Kompleksi mangana (II) spodbujajo protitumorsko imunost s poslabšanjem poškodb DNA in aktiviranjem poti CGAS-STING

Aktivacija ciklične GMP-AMP sintaze-stimulatorja poti gena za interferon (cGAS-STING) je obetavna imunoterapevtska strategija za zdravljenje raka. Ugotovljeno je bilo, da kompleksi mangana (II) MnPC in MnPVA (P=1, 10-fenantrolin, C=klor in VA=valprojska kislina) aktivirajo pot cGAS-STING . Kompleksi niso le poškodovali DNA, ampak so tudi zavirali histonske deacetilaze (HDAC) in poliadenozin difosfat-ribozno polimerazo (PARP), da bi preprečili popravilo poškodbe DNA in s tem spodbudili uhajanje fragmentov DNA v citoplazmo. Fragmenti DNA so aktivirali pot cGAS-STING, ki je sprožila prirojeni imunski odziv in dvosmerno komunikacijo med tumorskimi celicami in sosednjimi imunskimi celicami. Aktivirani cGAS-STING je dodatno povečal nastajanje interferonov tipa I in izločanje provnetnih citokinov (TNF-a in IL-6), kar je povečalo tumorsko infiltracijo dendritičnih celic in makrofagov ter stimuliralo citotoksične celice T za ubijanje rakavih celic in vitro in in vivo. Zaradi povečane sposobnosti poškodovanja DNA sta MnPC in MnPVA pokazala močnejšo imunokompetentnost in protitumorsko aktivnost kot ioni Mn 2+, s čimer sta pokazala velik potencial kot kemoimunoterapevtska sredstva za zdravljenje raka.

Prednosti cistanche tubulosa-Antitumor

Uvod

Ponovni pojav, metastaze in odpornost tumorjev na zdravila predstavljajo velike izzive za običajna protitumorska zdravila.1 Imunoterapija je učinkovita strategija za izkoreninjenje tumorskih celic z izkoriščanjem ali krepitvijo imunskega sistema bolnikov.2,3 V zadnjem desetletju so številne imunoterapije raka, vključno z zaviralce imunskih kontrolnih točk, onkolitični virus in celice himernega antigenskega receptorja T (CAR-T) so uporabili v klinični praksi za izboljšanje adaptivne protitumorske imunosti.4–6 Vendar primarna in adaptivna odpornost na zdravila, neustrezna imunska aktivacija in izguba za tumor specifične antigenske tarče pogosto spodkopavajo učinkovitost imunoterapije.7,8 Prilagodljiva protitumorska imunost je zelo odvisna od močne prirojene imunosti.8 Poleg oblikovanja in vzdrževanja adaptivne protitumorske imunosti prevzame prirojeni imunski sistem kot preostala ovira za obrambo gostiteljskih celic ključno odgovornost za prepoznavanje tumorskih celic.9 Na žalost se med napredovanjem tumorja maligne celice pogosto izognejo imunskemu nadzoru in se sčasoma razvijejo v "hladne" tumorje.10,11 Tako lahko aktiviranje prirojene imunosti in omogočanje njenega medsebojnega delovanja s prilagodljivo protitumorsko imunostjo okrepi imunski odzive na tumorje in izboljšanje terapevtskega učinka imunoterapije. Ciklični stimulatorji sintaze GMP-AMP genov za interferon (cGAS-STING) tvorijo vitalne komponente prirojene imunosti, ki so se izkazale kot obetavne tarče za imunoterapijo raka. 12,13 Aktivacija poti cGAS-STING sproži vrsto spodnjih signalni dogodki, vključno s stimulacijo in rekrutiranjem TANK-vezavne kinaze 1 (TBK1) in interferonskega regulatornega faktorja 3 (IRF3), ki inducirata sproščanje in izločanje interferonov tipa I (IFN-I) in proinflamatornih faktorjev IL-6 in TNF-a. 13,14 IFN-ji nato spodbujajo zorenje in migracijo dendritičnih celic (DC), povečajo citotoksični učinek, ki ga posredujejo celice naravnega ubijalca (NK), in navzkrižno primejo celice T, specifične za tumor, ter tako orkestrirajo prirojeno in prilagodljivo imunost za uravnavanje vedenja agresivnih tumorjev.15,16 Trenutno so terapevtski postopek z majhnimi molekulami oralnega agonista MSA-2,17 naravnih agonistov cikličnih dinukleotidov (CDN)18 in nekaterih nano-sistemov19–23 testirali na modelih mišjih tumorjev za posežejo v pot cGAS-STING. Mangan (Mn) je prehranski element v sledovih, ki igra pomembno vlogo v številnih fizioloških procesih, vključno z protitumorskimi imunskimi odzivi.24,25 Nedavno so odkrili, da ioni Mn2+ povečujejo občutljivost senzorja dvoverižne DNA (dsDNA). cGAS in sproži proizvodnjo sekundarnega posrednika cGAMP, s čimer poveča aktivnost STING s povečanjem afinitete vezave cGAMP-STING.12,26 Poleg tega ioni Mn2+ posredno zavirajo napredovanje tumorja s spodbujanjem delovanja CD8+ T celice z indukcijo proizvodnje IFN in vivo. 27 Kljub temu neposredna uporaba ionov Mn2+ in vivo ne more zagotoviti učinkovite koncentracije v tumorskem mikrookolju23, čezmerni ioni Mn2+ pa lahko povzročijo sistemske toksičnosti, kot sta ireverzibilna nevrotoksičnost in kardiovaskularna toksičnost.28 Kompleksi Mn so bolj stabilen in inerten za biomolekule zaradi zaščitnega učinka ligandov in bi tako lahko ublažil toksičnost Mn2+ ionov. Vendar pa doslej še ni bil uporabljen noben kompleks Mn za aktiviranje poti cGAS-STING. Epigenetske modifikacije reverzibilno spremenijo izražanje genov, kar lahko prispeva k nastanku in napredovanju raka ter zatiranju protitumorske imunosti. Reverzibilna narava epigenetske modifikacije dovoljuje malignim celicam, da se vrnejo v normalno stanje.29,30 Histonske deacetilaze (HDAC) posredujejo pri acetilaciji beljakovin, dinamiki kromatina, presnovi beljakovin in odzivih na poškodbe DNA. Zaviralci HDAC so razred močnih epigenetskih modulatorjev s kromatinom kot tarčo, ki delujejo na večino ali vse tipe tumorjev.31 Inhibicija HDAC vsaj delno prispeva k acetilaciji histona, kar ima za posledico spremenjeno tvorbo in popravilo preloma dvojne verige DNA ( DSB), 32, 33 kar lahko prispeva k odpravi odpornosti na zdravila v rakavih celicah. 34 Sproščena struktura kromatina, ki jo povzročijo zaviralci HDAC, lahko spodbudi kemoterapevtska sredstva k lažjemu dostopu do DNK, s čimer se poslabša poškodba DNK, 35 kar je koristno za aktivacijo pot cGAS STING. Nekateri zaviralci HDAC – kot je valprojska kislina (VA) – vplivajo na HDAC razreda I in II (HDAC1/2), ki povečajo občutljivost rakavih celic na terapije, ki poškodujejo DNA.36

