjšana pri fh-/- miših, pri katerih je bil Mϕ izčrpan, v primerjavi z fh-/- mišmi brez izčrpanosti makrofagov. Tako odstranitev Mϕs aleviranega ICGN pri fh-/- miših zmanjša patologijo bolezni. Vendar pa so Mϕ potrebni tudi za proces popravljanja in ker Mϕ spreminjajo stanja iz pro- v protivnetna stanja in obratno, si bomo v prihodnosti prizadevali razumeti, ali bi spreminjanje krajine Mϕs brez njihovega izčrpavanja lahko spremenilo patologijo bolezni.

Mϕ igrajo pomembno vlogo pri nastanku in vzdrževanju fibroze ter so vključeni tudi v zatiranje, razrešitev in odpravo fibroze [28]. Naši rezultati kažejo povečano izražanje markerjev CD204+ in CD206+ Mϕ, kar kaže na njihovo povečano prisotnost v tem okolju. Ker so ti Mϕ glavni vir profibrotičnih molekul, naši rezultati, ki kažejo povečanje TGF -1 kot tudi MMP9, kažejo, da bi ti Mϕ lahko neposredno in posredno prispevali k fibrotičnim procesom v ICGN, ki ga posreduje FH, prek različnih mehanizmov ( 1,3,8,44). TGF -1 lahko spremeni fibrozo z regulacijo citokinov. Poleg tega TGF -1 modulira biosintezo in izražanje C3 in faktorja B v monocitih [29], sprememba komplementa v imunskih celicah in ledvičnih celicah pa lahko olajša tkivno fibrozo [30]. Vendar pa je treba razvozlati natančne interakcije med makrofagi in komplementom, vpletene mehanizme, njihove vloge in razdelitev tkiv [31]. Naše študije so pokazale zmanjšano izražanje laminina pri miših z osiromašenim Mϕs v primerjavi z mišmi z zadostno količino Mϕ. Da bi bolje razumeli, kako FH uravnava fibrotični proces, moramo identificirati specifične podskupine Mϕ, ki so prisotne v ICGN, ki jih posreduje FH, in pojasniti prispevke vsake podskupine populacije. Te študije so pomembne, saj je komplementarna terapija postala klinična realnost. Inhibitorji so bili in se še naprej razvijajo proti različnim tarčam v kaskadi komplementa, ki bodo blokirali spodnje korake v poti aktivacije. Trenutno je eden od zaviralcev komplementa v klinični uporabi protitelo proti C5, ekulizumab [32]. Zato prepoznavanje komponent patogenega komplementa v bolezni in dopolnjevanje tega z regulacijo populacije Mϕs ni trivialna točka.

Slika 7: Odlaganje laminina vLedvice s pomanjkanjem FHz ICGN se zmanjša z izčrpanostjo Mϕs. (a) qRT-PCR za TGFB, MMP9 in laminin izmRNA ledvicizoliran iz miši po 5 tednih fiziološke raztopine in apoferitina ter 3 tednih klodronata. Izraz je normaliziran na GAPDH (n=6/skupino). (b) Reprezentativne fotomikrografije IF za obarvanje z lamininom v ledvicah istih skupin miši. ∗P < 0:01.

Če povzamemo, tukaj smo proučevali vlogo Mϕs v modelu ICGN, odvisnem od FH. Rezultate je mogoče uporabiti tudi v nastavitvah neregulirane aktivacije komplementa z imunskimi kompleksi, kot so tisti, opaženi pri različnih boleznih, vključno z lupusnim nefritisom, nefropatijo IgA in membransko nefropatijo. Prikazujemo pomen tako regulacije komplementa s FH kot statusa Mϕs pri bolezni. Tako ima farmakološko ciljanje kaskade komplementa in statusa Mϕs pri GN, ki ga posreduje IC, potencialno klinični pomen.

Reference

[1] T. Mijovic, A. Zeitouni in I. Colmegna,"Avtoimunska senzorinevralna izguba sluha: vmesnik otologija-revmatologija," Revmatologija, vol. 52, št. 5, str. 780–789, 2013. [2] M. Abongwa, KE Baber, RJ Martin in AP Robertson,"holinomimetik morantel kot zaviralec odprtih kanalčkov Ascaris suum ACR-16 nAChR," Nevretenčarska nevroznanost, vol. 16, št. 4, 2016.

[3] AS De Vriese, S. Sethi, J. Van Praet, KA Nath in FC Fer venza,"Ledvična bolezen, ki jo povzroča disregulacija alternativne poti komplementa: etiološki pristop," Časopis Ameriškega združenja za nefrologijo, vol. 26, št. 12, str. 2917– 2929, 2015. [4] RJ Quigg,"Komplement in avtoimunske glomerulne bolezni," Trenutne usmeritve v avtoimunosti, vol. 7, str. 165– 180, 2003. 

[5] MC Carroll,"Sistem komplementa pri uravnavanju adaptivne imunosti," Imunologija narave, vol. 5, št. 10, str. 981– 986, 2004. [6] MV Carroll in RB Sim,"Dopolnilo v zdravju in bolezni," Napredni pregledi dostave zdravil, vol. 63, št. 12, str. 965–975, 2011. 

[7] M. Noris in G. Remuzzi,"Pregled aktivacije in regulacije komplementa," Seminarji iz nefrologije, vol. 33, št. 6, str. 479–492, 2013. 

[8] VP Ferreira, AP Herbert, C. Cortes et al.,"Vezava faktorja H na kompleks fizioloških polianionov in C3b na celicah je motena pri atipičnem hemolitično uremičnem sindromu," Journal of Imunology, vol. 182, št. 11, str. 7009–7018, 2009.

[9] JJ Alexander, MC Pickering, M. Haas, I. Osawe in RJ Quigg,"Faktor komplementa h omejuje odlaganje imunskih kompleksov in preprečuje inflvnetje in brazgotinjenje v glomerulih miši s kronično serumsko boleznijo," Časopis Ameriškega združenja za nefrologijo, vol. 16, št. 1, str. 52–57, 2005.

[10] JJ Alexander, L. Chaves, A. Chang in RJ Quigg,"Receptor C5a ima ključno vlogo pri glomerulonefritisu imunskega kompleksa v faktorju komplementa H-defistarodavne miši," Kidney International, vol. 82, št. 9, str. 961–968, 2012. 

[11] CV Jakubzick, GJ Randolph in PM Henson,"Monocit differentiacijske in antigen predstavitvene funkcije," Nature Reviews. Imunologija, vol. 17, št. 6, str. 349–362, 2017. 

[12] Q. Cao, Y. Wang in DC Harris,"Heterogenost makrofagov, fenotipi in vloge v ledvicahfibroza," Kidney International. Dodatek, vol. 4, št. 1, str. 16–19, 2014.

[13] Q. Cao, Y. Wang, XM Wang et al.,"Ledvični mononuklearni fagociti F4/80+ CD11c+ kažejo fenotipske in funkcionalne značilnosti makrofagov pri zdravju in pri adriamicinski nefropatiji," Časopis Ameriškega združenja za nefrologijo, vol. 26, št. 2, str. 349–363, 2015.