Številne študije so potrdile, da alergijske bolezni niso le posledica prirojene imunske aktivacije 2

Prosim kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza več informacij

3. Razprava

Patogeneza atopijskega dermatitisa (AD) ni popolnoma razumljena, vendar je bolezen posledica nenormalnega imunskega odziva imunskega globulina E (IgE) pri disfunkciji kožne pregrade. Med njimi lahko mastociti (MC) povzročijo z IgE posredovane alergijske bolezni, vključno z AD. Ko se mastociti aktivirajo, sprostijo svoje na membrano vezane citoplazemske delce, kar povzroči sproščanje različnih molekul. Te molekule igrajo pomembno vlogo pri patogenezi AD in obrambi gostitelja [27]. Ker zaviranje aktivacije ali degranulacije mastocitov pomaga uravnavati različne preobčutljivostne reakcije, ki jih posreduje IgE, so mastociti ena od idealnih tarč za raziskovanje antialergijskih zdravil. V naši študiji so mastociti degranulirani kot odziv na spojino 48/80 in kalcijev ionofor A23187 ter anti-DNP/IgE plus DNP/HSA. Ugotovili smo, da referenca učinkovito zavira učinek degranulacije mastocitov, kar kaže na njegovo protialergijsko reakcijo. Poleg tega je bilo povečanje intracelularnega kalcija in aktivacija MAPK zavrto z referenco. Poleg tega sta se zmanjšala tudi infiltracija kožnih mastocitov, ki jo povzroča DNCB, in praskanje, ki ga povzroča spojina 48/80. Zato ima mehanizem neferinovega protiatopičnega dermatitisa multiplikacijski učinek na keratinocite in mastocite.

La patogenia de la dermatitis atópica (DA) no se comprende por completo, pero la enfermedad está mediada por una respuesta inmunitaria anormal de la inmunoglobulina E (IgE) en la disfunción de la barrera cutánea. Entre ellos, los mastocitos (MC) pueden Causar enfermedades alérgicas mediadas por IgE, incluida la EA. Cuando los mastocitos se activan, liberan sus partículas citoplásmicas unidas a la membrana, lo que lleva a la liberación de una variedad de moléculas. Estas moléculas juegan un papel importante en la patogénesis de la EA y la defensa del huésped [27]. Debido a que la inhibición de la activación o desgranulación de los mastocitos ayuda a regular varias reacciones de hipersensibilidad mediadas por IgE, los mastocitos son uno de los objetivos ideales para explorar fármacos antialérgicos. En nuestro estudio, los mastocitos se desgranulan en respuesta al compuesto 48/80 y al ionóforo de calcio A23187, y anti-DNP/IgE plus DNP/HSA. Encontramos que la referencia inhibió efectivamente el efecto de desgranulación de los mastocitos, mostrando su reacción antialérgica. Además, el aumento de calcio intracelular y la activación de MAPK fueron inhibidos por referencia. Además, también se redujeron la infiltración de mastocitos en la piel causada por DNCB y el comportamiento de rascado causado por el compuesto 48/80. Por lo tanto, el mecanismo de la dermatitis antiatópica de la neferina tiene un efecto multiplicador sobre los queratinocitos y los mastocitos.

Za več informacij kliknite tukaj

Citoplazma mastocitov v tkivih je napolnjena z velikimi, gostimi delci predhodno oblikovanih vnetnih mediatorjev [28]. Proces sproščanja teh mediatorjev iz sekretornih granul v mastocitih se imenuje degranulacija. Ker lahko zaviranje degranulacije mastocitov uravnava različne preobčutljivostne reakcije, ki jih posreduje IgE, so mastociti ena od idealnih tarč za raziskovanje antialergijskih zdravil [29,30]. Naši rezultati kažejo, da referenca zelo dobro vpliva na degranulacijo mastocitov ne glede na uporabo antigena, receptorskega stimulatorja ali ionoforja. To kaže, da je referenca potencialno sredstvo proti alergijam (slika 2).