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

Poliadenozin difosfat-riboza polimeraze (PARP) so bistvene beljakovine, ki sodelujejo pri odpornosti raka na kemoterapije. Ti encimi so ključnega pomena za popravilo prelomov ene verige DNA (SSB)37 in sodelujejo pri številnih celičnih procesih, kot so apoptoza, imunski odziv, transkripcija genov in vnetje.38–40 Zaviralci PARP preprečujejo popravilo lezij DNA, kar vodi do obogatitve citosolne DNA, ki jo cGAS prepozna za aktiviranje poti cGAS-STING.41,42 Ugotovljeno je bilo, da vrsta kovinskih kompleksov proti raku, vključno s tistimi iz platine, rutenija in zlata, zavira aktivnost PARP.43, 44 Tukaj poročamo o imunostimulirajočih in protitumorskih lastnostih dveh MnII kompleksov MnPC in MnPVA. Kemične in kristalne strukture kompleksov so prikazane na sliki 1. V teh kompleksih je 1,10-fenantrolin (P) netoksičen interkalator DNA, VA pa zaviralec HADC.31 VA lahko spodbuja acetilacijo histonskih proteinov, konjugiranih z DNA, povečajo dostopnost DNA znotraj sproščenega kromatina in ponovno aktivirajo mirujoče tumorske supresorske gene. kompleksi z antiproliferativnim delovanjem z indukcijo poškodbe DNA in stimulacijo protitumorske imunosti. Serija poskusov je pokazala, da sta MnPC in MnPVA učinkovito poškodovala DNA, aktivirala pot cGAS-STING v tumorskih in imunskih celicah ter povečala izločanje IFN in pro-vnetnih citokinov. Zlasti je MnPVA zaviral aktivnost HDAC1/2 in PARP1, s čimer je bolj učinkovito aktiviral pot cGAS-STING kot MnPC. Vsi rezultati so bili potrjeni in vitro in in vivo. Kolikor nam je znano, sta MnPC in MnPVA prva večnamenska kompleksa MnII, ki zavirata tumorske celice predvsem z aktiviranjem protitumorske imunosti preko poti cGAS-STING, ki jo sproži poškodba DNK.

Slika 1 Kemične in kristalne strukture MnPC in MnPVA. Atomi vodika so zaradi jasnosti izpuščeni.

Rezultati in razprava

Kemijske in fizikalne lastnosti

MnPC in MnPVA sta bila pripravljena v skladu z metodami iz literature 45, 46 in v celoti označena z elementarno analizo, IR spektroskopijo (slika S1†), elektronsko paramagnetno resonanco (slika S2, † EPR) in rentgensko kristalografijo. Parametri kristalne strukture ter izbrane vezne dolžine in koti so predstavljeni v tabelah S1 in S2 (glej ESI†). Atom Mn v teh kompleksih je pokazal popačeno oktaedrično geometrijo s koordinatnim številom 6. MnPC je kristaliziral v monokliničnem kristalnem sistemu s prostorsko skupino P21/c; MnII je tvoril štiri Mn–N vezi z dvema bidentatnima 1,{{10}}fenantrolin ligandama in dvema Mn–Cl vezema. Dolžine vezi Mn–N se gibljejo med 2,281 in 2,369 Å, kar pomeni, da je dolžina vezi Mn–N1, Mn–N2, Mn–N3 in Mn–N4 2,369(4), 2,281(3), 2,341(3). ) oziroma 2,287(3) Å, kot N1–Mn–N2, N1–Mn–N4 in N2– Mn–N3 pa je 71,15(11) stopinj, 97.86(11) stopinja oziroma 89.00(11) stopinja. Ta struktura je nekoliko drugačna od tiste, o kateri so poročali Abbas et al., 45 kjer je MnPC kristaliziral v trikliničnem kristalnem sistemu s prostorsko skupino P1. V skladu s tem se ustrezne dolžine in koti vezi v teh primerih razlikujejo. Podobno kot poročana struktura,46 MnPVA kristalizira v monokliničnem kristalnem sistemu s prostorsko skupino C2/c, ki ima donorski niz N2O4. MnII usklajen z dvema atomoma N iz 1,10-fenantrolina in štirimi atomi O iz ene molekule vode oziroma dveh ligandov VA. Eden od VA je reagiral kot monodentatni ligand, medtem ko je bil drugi bidentatni ligand. Dolžina vezi Mn–N1 in Mn–N2 je 2,265(19) oziroma 2,298(2) Å, dolžina vezi Mn–O1, Mn–O2, Mn–O3 in Mn–O5 pa 2,2476(19), 2,260 (2), 2,0639 (18) oziroma 2,1471 (17) Å. Kot močan N, kelacijski ligand, 1,10-fenantrolin stabilizira Mn komplekse pred demetalacijo. Stabilnost MnPC in MnPVA v fiziološki raztopini s fosfatnim pufrom (PBS, z 0,5 % v/v DMSO, pH 7,4 in 37 stopinj) in gojiščih celične kulture (ki vsebujejo 10 % FBS) so raziskali z UV vidno spektroskopijo (slika S3† ). Časovno odvisni UV spektri kažejo, da so ti kompleksi stabilni v 72 urah.

Tabela 1 Vrednosti IC50 (mM) MnPC in MnPVA proti različnim celičnim linijam po 72 urah, z MnCl2, VA, CDDP in P kot referencami. Podatki so prikazani kot povprečje ± standardni odklon (SD, n=3)

Antiproliferativno delovanje

Antiproliferativne aktivnosti spojin proti trojno negativnemu raku dojke pri človeku (MDA-MB-231), raku trebušne slinavke pri človeku (PANC-1), celici hepatocelularnega raka pri ljudeh (HepG2), celicah mišjega raka dojke (4T1) linije in človeško normalno ledvično tubulno epitelno (HK-2) celično linijo smo ovrednotili s testom MTT. Kot referenčne spojine smo uporabili MnCl2, VA, cisplatin (CDDP) in 1,10-fenantrolin (P). Polmaksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) po 72 urah so navedene v tabeli 1. MnPC in MnPVA sta pokazala močno antiproliferativno aktivnost proti vsem testiranim rakavim celičnim linijam, zlasti proti MDA-MB-231 in PANC-1 celice, ki so neobčutljive na CDDP in kažejo približno 8- oziroma 11--krat večjo aktivnost. Antiproliferativna aktivnost MnPC in MnPVA proti HepG2 in 4T1 je podobna aktivnosti CDDP. Zanimivo je, da sta tako MnPC kot MnPVA pokazala zmanjšano toksičnost za celice HK-2, pri čemer so bile vrednosti IC50 nekoliko višje od vrednosti CDDP. Nasprotno pa so bili MnCl2, VA in P v teh celičnih linijah skoraj netoksični, kar se ujema z literaturo.13,36 Glede na te rezultate so bile naslednje raziskave osredotočene na delovanje MnPC in MnPVA na MDA-MB -231 celic.

Celični privzem in poškodbe DNK

Kopičenje kompleksov v celicah MDA-MB-231 glede na Mn smo izmerili s soinkubacijo ICP-MS 24 ur. Kot je prikazano na sliki 2A, kopičenje sledi vrstnemu redu MnPVA > MnPC > MnCl2, pri čemer je v skladu z njihovo antiproliferativno aktivnostjo. Z ICP-MS smo nadalje določili na DNA vezan Mn v celicah MDA-MB-231. Kot je prikazano na sliki 2B, sta MnPC in MnPVA pokazala večjo sposobnost vezave DNA kot MnCl2, verjetno zaradi večjega privzema v celice. Fosforilirani histon g-H2AX je občutljiv marker dvoverižnih prelomov DNA (DSB).47 Za ovrednotenje poškodbe DNA, ki jo povzročajo kompleksi Mn, smo odkrili izražanje gH2AX z imunoblotingom. Kot je prikazano na sliki 2C, sta MnPC in MnPVA povečala izražanje g-H2AX v celicah MDA-MB-231 po 24 urah. Znano je, da so kovinski kompleksi P učinkoviti interkalatorji DNK; 48, 49 vendar P sam po sebi skoraj ni povzročil poškodb DNK (slika S4†). Ekspresijo g-H2AX v tumorskih tkivih miši s tumorjem 4T1 so raziskali tudi z zdravljenjem imunosti na prisotnost in ER z vsako spojino (1,3 mg Mn na kg) enkrat na 2 dni 16 dni. MnPC in MnPVA sta učinkovito poškodovala DNA v tumorskem tkivu, medtem ko sta MnCl2 in PBS komaj vplivala na g-H2AX (slika S5†). DSDNA, sproščena iz celic MDA-MB- 231 v supernatant gojišča kulture, je bila določena z uporabo kompleta ELISA po obdelavi s kompleksi Mn. Kot je prikazano na sliki 2D, je bila vsebnost dsDNA v mediju celične kulture, obdelanem z MnPC ali MnPVA, očitno višja kot v drugih skupinah. Rezultati kažejo, da lahko MnPC in MnPVA povečata nestabilnost genomske DNK in raven citosolne DNK. Naravo poškodbe DNK so prvič proučevali z merjenjem fluorescenčnih sprememb sistema DNK telečjega timusa in etidijevega bromida (EB). EB je interkalator, ki znatno poveča fluorescenco, ko je vezan na DNA, medtem ko se fluorescenca zmanjša, ko je izpodrinjen.50 MnPC in MnPVA sta zmerno zmanjšala intenzivnost fluorescence (slika S6†), kar kaže na to, da bi se ti kompleksi lahko interkalirali v utore DNA, da nadomesti vezani EB zaradi planarne strukture P. Vendar pa interakcija ni robustna kovalentna vezava. Nekateri kompleksi Mn lahko ustvarijo znotrajcelične reaktivne kisikove vrste (ROS) in inducirajo oksidativni stres,51 zato smo zaznali ROS v celicah MDA-MB-231 s konfokalnim slikanjem z uporabo 2′,7′-dikloro-fluorescein diacetata ( DCFH-DA) kot ROS fluorescenčna sonda po 18-urni izpostavljenosti kompleksu Mn. Kot je prikazano na sliki 3, sta MnPC in MnPVA okrepila intracelularno ROS fluorescenco v primerjavi s kontrolo ali MnCl2, zlasti MnPVA, kar kaže, da lahko povzročita oksidativno poškodbo celične DNA. Poškodba DNK ne le prispeva k ubijanju rakavih celic, ampak tudi spodbuja protitumorsko imunost z aktiviranjem poti cGAS-STING.14,52

Slika 2 Celični privzem (A) in Mn, vezan na DNA (B), določen z ICPMS, izražanje markerja poškodbe DNA g-H2AX, določeno z western blotom (C), in zunajcelična dsDNA, določena z uporabo kompleta ELISA (D) po Celice MDA-MB-231 smo 24 ur obdelali z MnCl2, MnPC, MnPVA in VA (6 mM).

Ustavitev celičnega cikla in apoptoza

Odziv na poškodbe celične DNA (DDR) je povezan s signalizacijo, ki poganja zajem kontrolne točke celičnega cikla.53 Vpliv kompleksov Mn na celični cikel celic MDA-MB-231 je bil analiziran s pretočno citometrijo. Kot je prikazano na sliki 4A, sta MnPC in MnPVA rahlo povečala zaustavitev faze G1, medtem ko sta povzročila popoln kolaps faze G2 v primerjavi s kontrolo in MnCl2. Rezultati kažejo, da je poškodba DNK, ki jo povzročata MnPC in MnPVA, resno blokirala poznejšo stopnjo sinteze DNK. Zato se antiproliferativni mehanizem MnPC in MnPVA razlikuje od mehanizma MnCl2. Način smrti celic MDA-MB-231 smo raziskali s pretočno citometrijo po 72-urnem zdravljenju s kompleksi in obarvanju z aneksinom V-FITC in propidijevim jodidom (PI). Kot je prikazano na sliki 4B in S7,† je v primerjavi s kontrolo in MnCl2 stopnja apoptoze (zgodnja + pozna), inducirana z MnPC in MnPVA, dosegla 84.0% oziroma 87,4%. Rezultati kažejo, da imata MnPC in MnPVA močno pro-apoptotično sposobnost, ki je tesno povezana z njuno protitumorsko aktivnostjo.

koristi dodatka cistanche-povečanje imunosti

Potencial mitohondrijske membrane

Mitohondriji so osrednji udeleženci prirojene imunosti in mitohondrijska DNK (mtDNK) je prepoznana kot agonist prirojenega imunskega sistema.54 Poročali so, da sta se tako citosolna DNK kot mtDNK vezali na receptorje za prepoznavanje vzorcev in sprožili signalno pot cGAS-STING. 55 Da bi raziskali možno sproščanje mtDNA iz mitohondrijev v prisotnosti MnPC in MnPVA, smo preverili celovitost mitohondrijske membrane s konfokalnim slikanjem z uporabo JC-1 kot fluorescentne sonde, ki tvori agregate in prikazuje rdečo fluorescenco v normalnih mitohondrijih z visokim DJm, medtem ko obstaja kot monomer in oddaja zeleno fluorescenco v poškodovanih z nizkim DJm. 56 Kot je prikazano na sliki 5, sta MnPC in MnPVA močno zmanjšala intenzivnost rdeče fluorescence v celicah MDA-MB-231, obarvanih z JC-1. Razmerje "zelene (G) proti rdeči (R)" fluorescence za celice, obdelane z MnPC in MnPVA, je 4,91 oziroma 5,66, kar je bistveno višje kot pri kontrolnih (2,35) in celicah, obdelanih z MnCl2- ( 1,75). Opazovanja kažejo, da sta MnPC in MnPVA poškodovala celovitost mitohondrijske membrane, kar lahko olajša uhajanje mtDNA v citosol, da se sproži pot cCAS-STING.

Slika 3 Fluorescenčno konfokalno slikanje ROS, ki ga ustvarijo kompleksi Mn (12 mM) v celicah MDA-MB-231 po 18-urni inkubaciji in 30-minutnem barvanju z DCFH-DA (10 mM).

Slika 4 Zastoj celičnega cikla celic MDA-MB-231 po inkubaciji z različnimi spojinami (6 mM) 24 ur (A) in apoptotična analiza celic MDA-MB-231 s pretočno citometrijo po inkubaciji z različnimi spojinami (6 mM) 72 h (B).

Dejavnost in izražanje HDAC

Zaviralci HDAC senzibilizirajo rakave celice za terapije, ki poškodujejo DNA, tako da spremenijo strukturo kromatina in ovirajo popravilo DNA. 33, 35 Kot zaviralec HDAC razreda I VA selektivno cilja na encima HDAC1 in HDAC2, modulira signalizacijo poškodbe DNA, da uniči genomsko stabilnost in zavira tumor. proliferacijo in vivo. 31 Vključitev VA v MnPVA lahko učinkoviteje okrepi inhibicijo HDAC in indukcijo DDR. Zato smo določili učinek kompleksov Mn na skupno aktivnost HDAC v celicah MDA-MB-231 po 48-urni koinkubaciji. Kot je prikazano na sliki 6A, je MnPVA znatno zaviral celotno aktivnost HDAC, pri čemer je bila inhibitorna aktivnost približno 1,5-krat višja kot pri VA. Nadalje smo proučevali izražanje proteinov HDAC1/2 v celicah MDA-MB-231 z imunoblotingom. Kot je prikazano na slikah 6B in C, je MnPVA očitno znižal ekspresijo HDAC1 in HDAC2 v primerjavi s kontrolo. Čeprav je MnPC zaviral aktivnost HDAC, skoraj ni vplival na izražanje proteinov HDAC1/2. Nepričakovano VA kot znani zaviralec HDAC ni pokazal očitne inhibicije na HADC1/2 pri tej koncentraciji (6 mM), kar je poudarilo bistveno vlogo koordinacije Mn pri intenziviranju inhibicije VA na HADC. Rezultati kažejo, da je MnPVA učinkovit zaviralec HDAC1/2, ki bi spodbujal DDR in sprožil pot cGAS-STING ter s tem spodbudil protitumorsko imunost. Nadalje smo odkrili ekspresijo HDAC v tumorskih tkivih miši, ki nosijo tumor 4T1, z imunofluorescenco po zdravljenju z vsako spojino. Kot je prikazano na sliki 6D, je MnPVA očitno zmanjšal izražanje HDAC1, medtem ko sta MnPC in MnCl2 le malo ali komaj vplivala na HDAC1.