Vse predhodno shranjene granule, na novo sintetizirani mediatorji in celo granule in njihove komponente se lahko uporabljajo kot indikatorji aktivacije MC [31]. Poleg tega je standardna metoda merjenje znotrajcelične koncentracije Ca4t. Večina sekretagogov MC (npr. antigen, spojina 48/80), ki so bili običajno uporabljeni v laboratoriju, je povzročila povečanje znotrajcelične koncentracije Ca2 plus. Pravzaprav lahko povečanje znotrajcelične koncentracije Ca2 plus sproži tudi degranulacijo MC. Običajno je povečanje znotrajceličnega Ca4t inducirano z aktiviranjem MC s spojinami, kot so tapsigargin (posebej blokira Sarco/endoplazemski Ca2 plus ATPazo, SERCA) črpalke in ionoforji (tj. ionomicin in A23187) [32,33]. Zato se pri od Ca2t odvisni aktivaciji MC meritev dotoka Ca2t šteje tudi za metodo za določanje pogojev aktivacije MC. V raziskavah MC se Fura-2 pogosto uporablja za določanje intracelularnih sprememb Ca2 plus. V naših poskusih smo ugotovili, da je bila intenzivnost fluorescence aktiviranih mastocitov znatno zmanjšana po tem, ko smo jih obdelali z referenčno (slika 3). Prejšnja poročila so pokazala, da je bilo povečanje znotrajcelične koncentracije Ca4t v skladu s sproščanjem histamina [34]. Zato sklepamo, da bo sproščanje histamina zaviralo tudi referenčno zdravljenje. Za potrditev te hipoteze so potrebni nadaljnji poskusi.

Mastociti imajo bistveno drugačne funkcionalne rezultate.cistanche odmerek redditTi vključujejo degranulacijo, tvorbo prekurzorjev arahidonske kisline, kemotakso in proizvodnjo citokinov, vsi pa so do neke mere odvisni od signalov kalcija, ne glede na stimulanse [32] Aktivirani MC sprošča citokine, ki so glavni mediatorji alergij in vnetnih bolezni [32]. 35]. Proizvodnja citokinov z aktiviranimi mastociti je rezultat indukcije transkripcije gena za citokine v teh celicah. Stimulacija mastocitov vodi do aktivacije NF-kB in AP-1 ter proizvodnje številnih citokinov [36]. Kaskadne signalne poti MAPK igrajo bistveno vlogo pri regulaciji izražanja citokinov. Aktivacija teh poti z aktivacijo PKC s PI povzroči aktivacijo različnih genov, vključno z geni vnetnih citokinov, kot so IL-1, IL-6 in TNF [37]. Naše nedavne študije so pokazale, da lahko referenca zavira citokine, ki se sproščajo z aktivacijo keratinocitov. Hkrati smo tudi ugotovili, da bo aktivacija poti MAPK zavirana tudi z referenčnim zdravljenjem [18]. V naši trenutni študiji smo pokazali, da lahko referenca tudi zmanjša izražanje citokinov z inhibicijo aktivacije MAPK v mastocitih (sliki 4 in 5). Aktivacija NFkB je zmanjšana tudi zaradi inhibicije aktivacije MAPK (slika 6).

Cistanche lahko upočasni staranje

Številne študije so poročale, da so številni citokini pri bolnikih z AD povišani, kar vodi do disfunkcije kožne pregrade, vključno s citokini, ki jih izločajo keratinociti, in citokini, pridobljenimi iz Th2- [38,39]. Poleg tega poročajo, da lahko ti izločeni citokini tudi znižajo izražanje proteinov tesnih stikov (T]) in genov za terminalno diferenciacijo, vključno s filagrinom (FLG), lorikrinom (LOR) in involukrinom (IVL) [39,40]. ]Izražanje (pro)filagrina je zmanjšano pri AD in je obratno povezano z MC triptazo in IL-6[41]. IL-1 posreduje pri kroničnem vnetju pri miših z oslabljeno kožno pregrado [35]. V prejšnji študiji so poročali, da je bilo izražanje FLG, IVL in LOR znižano po nanosu DNCB na hrbtno kožo miši NC/Nga [42, 43]. V tej študiji je bilo izražanje FLG, IVL in LOR znatno zmanjšano v hrbtni koži kontrolne skupine, kar je pokazalo, da je epidermalna pregrada oslabljena. Dajanje referenčnega zdravila je znatno obnovilo zmanjšano izražanje FLG, IVL in LOR po zdravljenju z DNCB, medtem ko je referenčno dajanje rahlo povečalo izražanje IVL in LOR v primerjavi s kontrolno skupino (slika 8). Znano je, da je spojina 48/80 učinkovit aktivator kožnih mastocitov. Odziv kože, ki ga spodbudi spojina 48/80, lahko povzroči praskanje s sproščanjem histamina iz mastocitov [44]. Histamin, sproščen iz aktiviranih mastocitov, ima pomembno vlogo pri povečanju žilne prepustnosti, ki jo povzroči spojina 48/80. Med človeškim srbenjem se upošteva tudi histamin, ki se sprošča iz mastocitov z različnimi dražljaji. postal pomemben posrednik. Zato je zaviranje degranulacije mastocitov pomemben korak pri uravnavanju sproščanja histamina med praskanjem. V tej študiji je spojina 48/80 povzročila učinkovito aktivacijo kožnih mastocitov. Vendar pa je predobdelava z referenco znatno zmanjšala stopnjo degranulacije mastocitov (slika 2).koristi izvlečka cistancheTi rezultati kažejo, da je referenčni vedenjski učinek proti praskam lahko posledica zmanjšanja vaskularne prepustnosti z uravnavanjem degranulacije mastocitov (slika 9).

Splošno ugotovljeno je, da bolniki z AD trpijo zaradi disfunkcije kožne bariere, vnetja kože ali obojega, zato je težko najti ustrezne metode zdravljenja. Zato se običajno priporoča kombinirano zdravljenje. Naše nedavne raziskave so dokazale, da nikoli nima imunomodulatorne funkcije in sposobnosti obnavljanja pregrade. Zato je pomembna referenčna značilnost pri zdravljenju AD v prihodnosti vzdrževanje funkcije kože ter izboljšanje navlaženosti kože in popravilo bariere. Referenca lahko tudi zmanjša praskanje, ki ga povzročajo alergeni in dražilne snovi. Poleg tega je atopijski pohod bolezen, povezana s pojavom, ki se pojavlja in napreduje korak za korakom. Atopijski dermatitis se pogosto pojavi pri dojenčkih. Alergija na hrano se pogosto pojavi po 1-2letu starosti. Alergijski rinitis se pogosto lahko pojavi pred in po šoli. Simptomi astme se pojavijo ob različnih časih, vendar jih je večina po alergijskem rinitisu. Po otroštvu se lahko atopijski dermatitis in nekatere alergije na hrano izboljšajo ali izginejo. Alergijskega rinitisa in astme ni lahko pozdraviti [45,46]. Zato so komorbidni pojavi pri boleznih. Naravni izdelki, vključno z referencami, imajo terapevtski potencial komorbidnosti in njihovo učinkovitost pri povezanih boleznih je vredno preučiti v prihodnosti.

4. Materiali in metode

4.1. Bazofilne levkemijske celice podgan

Podganje bazofilne levkemijske celice (RBL-2H3) so bile darilo TLHwang, Univerza Chang Gung, Taoyuan, Tajvan. Celice RBL-2H3 so mastociti sluznice, ki se uporabljajo za preučevanje degranulacije, ki jo povzroči antigen ali kalcijev ionofor, intracelularnega Ca4t in transdukcije signala [29]. Celice smo gojili v EMEM, ki je vseboval 10 odstotkov FBS, s penicilinom in streptomicinom pri 37 stopinjah, 5 odstotkih CO2. Iscove modificirani Dulbeccov medij (IM) in fetalni goveji serum (FBS) sta bila kupljena pri Thermo Fisher Scientific (GIBCOTM, New York, NY, ZDA).

4.2. Test MTT

3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-2H-tetrazolijev bromid (MTT) se uporablja za merjenje presnovna aktivnost celic. Celice RBL-2H3 so bile posejane v 24-ploščico za kulturo z vdolbinicami pri 5 × 10 plus/vdolbinico. Po 24 urah zdravljenja z zdravilom smo dodali 30 µL MTI na vdolbinico in ga postavili v celični inkubator pri 37 stopinjah za 2-4 h, nato smo vijolične kristale formazana raztopili z DMSO. Čitalnik ELISA je bil uporabljen za merjenje intenzivnosti absorbance pri valovni dolžini 550 nm kot test viabilnosti celic.