Prednosti cistanche tubulosa-Antitumor

Izražanje PARP1 in apoptotičnih proteinov

PARP igrajo ključno vlogo pri popravljanju poškodb DNK. Zaviralci PARP preprečujejo popravilo DNK, kar vodi do izvoza fragmentov DNK v citosol, kar sproži prirojeni imunski odziv, ki ga posreduje cGAS.42 Kot senzorski protein za pretrganje verig DNK se PARP1 lokalizira na mesta poškodbe DNK in prevladuje pri popravljanju DNK. DNK, ki je tako postala pomembna tarča za zdravljenje raka. Aktivacija kaspaz, zlasti kaspaze-3, bi lahko sprožila apoptozo s cepitvijo PARP1, ki velja za znak apoptoze.38,57 Zato izrazi kaspaze-3, PARP1 in odcepljenega PARP1 v Celice MDA-MB-231 smo pregledali z western blotom. Kot je prikazano na sliki 7, sta MnPC in MnPVA izjemno povečala izražanje kaspaze-3 in cepila PARP1 v primerjavi s kontrolo in drugimi spojinami. Cepitev PARP1 z aktivirano kaspazo-3 bi ločila domeno, ki veže DNA, od katalitične domene, s čimer bi preprečila aktivacijo PARP in popravilo lezij DNA. Poleg tega lahko inhibicija PARP1 poveča raven T-limfocitov, ki infiltrirajo tumor, in uravnava prirojene imunske odzive. Disfunkcija popravljanja DNK lahko sproži globalne aberacije DNK, ki bi lahko sprožile apoptozo. Proapoptotični Bax in antiapoptotični proteini Bcl-xL igrajo ključno vlogo pri apoptozi.38 Zato smo odkrili njihovo izražanje v celicah MDAMB-231 po 48-urnem zdravljenju z različnimi spojinami z uporabo Western blottinga. MnPC in MnPVA sta izrazito povečala ekspresijo Bax in znižala ekspresijo Bcl-xL. Rezultati kažejo, da lahko MnPC in MnPVA spodbujata apoptozo z uravnavanjem apoptotičnih proteinov kot kaskadnega učinka, povezanega s PARP1-. Čeprav lahko VA inducira apoptozo tumorskih celic z zaviranjem ekspresije HDAC1/2 pri visokih odmerkih,58 pod tem pogojem ni pomembno vplival na te apoptotične proteine, kar pomeni superiornost kompleksov Mn.

Slika 5 Fluorescenčne slike celic MDA-MB-231 po 36-urni inkubaciji z MnCl2, MnPC oziroma MnPVA (6 mM) in obarvanju s fluorescentno sondo JC-1.

Aktivacija poti cGAS-STING

Znano je, da lahko zaviralec PARP1 izzove signalni kaskadni odziv cGAS-STING v rakavih celicah.40,59 cGAS je prirojeni imunski senzor, ki prepozna raznolik niz citosolne dsDNA, vključno z DNA z virusnimi, apoptotičnimi, eksosomskimi, mitohondrijskimi in mikrojedri , in izvor retroelementov.60,61 Obogatitev citosolne DNA, ki jo inducirata MnPC in MnPVA, je ustvarila ugodne okoliščine za aktiviranje poti cGAS-STING, ki bi nato sprožila signalne dogodke navzdol preko rekrutacije in aktivacije TBK1 in IRF3.12,59 Zato smo odkrili izražanje teh proteinov v celicah MDA-MB-231 z imunoblotingom po 24-urni izpostavljenosti vsaki spojini. Kot je prikazano na sliki 8A, sta MnPC in MnPVA znatno povečala izražanje cGAS, p-STING, p-TBK1 in p-IRF3. Poleg tega smo raziskali učinek kompleksov na pot cGAS-STING v celicah človeške monocitne levkemije THP-1 z imunoblotingom. Kot je prikazano na sliki 8B, sta MnPC in MnPVA inducirala znatno povečano regulacijo cGAS, p-STING, p-TBK1 in p-IRF3, zlasti MnPVA, kar kaže, da sta aktivirala pot cGAS-STING, ki bi sprožila prirojeno imunost za blokiranje tumorju pobegniti in spodbuditi adaptivno imunost, ne da bi poškodovali celice THP-1 (tabela S3†). Nasprotno pa je MnCl2 le zvišal raven p-STING ali p-TBK1 in komaj vplival na izražanje cGAS in p-IRF3 v primerjavi s kontrolo, kar je lahko posledica njegove nezmožnosti induciranja poškodbe DNA in cepitve PARP1 pri nizkih koncentracijah. , in tako ne more sprožiti signalizacijskih dogodkov navzdol, kot je aktivacija p-IRF3. Na podlagi teh rezultatov sklepamo, da sta MnPC in MnPVA povzročila poškodbo jedrske in mitohondrijske DNK znotraj tumorskih celic in sprostila fragmente DNK v citoplazmo, ki je nato aktivirala pot cGAS-STING. Aktivirani cGAS-STING lahko neposredno aktivira signalne poti staranja in apoptoze v rakavih celicah,62 kar vodi do dvosmernega protitumorskega imunskega odziva. Kljub temu je bila ekspresija STING, TBK1 in IRF-3 v celicah MDA-MB-231 in THP-1 komaj prizadeta (slika S8†).

Slika 6 (A) Aktivnost HDAC, (B) ekspresija proteinov HDAC1/2 in (C) ustrezna vsebnost beljakovin glede na GAPDH v celicah MDA-MB-231 po inkubaciji z vsako spojino (6 mM) za 48 h, določeno z uporabo kompleta ELISA oziroma western blottinga; (D) imunofluorescenčne slike izražanja HDAC1 v tumorskem tkivu 4T1 miši po zdravljenju z vsako spojino (1,3 mg Mn na kg) enkrat na 2 dni 16 dni. *p < 0.05, **p < 0.01 in ***p < 0.001.