4.3. Merjenje znotrajcelične ravni Ca2 plus

[Ca2t] Izmerili so me s fura-2, kot je opisano prej [47]. RBL-2H3 celice smo resuspendirali v IMDM, ki je vseboval 5 uM Fura 2-AM in 1,2 mM CaClz pri 37 stopinjah za 30 min. Po nalaganju Fura-2 so keratinocite peletirali in resuspendirali v svežem DMEM. Alikvot (2 ml) smo prenesli v mešano kiveto, ki je vsebovala 1,2 mM CaClz. Fura-2-Ca fluorescenco smo testirali pri vzbujevalnih valovnih dolžinah 340 in 380 nm (valovna dolžina emisije 505 nm) v PerkinElmer LS{{19 }} spektrofluorometer (PerkinElmer Life and Analytical Sciences). Podatki so bili zabeleženi v intervalih po 5 s[47].

4.4. Kvantitativna polimerna verižna reakcija (qPCR)

Celice RBL{{0}}H3 so bile posajene v 3,5 cm posodo za kulturo. Ko so celice zrasle do 90 odstotkov polnosti, so celice gojili v statičnem stanju 24 ur. Potem ko so bile celice predhodno obdelane z referenčno vrednostjo 20 minut, so bile stimulirane s TNF-a/IFN-y 1 oziroma 24 ur. Celice smo postrgali, centrifugirali (16,000×g, 10 min, 4 stopinje) in ekstrahirali supernatant. RNA smo očistili s kompletom za izolacijo celotne RNA (GeneDirex@, Vegas, NV, ZDA). V skladu z delovnim postopkom kompleta za sintezo cDNA (BIO-RAD) so bili dodani reagenti po vrstnem redu in delovali v skladu z navedenimi pogoji za pretvorbo RNA v cDNA. Poleg tega je bila uporabljena mešanica PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix (Applied BiosystemsTM). Dodanih je bilo skupno 7,5 uL ddH20, 2 uL cDNA, 0,25 μL prednjih in povratnih primerjev ter 10 uL SYBR GREEN in enakomerno premešanih. Sekvence primerjev so prikazane v tabelah 1 in 2. Nato smo RNA kvantificirali z uporabo ABI StepOnePlusTM sistema PCR v realnem času.

4.5. Western blot test

Western blot se uporablja za analizo sprememb različnih beljakovin v celicah. Celice RBL{{0}}H3 so bile posejane v 3,5 cm posodo za kulturo. Potem ko so celice zrasle do 90 odstotkov polnosti in bile 24 ur stradane, so bile 20 minut predhodno obdelane z referenčno vrednostjo in nato 30 minut oziroma 1 uro stimulirane s TNF-a ali IFN-y. Po strganju so jih z ultrazvokom zdrobili v prah in centrifugirali (13.200 vrt/min, 10 min, 4 stopinje). Po centrifugiranju smo vzeli supernatant in kvantificirali beljakovine s kompletom za testiranje beljakovin Pierce (Pierce, Rockford, IL, ZDA). Podvrgli smo ga elektroforezi na 10-odstotnem SDS-poliakrilamidnem gelu in nato elektroporirali s PVDF membrano. Po končanem prenosu smo PVDF membrano dali v raztopino TBS-T (tris-puferirana fiziološka raztopina/0,05 odstotka tween 20), ki je vsebovala 5 odstotkov posnetega mleka v prahu, in stresali 1 uro, da bi se izognili nespecifični vezavi. Nato je bil TBS-T uporabljen za pranje 3-krat, vsakokrat 10 minut. Nato smo dodali primarna protitelesa (razredčitev 1:1000) in jih postavili na 4 stopinje čez noč ter jih nato 3-krat sprali s TBS-T vsakih 10 minut. Po 1-urnem dodajanju sekundarnih protiteles (razredčenih 1:1000) smo PVDF membrano 3-krat sprali s TBS-T 10 minut vsakič. Nazadnje je bil dodan razvijalec in membrana je bila postavljena v sistem za kemično luminiscenčno ekstrakcijo (BIOSTEP Celvin") za snemanje.