Interferoni in proinflamatorni citokini

Aktivacija TBK1 in IRF3 bi lahko inducirala izražanje in izločanje IFN-jev in vnetnih citokinov, kot so IFN-b, TFN-a in IL-6.59,63 Tako zunajcelični IFN-I, ki ga sprošča THP{ Celice {8}} ter IFN-b, TNF-a in IL-6, ki jih sproščajo celice MDAMB-231, so izmerili s testom ELISA po inkubaciji z različnimi spojinami 24 ur. Kot je prikazano na sliki 9, sta MnPC in MnPVA dramatično povečala izločanje IFN-I glede na kontrolo, MnCl2 in VA. Hkrati so sprožili tudi izločanje IFN-b in TNF-a. Vendar je bila raven IL-6 le zmerno povečana. IFN-I (IFN-a in IFN-b) ima več imunostimulacijskih vlog pri protitumorski imunosti, kot je spodbujanje zorenja in predstavitve antigena DC in navzkrižno pripravo tumorskih specifičnih celic T za ubijanje tumorskih celic s premostitvijo prirojene in adaptivne imunosti.13 TNF -a je vključen v akutno rakavo nekrozo, ki jo povzroča ciklični dinukleotid (CDN), in prilagoditev imunskega sistema.59 Rezultati kažejo, da lahko MnPC in MnPVA stimulirata protitumorske imunske odzive in nakazujeta, da lahko premagata odpornost tumorjev na zdravila z kemoimunoterapevtski mehanizem.

Zorenje celic, pridobljenih iz kostnega mozga (BMDC)

BMDC predstavljajo heterogene celice mieloidnega izvora, sestavljene iz mieloidnih progenitorjev in nezrelih makrofagov, granulocitov in dendritičnih celic (DC); sodelujejo pri imunskem odzivu z zaviranjem aktivacije celic T in aktivacije makrofagov, povezanih s tumorjem (TAM). 22

Slika 7 Ekspresija proteinov, povezanih s popravilom DNA in apoptozo, v celicah MDA-MB-231 po 48-urni izpostavljenosti različnim spojinam (6 mM) in ustrezna vsebnost beljakovin glede na a-tubulin. *p < 0.{{10}}5, **p < 0,01 in ***p < 0,001.

Slika 8 Ekspresija proteinov, vključenih v pot cGAS-STING, določena z western blotiranjem, potem ko so bile celice MDA-MB-231 (A) in THP-1 (B) obdelane s 6 in 3 mM različnih spojin 24 ur in ustrezno vsebnost beljakovin glede na GAPDH. *p < 0.{{10}}5, **p < 0,01 in ***p < 0,001.

Slika 9. Izločanje (A) IFN-I v celicah THP-1, (B) IFN-b, (C) IL-6 in (D) TNF-a v MDA-MB{{ 7}} celic po obdelavi z različnimi spojinami (6 mM) 24 ur. Podatki so prikazani kot povprečje ± SD (n {{10}}); *p < 0.05, **p < 0,01 in ***p < 0,001.

Zreli in aktivirani DC lahko predstavijo specifičen antigen limfocitom T in sprožijo adaptivni odziv proti tumorjem.65 Da bi preizkusili, ali lahko pot cGAS-STING, aktivirana z MnPC in MnPVA, inducira zorenje BMDC, smo testirali površinske markerje na BMDC z Pretočna citometrija je obdelana s supernatantom celic MDA-MB-231, inkubiranih z različnimi spojinami 24 ur. Kot je prikazano na sliki 10A, sta MnPC in MnPVA v primerjavi s kontrolo opazno povečala sočasno izražanje markerjev zorenja CD86 in CD80, tako da sta dosegla 36,62 % oziroma 43,15 %. Vendar je MnCl2 le zmerno presegel kontrolo. Poleg tega glavni histokompatibilni kompleks razreda II (MHC-II) konstitutivno izražajo APC, ki predstavljajo antigenske peptide celicam T. Posledično se sprožijo, vzdržujejo in uravnavajo adaptivni imunski odzivi.8 Kot je prikazano na slikah 10B in C, sta MnPC in MnPVA povečala izražanje MHC-II na približno 1.5-krat več kot pri kontroli . Podatki kažejo, da so ti kompleksi močno inducirali zorenje BMDC, kar lahko sproži imunske odzive citotoksičnih limfocitov T.

Slika 10 (A) Sočasno izražanje CD86 in CD80, (B) kvantitativne analize CD11c+CD86+CD80+ v BMDC, (C) izražanje MHC-II na površini BMDC in (D) povprečna intenzivnost MHC-II, določena s pretočno citometrijo po obdelavi s supernatantom celic MDA-MB-231, inkubiranih z različnimi spojinami (6 mM) 24 ur.

Sokultura rakavih celic s PBMC

Za nadaljnjo oceno imunomodulatornih učinkov kompleksov je bila sposobnost preživetja celic MDA-MB-231 v prisotnosti z zdravilom aktiviranih mononuklearnih celic periferne krvi človeka (PBMC) ovrednotena s testom MTT v skladu z metodo iz literature.66 Rakave celice ali rakave celice s PBMC so bile določene kot kontrole. Kot je prikazano na sliki 11, sta v odsotnosti PBMC MnPC in MnPVA zmanjšala viabilnost celic na 64,98 % oziroma 62,02 %. Sokultura celic s PBMC brez kompleksa Mn je pokazala samo bazalno citotoksičnost s povprečno viabilnostjo celic 81,49 %. Vendar sta v prisotnosti PBMC MnPC in MnPVA zmanjšala viabilnost celic na 38,19 % oziroma 36,98 %. Pri tej koncentraciji (6 mM) je večina PBMC še vedno živih (slika S9†). Rezultati kažejo, da lahko MnPC in MnPVA aktivirata imunski odziv PBMC za izvajanje citotoksičnih učinkov na celice MDA-MB-231, s čimer izkazujeta pomemben sinergistični učinek proti rakavim celicam.

Akutna toksičnost in protirakavo delovanje in vivo

Akutno toksičnost kompleksov MnII so ocenili na samicah miši Balb/c. Določeni so bili srednji smrtni odmerek (LD50) in spremembe telesne teže po intravenskem injiciranju vsakega kompleksa. LD50 MnPC in MnPVA je bil 16.08 ± 2,16 oziroma 25,16 ± 3,19 mg kg−1 (slika S10†), kar je veliko višje od tistega CDDP (4.{{60}}6 ± 1.02 mg kg−1).67 Pri miših, zdravljenih z MnPC in MnPVA, niso opazili nobenih pomembnih sprememb telesne teže. Rezultati kažejo, da sta MnPC in MnPVA nizko strupena za sesalce. Zanimivo je, da je vezava VA na kompleks Mn zmanjšala splošno toksičnost ali povečala biokompatibilnost. Poleg tega so bili vzpostavljeni mišji modeli z rakom dojke 4T1 za oceno protirakave aktivnosti MnPC in MnPVA in vivo. Kot je prikazano na sliki 12, sta po zdravljenju miši s PBS, MnCl2, MnPC in MnPVA (1,3 mg Mn na kg) 16 dni MnPC in MnPVA pokazala učinkovitejšo inhibicijo rasti tumorja kot MnCl2. 16. dan se je povprečna prostornina tumorja (A, B) zmanjšala na 554,78 ± 43,76 oziroma 348,01 ± 39,61 mm3 pri miših, zdravljenih z MnPC in MnPVA, medtem ko je bila pri miših, zdravljenih s PBS in MnCl2- zdravljenih miših je bil 1182,01 ± 95,87 oziroma 784 ± 64,93 mm3. Povprečna masa tumorja (C) je bila 1,41 ± 0,13, 0,95 ± 0,19, 0,82 ± 0,19 in 0,59 ± 0,1 g za miši, zdravljene s PBS-, MnCl2-, MnPC- oziroma MnPVA. Očitno je bil zaviralni učinek MnPVA na tumor boljši od učinka MnPC in MnCl2, kar je lahko posledica učinkovite inhibicije izražanja HDAC z MnPVA. Poleg tega niso opazili nobenih očitnih patoloških nepravilnosti ali lezij na telesni teži (D), preživetju in grobi anatomiji organa (slika S11†). Ti rezultati kažejo, da so kompleksi MnII obetavni kandidati za zdravila za zdravljenje raka.

Slika 11 Povprečna sposobnost preživetja (%) celic MDA-MB-231 po soinkubaciji s PBMC, aktiviranimi s spojino (6 mM) 48 ur. Podatki so prikazani kot povprečje ± SD (n=3); **p < 0.01 in ***p < 0,001.

In vivo imunski odziv proti raku

In vivo imunsko stimulativno sposobnost kompleksov MnII so testirali na miših Balb/c, ki so nosile tumorje 4T1. Stanje imunskih celic v tumorju, vranici in limfnih vozlih, ki drenirajo tumor (LN), je bilo analizirano s pretočno citometrijo.21 CD8+ T celice so bistvene za omejevanje nastanka raka in malignega napredovanja v imunskem sistemu, in indukcija citotoksičnih limfocitov T (CTL) zahteva aktivacijo nezrelih DC v zrele celice,8,9 ki so bile označene kot CD11c+ CD80+ CD86+ celice.68 Kot je prikazano na slikah 13A in B , pri miših, zdravljenih z MnPVA, je bil odstotek zrelih DC, označenih z izražanjem kostimulatornih receptorjev CD80+ in CD86+ (ref. 69), višji (45,59 %) v LN kot tisti obdelani s PBS, MnCl2 oziroma MnPC. Makrofagi so sestavni deli imunskega sistema, ki modulirajo tumorsko mikrookolje.70 Makrofage lahko glede na funkcije razvrstimo v fenotipska stanja tumoricidne M1 in protumoralne M2.71 Makrofage M1 označuje TNF-a, IL-12 , CD80, CD86 in neposredno ubijanje tumorskih celic,70 medtem ko je za M2-podobne TAM značilno visoko izražanje makrofagnega manoznega receptorja 1 (MMR ali CD206) in spodbujanje rasti tumorskih celic, kot ima tudi močno imunosupresivno delovanje. Znano je, da lahko inhibitorji HDAC okrepijo pro-in-motion shis v polarizaciji makrofagov in okrepijo fenotip M1 poleg preprečevanja popravljanja DNA.72 Zato smo s pretočno citometrijo odkrili polarizacijo makrofagov v vranici in tumorju po zdravljenju z Mn kompleksi. Kot je prikazano na slikah 13C–E in S12A–C,† je bil fenotip M2, označen s CD206+, znatno potlačen, fenotip M1, označen s CD86+, pa se je izjemno povečal pri miših, zdravljenih z MnPVA. Rezultati kažejo, da je MnPVA učinkovito induciral polarizacijo makrofagov iz fenotipa M2 v fenotip M1. MnCl2 in MnPC sta prav tako povečala izražanje CD86, vendar sta le rahlo vplivala na CD206 v primerjavi s PBS. Medtem so bili z ELISA izmerjeni IFN-b, IL-6 in TNF-a, ki jih izločajo zreli DC in makrofagi. Kot je prikazano na slikah 13F in G, je MnPVA povečal ravni IFN-b in TNF-a učinkoviteje kot PBS, MnCl2 in MnPC, kar lahko spodbudi celice T, da ubijejo tumorske celice. Vendar pa niso opazili bistvene spremembe IL-6 (slika S13†).

Slika 12 Terapevtski učinek MnPC, MnPVA in MnCl2 na miših s tumorjem 4T1, z uporabo PBS kot kontrole. (A) Slike izrezanih tumorjev, (B) volumen tumorja, (C) masa tumorja in (D) telesna teža miši po zdravljenju s PBS, MnCl2, MnPC oziroma MnPVA pri 1,3 mg Mn na kg enkrat vsaka 2 dni 16 dni. **p < {{10}}.01 in ***p < 0,001.

Slika 13 Zrele DC (CD80+CD86+, zaprte na CD11c+) in kvantitativne analize tumorskih drenažnih bezgavk (A in B), polarizacija makrofagov (CD206+CD{ {7}} na CD11b+) v tumorskem tkivu 4T1 miši (C–E), določenem s pretočno citometrijo, in analizami ELISA IFN-b (F) in TNF-a (G) v serumu miši po zdravljenju z vsako spojino (1,3 mg Mn na kg) enkrat na 2 dni 16 dni. Podatki so predstavljeni kot povprečje ± SD (n=3). *P < 0.05; **P < 0.01; ***P <0,001.

Po aktivaciji poti cGAS-STING v DC in makrofagih z MnPC in MnPVA bi lahko izločeni IFN-I in proinamatorni citokini spodbudili citotoksične limfocite.59 Zato smo dodatno ovrednotili aktivacijo citotoksičnih celic T (CD8+ ) in T-celice pomočnice (CD4+) v tkivih tumorja oziroma vranice. Kot je prikazano na sliki 14A in S12D–F†, so bile celice CD8+ T (modri kvadrat) v tumorjih učinkovito aktivirane (9,18 %) pri miših, zdravljenih z MnPVA, v primerjavi s tistimi, zdravljenimi s PBS (3,53 %). ), MnCl2 (4,48 %) in MnPC (6,05 %); Rahlo so se aktivirale tudi CD4+ T celice (rdeči kvadrat), rezultati pa so bili nasprotni tistim v vranici po zdravljenju s kompleksi. Slika 14B prikazuje, da so bile frekvence aktiviranih (CD69+ ) celic CD8+ T, ki infiltrirajo tumor, dramatično povečane. Vsi ti rezultati kažejo, da je MnPVA lahko spodbudila močne imunske odzive in vivo zaradi aktivacije poti cGAS-STING.

Slika 14 Celice CD8+ (modri kvadrat) in CD4+ T (rdeč kvadrat) (A) in odstotki podskupine CD69+ med celicami CD8+ T ( B) v tumorskem tkivu 4T1 miši po zdravljenju z vsako spojino (1,3 mg Mn na kg) enkrat na 2 dni 16 dni, določeno s pretočno citometrijo.

Mehanizem delovanja

Predlagano je bilo delovanje za komplekse Mn, kot je prikazano na sliki 15. V tumorskih celicah sta MnPC ali MnPVA poškodovala jedrno in/ali mitohondrijsko DNA, kar je povzročilo povečano regulacijo g-H2AX; medtem pa je kompleks zaviral aktivnost HDAC1/2 in PARP1, s čimer je oslabil sposobnost popravljanja DNK in okrepil poškodbo DNK. Nakopičeni fragmenti DNA so bili sproščeni iz jedra in/ali mitohondrijev v citoplazmo in cGAS jih je prepoznal, da je aktiviral STING. STING je nato spodbudil fosforilacijo TBK1 in IRF3 ter translokacijo v jedro, kar je povzročilo proizvodnjo IFN, IL-6 in TNF-a. Ti IFN in pro-inamatorni citokini so bili nato izločeni iz jedra v citosol in naprej v tumorsko mikrookolje, kjer so spodbujali zorenje in predstavitev antigena DC in makrofagov ter nadalje aktivirali citotoksične T celice za ubijanje rakavih celic. Podobni dogodki so se zgodili tudi v imunskih celicah, kot so makrofagi, in aktivirana je bila pot cGAS-STING-TBK1. Aktivacija poti cGAS-STING je sprožila prirojene imunske odzive in dvosmerno komunikacijo med tumorskimi celicami in sosednjimi imunskimi celicami, da se poveča učinek ubijanja tumorjev.21 Posledično so kompleksi Mn pokazali močno protitumorsko aktivnost zaradi sinergije med kemoterapijo in imunoterapijo . Večina teh procesov je bila dokazana in vitro ali in vivo.

Slika 15 Predlagani mehanizem delovanja za manganove komplekse.