4.6. Dinitroklorobenzen(2,4-dinitrokloroben2en, DNCB) povzročeno atopičnemu dermatitisu podobno vnetje kože pri miših

Najprej smo miši razdelili v štiri skupine: kontrolno skupino, skupino DNCB (negativna skupina), referenčno (3 mg/kg in 10 mg/kg) z DNCB skupino in deksametazon (0,2 mg/kg) z Skupina DNCB (pozitivna skupina). Deksametazon je kortikosteroidni hormon, ki lahko zmanjša otekline in alergijske reakcije. V tem poskusu in vivo sta bila tako referenčni kot deksametazon raztopljena v DMSO, medtem ko je bil DNCB z ultrazvočnim šokom raztopljen v 75-odstotnem etanolu. Prvo je bilo dano z intraperitonealno injekcijo, za drugo pa je bilo 100 µL naneseno na zadnjo kožo in 20 µL na desno uho. Tri dni pred poskusom so miši anestezirali in jim odstranili zadnje dlake, na zadnji strani mišjih tačk pa vstavili majhen merilni magnet (SCT-MAG-TF).cistanche Genghis KhanPo treh dneh počitka je bilo potrjeno, da so miši v dobrem fizičnem stanju in da je koža na predelu hrbtne depilacije normalna, zato se je poskus začel. Med poskusom so bile posnete fotografije, da bi zabeležili spremembe videza kože. Prva faza ({{0}} dni) je bilo obdobje alergijskega atopičnega dermatitisa. Po merjenju osnovnih vrednosti miši v skupini z DNCB, referenčni (3 in 10 mg/kg) in poskusni skupini z DNCB ter poskusni skupini z deksametazonom 0,2 mg/kg in DNCB je bil 1 odstotek DNCB enakomerno nanesen na kožo hrbta in desno uho. Peti dan smo intraperitonealno injicirali referenčno zdravilo in deksametazon. Druga stopnja (od 5. do 14. dne) je bila ponovna indukcija atopičnega dermatitisa.cistanche podaljšanje življenjske dobeV 3 poskusnih skupinah je bilo0.5 odstotkov DNCB enakomerno razmazano po zadnji koži in desnem ušesu miši. Naslednji dan so bile posnete in zabeležene fiziološke vrednosti kože in slike. Ko so miši 15. dan evtanazirali s prekomerno količino ogljikovega dioksida (CO2), so hrbtno tkivo kože odstranili za nadaljnjo eksperimentalno analizo.

4.7. Spojina 48/80-inducirano praskanje pri miših BALB/c

Dlako kože na zadnji strani miške smo odrezali in intrakutano injicirali 20 μL raztopine spojine 48/80. Kontrolne miši so namesto tega prejele injekcije fiziološke raztopine. Takoj po injiciranju je bila žival postavljena v opazovalno kletko (premer 11 cm, MicroAct, Neuroscience, Tokio, Japonska) in samodejno in objektivno zaznano in ovrednoteno praskanje miši. Obnašanje pri praskanju je bilo izmerjeno 60 min. MicroAct uporablja naslednje parametre analize za zaznavanje valov, ki ustrezajo neprekinjenemu praskanju miši: prag 0,05 V; vrzel med dogodki, 0,05 s; najmanjše trajanje, 0,25 s; največja frekvenca,30 Hz; najmanjša frekvenca, 5Hz. 4.8. Statistična analiza

Za statistično analizo je bila uporabljena programska oprema Sigma-Plot (različica 10.0).cistanche nzPodatki so izraženi kot povprečje ± SEM, z (*) in (#) kot opombami. Statistična pomembnost podatkov je bila analizirana z neparnimi, dvostranskimi Studentovimi t-testi. Vrednosti p, manjše od 0.05 in 0,01, so veljale za pomembne.

5. Sklepi

V tej študiji smo ugotovili, da referenca učinkovito zavira degranulacijo mastocitov in zmanjša izražanje vnetnih citokinov, kar lahko zmanjša simptome, podobne atopijskemu dermatitisu, obnovi kožno pregrado in zmanjša praskanje kože. Nadalje smo dokazali, da referenca ne more delovati samo na keratinocite kože, ampak vpliva tudi na aktivacijo mastocitov. Ima več možnosti za uporabo pri alergijskih in vnetnih kožnih boleznih.

Ta članek je izvleček iz Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 10994. https://doi.org/10.3390/ijms222010994 https://www.mdpi.com/journal/ijms