Zaključek

Vse več dokazov kaže, da številni kovinski kompleksi medsebojno delujejo tako s tumorskimi kot z imunskimi celicami, da preoblikujejo imunosupresivna mikrookolja poleg izvajanja neposrednega citotoksičnega učinka na tumorske celice.73 V tej študiji predstavljamo dva kompleksa MnII, MnPC in MnPVA, kot potencialna kemo-imunoterapevtika za zaviranje raka s stimulacijo prirojene imunske odzive kot tudi prekinitev dvojnih verig DNA. Ti večnamenski kompleksi ubijajo rakave celice ne samo s poškodovanjem DNK, ampak tudi s ponovnim aktiviranjem spečih imunskih odzivov. Prvič, delujejo kot razbijalci DNK, povzročajo oksidativno poškodbo DNK in proizvajajo fragmente DNK; drugič, delujejo kot zaviralci HDAC in PARP1, preprečujejo popravilo poškodb DNK in krepijo lezije DNK; tretjič, delujejo kot agonisti poti cGAS-STING, inducirajo izločanje IFN in proinflamatornih citokinov za spodbujanje zorenja DC in makrofagov ter dodatno stimulirajo tumorsko specifične celice T, da ubijejo tumorske celice.

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

Kliknite tukaj za ogled izdelkov Cistanche Enhance Imunity

【Vprašajte za več】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com/Whats App: 0086 18599088692/Wechat: 18599088692

Skratka, MnPC in MnPVA sta učinkovito aktivirala pot cGAS-STING in zadržala rast rakavih celic in vitro in in vivo. Vezava VA na kompleks MnII je dramatično okrepila njegovo inhibicijo na HDAC in okrepila antiproliferativno aktivnost kompleksa, tvorba kompleksov Mn pa zagotavlja pomembno li antiproliferativno aktivnost MnCl2 in 1,10-fenantrolina. Odkar so Jiang et al. prvi poročal o stimulativni aktivnosti Mn2+ na poti cGAS-STING,12 takšna lastnost ni bila odkrita v kompleksih Mn. Ta študija dokazuje, da je stimulativna sposobnost MnPC in MnPVA za pot cGAS-STING veliko večja kot sposobnost MnCl2 ali Mn2+ tako v tumorskih kot v imunskih celicah, ker sta inducirala več fragmentov DNA v citoplazmi za aktiviranje cGAS -STING pot. Ugotovitve kažejo, da bi močnejše agoniste cGAS-STING lahko pridobili s konstruiranjem kompleksov MnII z ligandi, ki poškodujejo DNA ali blokirajo popravilo DNA.

Reference

1 SL Shiao, AP Ganesan, HS Rugo in LM Coussens, Genes Dev., 2011, 25, 2559–2572.

2 A. Ribas in JD Wolchok, Science, 2018, 359, 1350–1355.

3 P. Sharma in JP Allison, Science, 2015, 348, 56–61.

4 M. Yi, D. Jiao, H. Xu, Q. Liu, X. Han in K. Wu, Mol. Rak, 2018, 17, 129.

5 O. Hemminki, JM Dos Santos in A. Hemminki, J. Hematol. Oncol., 2020, 13, 84. 6 S. Yu, A. Li, Q. Liu, T. Li, X. Han in K. Wu, J. Hematol. Oncol., 2017, 10, 78.

7 P. Sharma, S. Hu-Lieskovan, JA Wargo in A. Ribas, Cell, 2017, 168, 707–723.

8 A. Li, M. Yi, S. Qin, Y. Song, Q. Chu in K. Wu, J. Hematol. Oncol., 2019, 12, 35.

9 A. Saeed, X. Ruan, J. Su in S. Ouyang, Adv. Sci., 2020, 7, 1902599.

10 LL van der Woude, MAJ Gorris, CG Figdor in IJM de Vries, Trends Cancer, 2017, 3, 797–808.

11 DS Chen in I. Mellman, Nature, 2017, 541, 321–330.

12 C. Wang, Y. Guan, M. Lv, R. Zhang, Z. Guo, X. Wei, X. Du, J. Yang, T. Li, Y. Wan, X. Su, X. Huang in Z Jiang, Imuniteta, 2018, 48, 675–687.

13 Y. Song, Y. Liu, HY Teo, ZB Hana, Y. Mei, Y. Zhu, YL Chua, M. Lv, Z. Jiang in H. Liu, Cell. Mol. Imunol., 2021, 18, 1571–1574.

14 Q. Chen, L. Sun in ZJ Chen, Nat. Imunol., 2016, 17, 1142–1149.

15 F. McNab, K. Mayer-Barber, A. Sher, A. Wack in A. O'Garra, Nat. Rev. Immunol., 2015, 15, 87–103.

16 H. Liu, H. Zhang, X. Wu, D. Ma, J. Wu, L. Wang, F. Liu, D. Yan, C. Chen, Z. Mao in B. Ge, Nature, 2018, 563 , 131–136.

17 BS Pan, SA Perera, JA Piesvaux, H. Woo, DF Wyss, S. Xu, DJ Bennett in GH Addona, Znanost, 2020, 369, 935.

18 RD Luteijn, SA Zaver, BG Gowen, SK Wyman, NE Garelis, L. Onia, SM McWhirter, GE Katibah, JE Corn, JJ Woodward in DH Raulet, Nature, 2019, 573, 434–438.

19 L. Hou, C. Tian, ​​Y. Yan, L. Zhang, H. Zhang in Z. Zhang, ACS Nano, 2020, 14, 3927–3940.

20 M. Gao, YQ Xie, K. Lei, Y. Zhao, A. Kurum, S. Van Herck, Y. Guo, X. Hu in L. Tang, Adv. Ther., 2021, 4, 2100065.

21 Q. Luo, Z. Duan, X. Li, L. Gu, L. Ren, H. Zhu, X. Tian, ​​R. Chen, H. Zhang, Q. Gong, Z. Gu in K. Luo, Adv. . Funk. Mater., 2021, 32, 2110408.

22 H. Tian, ​​G. Wang, W. Sang, L. Xie, Z. Zhang, W. Li, J. Yan, Y. Tian, ​​J. Li, B. Li in Y. Dai, Nano danes, 2022, 43, 101405.

23 C. Wang, Z. Sun, C. Zhao, Z. Zhang, H. Wang, Y. Liu, Y. Guo, B. Zhang, L. Gu, Y. Yu, Y. Hu in J. Wu, J Nadzorovano sproščanje, 2021, 331, 480–490.

24 H. Haase, Imuniteta, 2018, 48, 616–618.

25 KJ Horning, SW Caito, KG Tipps, AB Bowman in M. Aschner, Annu. Rev. Nutr., 2015, 35, 71–108.

26 X. Sun, Y. Zhang, J. Li, KS Park, K. Han, X. Zhou, Y. Xu, J. Nam, J. Xu, X. Shi, L. Wei, YL Lei in JJ Moon, Nat. Nanotechnol., 2021, 16, 1260–1270.

27 M. Lv, M. Chen, R. Zhang, W. Zhang, C. Wang, Y. Zhang, X. Wei, Y. Guan, YC Liu, Q. Mei, W. Han in Z. Jiang, Cell Res ., 2020, 30, 966–979.

28 SL O'Neal in W. Zheng, Curr. Okolje. Health Rep., 2015, 2, 315–328.

29 E. Li, Nat. Rev. Genet., 2002, 3, 662–673.

30 M. Guo, Y. Peng, A. Gao, C. Du in JG Herman, Biomark. Res., 2019, 7, 23.

31 A. Duenas-Gonzalez, M. Candelaria, C. Perez-Plascencia, E. Perez-Cardenas, E. de la Cruz-Hernandez in LA Herrera, Zdravljenje raka. Rev., 2008, 34, 206–222.

32 HV Diyabalanage, ML Granda in JM Hooker, Cancer Lett., 2013, 329, 1–8.

33 T. Robert, F. Vanoli, I. Chiolo, G. Shubassi, KA Bernstein, OA Botrugno, D. Parazzoli, A. Oldani, S. Minucci in M. Foiani, Nature, 2011, 471, 74–79.

34 JH Lee, ML Choy, L. Ngo, SS Foster in PA Marks, Proc. Natl. Akad. Sci. ZDA, 2010, 107, 14639–14644.

35 KL Jin, JY Park, EJ Noh, KL Hoe, JH Lee, JH Kim in JH Nam, J. Gynecol. Oncol., 2010, 21, 262–268.

36 M. Gottlicher, S. Minucci, P. Zhu, A. Schimpf in S. Giavara, EMBO J., 2001, 20, 6968–6978.

37 JS Brown, B. O'Carrigan, SP Jackson in TA Yap, Cancer Discovery, 2017, 7, 20–37.

38 AN Weaver in ES Yang, spredaj. Oncol., 2013, 3, 290.

39 FJ Bock in P. Chang, FEBS J., 2016, 283, 4017–4031.

40 S. Cerboni, N. Jeremiah, M. Gentili, U. Gehrmann, C. Conrad, S. Amigorena, F. Rieux-Laucat in N. Manel, J. Exp. Med., 2017, 214, 1769–1785.

41 C. Pantelidou, O. Sonzogni, M. De Oliveria Taveira, AK Mehta, AJL Guerriero, GM Wulf in GI Shapiro, Cancer Discovery, 2019, 9, 722–737.

42 J. Shen, W. Zhao, Z. Ju, L. Wang, Y. Peng, M. Labrie, TA Yap, GB Mills in G. Peng, Cancer Res., 2019, 79, 311–319.

43 NA Yusoh, H. Ahmad in MR Gill, ChemMedChem, 2020, 15, 2121–2135.

44 F. Mendes, M. Groessl, AA Nazarov, YO Tsybin, G. Sava, I. Santos, PJ Dyson in A. Casini, J. Med. Chem., 2011, 54, 2196–2206.

45 S. Abbas, F. Rashid, E. Ulker, S. Zaib, K. Ayub, S. Ullah, MA Nadeem, S. Yousuf, R. Ludwig, S. Ali in J. Iqbal, J. Biomol. Struct. Din., 2021, 39, 1068–1081.

46 L. Tabrizi, P. McArdle, M. Ektefan in H. Chiniforoshan, Inorg. Chim. Acta, 2016, 439, 138–144.

47 H. Zhang, T. Yang, Y. Wang, Z. Wang, Z. Zhu, ZJ Guo in XY Wang, Dalton Trans., 2021, 50, 304–310.

48 R. Jastrza˛b, M. Nowak, M. Skroba´nska, A. Toli´nska, M. Zabiszak, M. Gabryel, L. Marciniak in MT Kaczmarek, Coord. Chem. Rev., 2019, 382, ​​145–159.

49 Y. Cheng, L. Lv, L. Zhang, Y. Tang in L. Zhang, J. Mol. Struct., 2021, 1228, 129745. 50 Z. Zhu, Z. Wang, C. Zhang, Y. Wang, H. Zhang, Z. Gan, ZJ Guo in XY Wang, Chem. Sci., 2019, 10, 3089–3095.

51 C. Slator, Z. Molphy, V. McKee in A. Kellett, Redox Biol., 2017, 12, 150–161.

52 TJ Hayman, M. Baro, T. MacNeil, C. Phoomak, TN Aung, T. Sandoval Schaefer, BA Burtness, DL Rimm in JN Contessa, Nat. Občestvo, 2021, 12, 2327.

53 RM Chabanon, M. Rouanne, CJ Lord, JC Soria, P. Pasero in S. Postel-Vinay, Nat. Rev. Rak, 2021, 21, 701–717.

54 AP Wes in GS Shadel, Nat. Rev. Immunol., 2017, 17, 363–375.

55 AP West, W. Khoury-Hanold, M. Staron, MC Tal, CM Pineda, SM Lang, M. Bestwick, BA Duguay, N. Raimundo, DA MacDuff, SM Kaech, JR Smiley, RE Means, A. Iwasaki in GS Shadel, Narava, 2015, 520, 553–557.

56 S. Jin, Y. Hao, Z. Zhu, N. Muhammad, Z. Zhang, K. Wang, Y. Guo, ZJ Guo in XY Wang, Inorg. Chem., 2018, 57, 11135–11145.

57 NJ Curtin in C. Szabo, Nat. Rev. Drug Discovery, 2020, 19, 711–736.

58 J. Chen, FM Ghazawi, W. Bakkar in Q. Li, Mol. Rak, 2006, 5, 71.

59 SM Harding, JL Benci, J. Irianto, DE Discher, AJ Minn in RA Greenberg, Nature, 2017, 548, 466–470.

60 EJ Sayour in DA Mitchell, J. Immunol. Res., 2017, 17, 3145742.

61 BJ Francica, A. Ghasemzadeh, AL Desbien, D. Theodros, KE Sivick, AB Sharabi, ML Leong, SM McWhirter, TW Dubensky Jr, DM Pardoll in CG Drake, Cancer Immunol. Res., 2018, 6, 422–433.

62 C. Vanpouille-Box, S. Demaria, SC Formenti in L. Galluzzi, Cancer Cell, 2018, 34, 361–378.

63 SR Woo, MB Fuertes, L. Corrales, S. Spranger, MJ Furdyna, MY Leung, KA Fitzgerald, ML Alegre in TF Gajewski, Imuniteta, 2014, 41, 830–842.

64 C. Belli, D. Trapani, G. Viale, P. D'Amico, BA Duso, P. Della Vigna, F. Orsi in G. Curigliano, Zdravljenje raka. Rev., 2018, 65, 22–32.

65 BU Schraml, J. van Blijswijk, S. Zelenay, PG Whitney, A. Filby, SE Acton, NC Rogers, N. Moncaut, JJ Carvajal in C. Reis e Sousa, Cell, 2013, 154, 843–858.

66 AA van de Loosdrecht, E. Nennie, GJ Ossenkoppele, RHJ Beelen in MMAC Langenhuijsen, J. Immunol. Metode, 1991, 141, 15–22.

67 S. Zhang, X. Zhong, H. Yuan, Y. Guo, D. Song, F. Qi, Z. Zhu, XY Wang in ZJ Guo, Chem. Sci., 2020, 11, 3829–3835.

68 Y. Li in E. Seto, Cold Spring Harbor Perspect. Med., 2016, 6, a026831.

69 C. Chen, Y. Tong, Y. Zheng, Y. Shi, Z. Chen, J. Li, X. Liu, D. Zhang in H. Yang, Small, 2021, 17, e2006970.

70 A. Mantovani, F. Marchesi, A. Malesci, L. Laghi in P. Allavena, Nat. Rev. Clin. Oncol., 2017, 14, 399–416.

71 B. Ruffell in LM Coussens, Cancer Cell, 2015, 27, 462–472.

72 W. He, N. Kapate, CW t. Shields in S. Mitragotri, Adv. Dostava zdravil Rev., 2020, 17, 251–266.

73 B. Englinger, C. Pirker, P. Heffeter, A. Terenzi, CR Kowol, BK Keppler in W. Berger, Chem. Rev., 2019, 119, 1519–1624.